Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 2, стр. 195-207

ВВЕДЕНИЕ

Создание препаратов на основе малых интерферирующих РНК (siРНК) является перспективным подходом к лечению заболеваний, связанных с нарушением экспрессии определенных генов, которые не поддаются лечению стандартными методами. Однако доставка siРНК в клетки-мишени in vitro и особенно in vivo остается в настоящее время сложной и актуальной задачей, решение которой необходимо для внедрения результатов биомедицинских исследований в клиническую практику [1]. Введение остатков молекул природного происхождения в состав siРНК путем их прямого конъюгирования с siРНК на сегодняшний день является наиболее перспективной технологией доставки, поскольку, в отличие от других подходов (вирусные векторы, доставка с помощью катионных липидов и полимеров), преимуществами использования биоконъюгатов являются специфичность и эффективность их проникновения в клетки-мишени при отсутствии токсических эффектов [2–5]. Гемопоэтические клетки считаются наиболее сложными для доставки в них siРНК, при этом разработка систем доставки siРНК в данные клетки крайне необходима для совершенствования методов антиретровирусной терапии и повышения эффективности лечения опухолевых заболеваний крови [6, 7]. Поэтому оценка возможности использования биоконъюгатов для доставки siРНК в гемопоэтические клетки является актуальной.

В данной работе было исследовано взаимодействие липофильных производных siРНК с клетками крови in vitro и in vivo и показано, что из всех исследованных липофильных молекул именно присоединение холестерина к siРНК способствует наиболее эффективному накоплению siРНК в клетках крови. Поскольку ранее мы показали, что длина линкера в составе холестеринового конъюгата siРНК является фактором, определяющим эффективность взаимодействия конъюгатов с культивируемыми линиями клеток [8–10], мы исследовали влияние длины линкера на накопление холестериновых конъюгатов siРНК в клетках крови и показали, что холестериновый конъюгат с оптимизированной длиной линкера эффективно накапливается в клетках крови in vitro и in vivo.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Природа липофильной молекулы определяет эффективность накопления конъюгатов siРНК в гемопоэтических клетках человека. Ранее нами был разработан алгоритм селективной модификации siРНК, который включает в себя защиту нуклеазочувствительных сайтов (UpG, UpA и CpA) путем введения 2'-O-метильных аналогов рибонуклеотидов с 3'-стороны от легко расщепляемой связи [11]. Было показано, что siРНК, направленная на мРНК гена MDR1 и содержащая 2'-O-метильные звенья в нуклеазочувствительных сайтах, способна эффективно ингибировать экспрессию данного гена в клетках человека КВ-8-5 при трансфекции с помощью Липофектамина [12–14]. Для исследования влияния природы липофильной молекулы на эффективность накопления таких siРНК в гемопоэтических клетках человека siРНК конъюгировали с холестерином, α-токоферолом, литохолевой кислотой и олеиламидом литохолевой кислоты. Липофильные производные были присоединены к 5'-концу олигорибонуклеотида через олигометиленовые линкеры различной длины с использованием удобного твердофазного подхода, предложенного нами ранее [8] (рис. 1). Alexa Fluor-488- (A) или флуоресцеин-меченые (F) конъюгаты siРНК, содержащие липофильную молекулу, добавляли к выделенным первичным мононуклеарным клеткам крови (PBMC) человека (1–5 мкМ) и оценивали эффективность накопления конъюгатов методом проточной цитофлуорометрии.

Рис. 1.

(а) – Структура липофильных производных siРНК, где U и C – 2'-O-метильные аналоги U и C соответственно; R – остатки липофильных молекул, введенные с 5'-конца смысловой цепи; n (3, 6, 8, 10 или 12) – число метиленовых звеньев в алифатическом линкере, связывающем siРНК и липофильную молекулу; X – флуоресцеин (F) или Alexa Fluor-488; структуры остатков литохолевой кислоты (Lt) (б), олеиламида литохолевой кислоты (OlLt) (в), α-токоферола (Toco) (г) и холестерина (Ch) (д).

Трансфекцию неконъюгированной siРНК проводили при помощи Липофектамина в концентрации 0.2 мкМ для того, чтобы сохранить рекомендуемое производителем соотношение количества Липофектамина и siРНК с целью эффективного образования комплексов, поскольку более высокая концентрация Липофектамина была бы токсична для клеток. Время инкубации siРНК с клетками (4 ч) было выбрано исходя из ранее полученных нами данных [8, 15]. Показано, что доля клеток, трансфицированных липофильными конъюгатами siРНК в концентрации 2 и 5 мкМ, была выше как по сравнению с неконъюгированной siРНК в свободном виде, так и с siРНК, доставляемой при помощи Липофектамина (рис. 2а). При концентрации 1 мкМ наибольшая эффективность трансфекции была достигнута при использовании конъюгата siРНК и холестерина (58%) (рис. 2а), для остальных типов исследованных конъюгатов доля трансфицированных клеток варьировала от 5 до 7.5%. При этом эффективность накопления липофильных производных siРНК в клетках РBMC, выраженная в относительных единицах флуоресценции (RFU), увеличивалась в зависимости от типа липофильной молекулы в ряду: литохолевая кислота < олеиламид литохолевой кислоты < токоферол < холестерин и при концентрации конъюгатов 5 мкМ составляла, соответственно, 10, 13, 18 и 24 RFU (рис. 2б).

Рис. 2.

Накопление флуоресцентно-меченых аналогов липофильных производных siРНК с линкером из трех метиленовых звеньев в PBMC (а, б) и клетках цельной крови человека (в, г). Приведены доля трансфицированных клеток (а, в) и средние значения флуоресценции популяции клеток (б, г). Представлены средние значения (± SD), рассчитанные по результатам трех независимых экспериментов, и статистическая значимость (p).

Для того чтобы оценить влияние сыворотки и электролитов плазмы на накопление липофильных конъюгатов в клетках крови, проводили их инкубацию с цельной кровью человека в присутствии антикоагулянта. Показано, что эффективность накопления конъюгатов зависит от типа липофильной молекулы и также увеличивается в ряду: литохолевая кислота < олеиламид литохолевой кислоты < токоферол < холестерин, доля трасфицированных клеток при концентрации конъюгатов 5 мкМ составила 21, 27, 38 и 74% соответственно (рис. 2в). Оценка уровня средней интенсивности флуоресценции трансфицированных клеток показала, что данное значение для неконъюгированной siРНК, доставляемой при помощи Липофектамина, было выше, чем у клеток, инкубированных с конъюгатами (рис. 2г). Из полученных нами данных видно, что взаимодействие с клетками в составе цельной крови происходит менее эффективно, чем с теми же клетками, находящимися в культуральной среде, поэтому подбор оптимальных средств доставки для этого типа клеток-мишеней особенно важен.

Длина линкера в составе холестериновых производных siРНК влияет на их накопление в гемопоэтических клетках. Ранее нами было установлено, что структура линкера в составе холестериновых производных siРНК, в частности его длина, влияет на эффективность накопления конъюгатов в культивируемых клетках и, как следствие, определяет биологическую активность siРНК [8, 9]. Поэтому мы исследовали влияние данного фактора на эффективность накопления конъюгатов в PBMC и клетках цельной крови человека. Для этого конъюгаты добавляли к клеткам до конечной концентрации 0.2–2.0 мкМ. В ходе работы нами показано, что все исследованные холестериновые конъюгаты эффективно накапливались в клетках: уже при концентрации 1 мкМ эффективность трансфекции достигала 100% (рис. 3а). При анализе среднего уровня интенсивности флуоресценции показано, что при удлинении линкера между siРНК и холестерином наблюдается плавное увеличение накопления холестериновых конъюгатов: эффективность накопления составляла 24, 35, 36 и 41 RFU для конъюгатов с линкером из 3, 6, 10 и 12 метиленовых звеньев соответственно. Однако статистически достоверными являются только отличия в эффективности накопления между конъюгатами, содержащими 3 и 12 метиленовых звеньев (р < 0.01 при сравнении Ch3-siRNA-F с Ch12-siRNA-F, рис. 3б).

Рис. 3.

Накопление флуоресцентно-меченых холестериновых производных siРНК, содержащих линкеры различной длины (3–12 метиленовых звеньев), в PBMC. Исследования проводили при помощи проточной цитофлуорометрии, в каждом образце анализировали 10 000 клеток. Приведены средние значения (± SD), рассчитанные по результатам трех независимых экспериментов, и статистическая значимость (p).

Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными в нашей лаборатории ранее [8–10]. Липофильная природа холестерина позволяет предположить, что механизм проникновения холестериновых производных siРНК в клетки на первом этапе включает “заякоривание” конъюгатов в мембране [16], поэтому увеличение длины линкера может облегчать этот процесс за счет увеличения расстояния между отрицательно заряженной siРНК и остатком холестерина.

Для того чтобы оценить влияние сыворотки и электролитов плазмы на накопление холестериновых производных siРНК в клетках крови, проводили инкубацию конъюгатов с цельной кровью человека. Показано, что доля трансфицированных клеток после их инкубации в течение 4 ч с 5 мкМ холестерин-содержащими siРНК составила 70–80%, что превышает это значение для неконъюгированной siРНК (62%), а также превышает долю клеток, трансфицированных неконъюгированной siРНК при помощи Липофектамина (44%) (рис. 4а). Анализ средней интенсивности флуоресценции клеток показал, что накопление холестериновых конъюгатов зависит от длины линкера, соединяющего холестерин с siРНК (рис. 4б). При этом конъюгат с линкером из 8 метиленовых звеньев показал наиболее эффективное накопление в клетках крови, значение RFU составило 4.95, что превышает значение RFU для других исследованных производных siРНК (2.44–4.21 RFU). Неконъюгированная siРНК накапливалась с наименьшей эффективностью (1.86 RFU, это значение только в 5 раз выше уровня автофлуоресценции контрольных клеток).

Рис. 4.

Накопление Alexa Fluor-488-меченых холестериновых производных siРНК, содержащих линкеры различной длины (3–12 метиленовых звеньев), в клетках в составе цельной крови здорового донора. Приведены доля трансфицированных клеток (а, в, д, ж) и средняя интенсивность флуоресценции (RFU) (б, г, е, з) после инкубации цельной крови донора с соответствующими siРНК: всех клеток после лизиса эритроцитов (а, б), моноцитов и макрофагов (в, г), нейтрофилов (д, е) и лимфоцитов (ж, з). Исследования проводили при помощи проточной цитофлуорометрии, в каждом образце анализировали 10 000 клеток. Средние значения (± SD) рассчитаны по результатам трех независимых экспериментов.

Поскольку количество siРНК, доставленной в клетки при помощи Липофектамина, оцениваемое по средней интенсивности флуоресценции клеток, сопоставимо с количеством Ch8-siRNA-A, доставленной в клетки без помощи носителя (5.5 и 4.95 RFU соответственно), а доля трансфицированных клеток в случае Ch8-siRNA-A превышает таковое значение для siРНК, доставляемой Липофектамином (77 и 44% соответственно), возник вопрос о том, в каких типах клеток крови происходит наиболее эффективное накопление siРНК при доставке в составе конъюгата с холестерином или при помощи Липофектамина. Для разделения лейкоцитов крови на индивидуальные популяции клеток (лимфоциты, нейтрофилы, моноциты и макрофаги) использовали соответствующие антитела с флуоресцентными метками. Данные показали, что накопление siРНК для обоих способов доставки (Липофектамин или конъюгация с холестерином) уменьшается в ряду: моноциты и макрофаги > нейтрофилы > лимфоциты (рис. 4). Наиболее эффективное накопление во всех популяциях наблюдается при использовании холестериновых конъюгатов siРНК, при этом в нейтрофилах, моноцитах и макрофагах эффективнее всего накапливается Ch8-siRNA-A (рис. 4в–е), а в лимфоцитах – Ch6-siRNA-A (рис. 4ж, 4з). Наименьшая эффективность накопления siРНК во всех популяциях клеток наблюдается при использовании Липофектамина. Однако следует отметить, что siРНК, доставляемая при помощи Липофектамина, была использована в концентрации 0.2 мкМ из-за ограничений, накладываемых токсичностью трансфекционного агента. Доля трансфицированных клеток во всех популяциях после инкубации с неконъюгированной siРНК в свободном виде (5 мкМ) была выше, чем при ее доставке Липофектамином (0.2 мкМ) (рис. 4в, 4д, 4ж).

Таким образом, оптимальным способом доставки siРНК в моноциты, макрофаги и нейтрофилы является конъюгирование siРНК с холестерином при использовании линкера, содержащего 8 метиленовых звеньев, а для доставки в лимфоциты – линкера с 6 метиленовыми звеньями. Вероятно, в условиях цельной крови из-за наличия компонентов сыворотки конъюгаты с более длинными линкерами (10 и 12 метиленовых звеньев) за счет большей гидрофобности эффективнее взаимодействовали с компонентами сыворотки, а не с клетками крови. Нельзя исключить, что комплексы siРНК с Липофектамином, которые имеют положительный заряд и размеры 150–200 нм, могут захватываться клетками, обладающими фагоцитарной активностью, такими как нейтрофилы, моноциты и макрофаги, что обеспечивает их эффективное накопление именно в этих клетках (рис. 4в–е).

Присоединение холестерина к siРНК значительно изменяет динамику концентрации siРНК в крови мышей после внутривенного введения. Определение динамики изменения концентрации siРНК и ее холестеринового производного в крови здоровых животных проводили на мышах линии C57BL/6. Показано, что уже в первой экспериментальной точке – через 5 мин после введения – концентрация препаратов в крови животных значительно отличается: концентрация холестерин-содержащего конъюгата Ch6-siRNA на 3 порядка превышает концентрацию неконъюгированной siРНК. В течение первого часа после введения концентрация Ch6-siRNA падает примерно в 10 раз по сравнению с первой экспериментальной точкой (рис. 5) и примерно на 3 порядка уменьшается через 24 ч после введения. Следует отметить, что siРНК без холестерина значительно быстрее выводится из крови и циркулирует в ней в значительно меньших концентрациях, чем ее холестерин-содержащий аналог, хотя после 1 часа динамика изменения концентрации сильно замедляется, и далее концентрация препарата в крови снижается медленно. Такая динамика, вероятнее всего, является следствием того, что через 3 ч после инъекции концентрация siРНК подходит к порогу чувствительности метода Stem-loop ПЦР, поскольку нет оснований полагать, что siРНК несколько часов находится в плазме крови без изменения концентрации (рис. 5). Нельзя исключить и того, что равновесие между свободной и связанной с клетками siРНК вносит вклад в сохранение ее ненулевого уровня в плазме крови через 24 ч.

Рис. 5.

Динамика изменения концентрации siРНК и ее конъюгата с холестерином, содержащего линкер из шести метиленовых звеньев (Ch6-siRNA), в плазме крови мышей C57BL/6 после внутривенной инъекции (0.5 мкг/г).

Значительная разница в скорости выведения препарата в первые минуты после введения, скорее всего, связана с тем, что молекулярный вес siРНК ниже критического лимита фильтрации соединений почками, и она быстро выводится из кровотока. В то же время было показано [17], что конъюгат асимметричной siРНК, содержащий чередующиеся 2'-O-Me- и 2'-F-модификации, фосфотиоатные звенья (PS) по концам дуплекса и холестерин с 3'-конца смысловой цепи, образуют в крови комплексы с липопротеинами, при этом молекулярная масса таких комплексов позволяет находящейся в них siРНК избежать выведения путем фильтрации. Можно предположить, что и в случае исследованного нами конъюгата увеличение времени его циркуляции в кровотоке происходит по сходному механизму.

Холестериновые производные siРНК накапливаются в клетках крови и в спленоцитах in vivo. Исследование накопления Alexa Fluor-488-меченых Ch6-siRNA-A и siRNA-A в клетках крови проводили на мышах линии C57BL/6 после внутривенной инъекции 1.7 или 9 мкг/г siРНК или ее холестеринового конъюгата. Через 30 мин, 1 и 4 ч после инъекции у мышей отбирали кровь из ретроорбитального синуса, индивидуальные популяции клеток окрашивали соответствующими антителами с флуоресцентными метками и лизировали эритроциты; эффективность накопления оценивали методом проточной цитофлуорометрии.

Показано, что присоединение холестерина к siРНК существенно увеличивает ее способность связываться с клетками крови (рис. 6а–з), при этом эффективность трансфекции моноцитов/макрофагов и нейтрофилов достигает 80–90% (рис. 6в, 6д). Уже через 30 мин после введения Ch6-siRNA-A клетки показывают значительный уровень флуоресценции, однако кинетика накопления для разных типов клеток отличается: максимальное накопление в нейтрофилах было зафиксировано через 30 мин после введения (94%, 1.4 RFU) и затем, через 4 ч, эффективность накопления и количество трансфицированных клеток постепенно снижались (75%, 0.9 RFU, рис. 6в, 6г). Уровень накопления Ch6-siRNA-A в моноцитах и макрофагах, напротив, увеличивался со временем: c 75 до 86% и с 1.6 до 3.2 RFU в период от 30 мин до 4 ч соответственно (рис. 6д, 6е). Интенсивность флуоресценции Ch6-siRNA-A в лимфоцитах была всего в 2 раза выше, чем в контрольных клетках (0.5 RFU, рис. 6ж, 6з). siРНК без холестерина накапливалась в незначительном количестве только в моноцитах и макрофагах (25%, 0.5 RFU, рис. 6в, 6г).

Рис. 6.

Накопление флуоресцентно-меченой siРНК и ее конъюгата с холестерином в клетках крови мыши после внутривенного введения. Приведены доля Alexa Fluor-488-позитивных клеток (%) (а, в, д, ж) и интенсивность флуоресценции популяции клеток в RFU (б, г, е, з): в суммарной фракции лейкоцитов (а, б), моноцитов и макрофагов (в, г), нейтрофилах (д, е), лимфоцитах (ж, з) через 30 мин, 1 и 4 ч после внутривенной инъекции 1.7 или 9 мкг/г siRNA и Ch6-siRNA-А. Средние значения (± SD) рассчитаны по результатам трех независимых экспериментов, в качестве контроля использована автофлуоресценция необработанных клеток.

Учитывая общее количество крови мыши, доза 9 мкг/г Ch6-siRNA-A примерно соответствует концентрации 8.5 мкМ. При этом эффективность накопления в Ch6-siRNA-A в цельной крови человека при концентрации 5 мкМ в 4 раза больше (рис. 4), чем эффективность накопления Ch6-siRNA-A в клетках крови мыши при дозе 9 мкг/г (4.2 и 1.1 RFU соответственно). Различная эффективность накопления Ch6-siRNA-A в клетках крови человека в пробирке и клетках крови мышей in vivo может объясняться меньшими размерами клеток крови мыши по сравнению с клетками крови человека, а также тем фактом, что in vivo Ch6-siRNA-A выводится из кровотока мыши путем фильтрации почками, элиминируется фагоцитарной системой животного (нейтрофилы, макрофаги и моноциты) или депонируется в различных органах и тканях (печень, селезенка и др.). В то же время в экспериментах на цельной крови человека концентрация конъюгата в процессе инкубации остается постоянной, что приводит к более высокой эффективности его накопления в клетках. Этот факт подчеркивает важность стабилизации препарата в кровотоке и обеспечения его достаточно высокой концентрации в течение длительного времени для эффективного накопления в клетках.

Моноциты и макрофаги обладают фагоцитарной активностью, за счет которой в них происходит постепенное накопление холестерин-содержащей siРНК, возможно, в составе комплексов с липопротеинами (рис. 6д, 6е). Снижение эффективности накопления Ch6-siRNA-A в нейтрофилах происходит, вероятно, из-за их миграции из кровотока в органы и ткани животного [18] и постепенного снижения концентрации Ch6-siRNA в крови (рис. 5).

Изучение накопления холестерин-содержащей siРНК в костном мозге и спленоцитах мыши проводили через 6 ч после внутривенной инъекции методом проточной цитофлуорометрии. Показано, что присоединение холестерина существенно не улучшает эффективность проникновения siРНК в клетки костного мозга (рис. 7а, 7б), однако способствует увеличению накопления Ch6-siRNA-A в спленоцитах мыши по сравнению с siRNA-A, при этом эффективность трансфекции составляет 70 и 2%, а интенсивность флуоресценции – 1.65 и 0.45 RFU для Ch6-siRNA-A и siRNA-A соответственно (рис. 7в, 7г). Следует отметить, что увеличение накопления Ch6-siRNA-A в селезенке может быть следствием не только способности Ch6-siRNA-A накапливаться в спленоцитах, но и результатом присутствия клеток крови в селезенке (нейтрофилов, моноцитов и макрофагов).

Рис. 7.

Накопление флуоресцентно-меченой siРНК и ее конъюгата с холестерином в клетках костного мозга (а, б) и спленоцитах (в, г) мыши через 6 ч после внутривенной инъекции (9 мкг/г). Приведены доля Аlexa Fluor-488-позитивных клеток (%) (а, в) и интенсивность флуоресценции популяции клеток в RFU (б, г). Средние значения (± SD) рассчитаны по результатам трех независимых экспериментов, в качестве контроля использована автофлуоресценция необработанных клеток.

Применение препаратов на основе siРНК при гемобластозах является особенно актуальной проблемой из-за невозможности хирургического удаления данного вида опухоли. Для доставки siРНК в гемопоэтические клетки в экспериментальных условиях в основном используют катионные липиды и полимеры, которые не обеспечивают достаточную эффективность in vivo и зачастую проявляют токсическое действие [6].

Способность холестерина [19], α-токоферола [20], аптамеров [21], антител [22] и пептидов, способных проникать в клетку [23, 24], изменять биодоступность и биораспределение siРНК была продемонстрирована в ряде работ; тем не менее эффективность биологического действия конъюгатов разного строения в разных типах клеток существенно различается, поэтому оптимизация состава и структуры этих конъюгатов является одной из наиболее актуальных задач при конструировании ингибиторов на основе siРНК. К настоящему времени довольно подробно исследовано взаимодействие siРНК и их модифицированных аналогов с культивируемыми клеточными линиями различного происхождения, имеются данные о накоплении siРНК в органах и тканях животных при внутривенном введении свободной нуклеиновой кислоты или ее комплексов с различными носителями (см., например, обзор Khatri et al. [25]), однако взаимодействию siРНК и других терапевтических нуклеиновых кислот с клетками крови до сих пор не уделялось должного внимания. В качестве альтернативого способа доставки группой исследователей Nechaev et al. было предложено конъюгировать субстрат Дайсера (DsiРНК) с CpG-содержащим олигодезоксирибонуклеотидом, обеспечивающим выход DsiРНК из эндосом в цитоплазму клетки [26]. Конъюгирование с CpG-содержащими олигодезоксирибонуклеотидами приводит к повышению накопления DsiРНК в клетках, экспрессирующих рецептор TLR9, который специфически распознает и связывает данный CpG-мотив, при этом в других типах клеток наблюдается лишь небольшое неспецифическое накопление такого конъюгата [26]. Таким образом, из-за повышенной экспрессии рецептора TLR9 конъюгат DsiРНК и CpG эффективно накапливается в таких клетках крови, как B-лимфоциты, дендритные клетки и макрофаги [27]. Однако, в отличие от холестерин-содержащей siРНК, введение CpG-олигонуклеотидов in vivo приводит к активации систем врожденного иммунитета и продукции цитокинов и интерферонов, поэтому их применение ограничено.

Ранее мы показали, что Ch6-siRNA способна эффективно подавлять экспрессию гена-мишени и восстанавливать чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам [8], однако механизм накопления Ch6-siRNA в гемопоэтических клетках значительно отличается от накопления в клетках карциномы [15], поэтому, несмотря на то что Ch6-siRNA эффективно накапливается в клетках крови, она не обеспечивает терапевтически значимого биологического действия при исследуемых концентрациях, поэтому дальнейшие разработки, направленные на увеличение эффективности накопления и биологической активности Ch6-siRNA в клетках крови, являются важным направлением исследований.

Таким образом, в данной работе показано, что природа липофильной молекулы и длина линкера в составе липофильных производных siРНК определяют эффективность накопления конъюгатов siРНК в гемопоэтических клетках человека. Наиболее эффективным способом доставки siРНК в моноциты, макрофаги и нейтрофилы является ее доставка в виде конъюгата с холестерином, присоединенного к 5'-концу смысловой цепи при помощи линкера из 8 метиленовых звеньев; для доставки siРНК в лимфоциты оптимальным является аналогичный конъюгат с линкером из 6 метиленовых звеньев. Следует отметить, что присоединение холестерина к siРНК значительно изменяет динамику концентрации siРНК в крови мышей после внутривенного введения, увеличивая время ее циркуляции и замедляя выведение, что является важным для обеспечения эффективного накопления siРНК в клетках и тканях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение siРНК и конъюгатов. Смысловые и антисмысловые цепи siРНК были синтезированы фосфитамидным методом на автоматическом синтезаторе ASM-800 (Биоссет, Россия). Для синтеза антисмысловых цепей siРНК, содержащих 3'-аминогексильный линкер (аминолинкер С6), использовали 3'-PT-amino-modifier C6 CPG (GlenResearch, США). Введение липофильных остатков на 5'-конец проводили Н-фосфонатным методом, используя полимер-связанный олигонуклеотид и Н-фосфонаты липофильных соединений [8]. Выделение и характеризацию продуктов проводили с использованием ПААГ-электрофореза и масс-спектрометрии (LC-ESI-MS и MALDI-TOF-MS).

Присоединение флуоресцеина на 3'-конец антисмысловой цепи проводили в реакционной смеси объемом 150 мкл по аналогии с работой Proudnikov et al. [28]. К 30 мкл 0.9 мМ водного раствора антисмысловой цепи siРНК с аминолинкером C6 на 3'-конце добавляли 7.5 мкл триэтиламина, 97.5 мкл свежеперегнанного ДМСО и 15 мкл свежеприготовленного 0.3 М FITC I (Sigma-Aldrich, США) в ДМСО, после чего смесь инкубировали при комнатной температуре 1 ч при непрерывном перемешивании. По окончании реакции продукт осаждали добавлением к реакционной смеси 1/10 объема NaOAc (3 М), 4 объемов этанола (96%) и инкубировали при –20°С в течение ночи.

Конъюгирование с Alexa Fluor-488 проводили в реакционной смеси объемом 250 мкл. К 45 мкл водного раствора антисмысловой цепи siРНК с аминолинкером C6 на 3'-конце в концентрации 0.5 мМ добавляли 165 мкл тетрабората натрия (рН 8.5) и 40 мкл свежеприготовленного 10 мМ сульфодихлорфенилового эфира Alexa Fluor-488 (Sigma-Aldrich, США) в ДМСО, после чего смесь инкубировали при комнатной температуре 3 ч при непрерывном перемешивании. По окончании реакции продукт осаждали добавлением 1/10 объема 3 М NaOAc, 4 объемов этанола (96%) и инкубировали при –20°С в течение ночи.

Дуплексы siРНК получали эквимолярным добавлением цепей siРНК (200 мкМ) в раствор, содержавший 30 мМ HEPES-KOH (pH 7.4), 100 мМ ацетат натрия и 2 мМ ацетат магния, и хранили при –20°С.

Выделение моноцитарно-лимфоцитарной фракции из периферической крови человека (PBMC). Периферическую кровь здорового донора с антикоагулянтом разбавляли стерильным PBS (MP Biomedicals, США) в 4 раза. Разведенную кровь (5 мл) наслаивали на 2 мл среды для разделения лейкоцитов LSM (MP Biomedicals, США) с плотностью 1.077–1.080 г/мл и центрифугировали в течение 15 мин при 800 g. Белое кольцо лейкоцитов собирали пипеткой и переносили в чистую пробирку. Лейкоциты промывали 2 раза, для этого добавляли 5 мл среды IMDM (Sigma-Aldrich, США) без сыворотки и антибиотиков, ресуспендировали, центрифугировали 10 мин при 800 g, отбирали супернатант и повторяли процедуру. Клетки высевали на чашки Петри и культивировали в среде IMDM с 10% FBS (HyClone, США), пенициллином (10 ед./мл), стрептомицином (100 мкг/мкл) и амфотерицином (0.25 мкг/мкл) (5% СО₂, 37°С).

Образцы периферической крови здоровых доноров (n = 3) были предоставлены лабораторией генной диагностики Центра новых медицинских технологий (Новосибирск, Россия).

Определение эффективности накопления холестериновых производных siРНК в PBMC с помощью проточной цитофлуорометрии. PBMC высевали на 48-луночные планшеты (3 × 10⁵ клеток/лунку) в ростовой среде IMDM и добавляли к ним холестериновые производные siРНК в Opti-Mem (Invitrogen, США) до конечной концентрации в лунке 0.2–5.0 мкМ, трансфекцию siРНК при помощи Липофектамина (Invitrogen, США) проводили в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Через 4 ч готовили препараты для анализа методом проточной цитофлуорометрии.

Для приготовления препаратов удаляли ростовую среду и дважды промывали клетки раствором PBS, после чего клетки снимали трипсином и переносили в 1.5-мл пробирки. После этого клетки осаждали центрифугированием при 200 g в течение 5 мин, удаляли супернатант и суспендировали осадок в PBS. Суспензию клеток вновь центрифугировали в течение 5 мин при 200 g, супернатант удаляли, суспендировали клетки в 250 мкл PBS и фиксировали клетки добавлением 250 мкл свежеприготовленного 4%-ного раствора формальдегида в PBS. Полученные данные анализировали на проточном цитофлуориметре, используя программное обеспечение Cytomics FC 500 CXP (Beckman Coulter, США). Интенсивность флуоресценции клеток в RFU (относительные единицы флуоресценции) измеряли на длине волны возбуждения лазера 488 нм. Для каждого препарата проводили измерение 8000 клеток, количество Alexa Fluor-488-положительных клеток оценивали с использованием длинноволнового оптического фильтра (530 ± 30) нм. За эффективность трансфекции принимали количество клеток (%), уровень флуоресценции которых превышал максимальный уровень автофлуоресценции клеток в контроле. Кроме того, оценивали средний уровень флуоресценции (в RFU) популяции клеток в образцах, трансфицированных siРНК, в качестве контроля использовали необработанные клетки.

Определение эффективности накопления холестериновых производных siРНК в клетках крови с помощью проточной цитофлуорометрии ex vivo. К периферической крови человека с антикоагулянтом добавляли флуоресцентно-меченые конъюгаты siРНК до конечной концентрации в лунке 2–5 мкМ. Трансфекцию неконъюгированной siРНК проводили при помощи Липофектамина в концентрации 0.2 мкМ в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Через 3.5 ч после начала трансфекции к клеткам добавляли конъюгаты антител и флуоресцентных красителей для идентификации различных популяций клеток (CD14-Phycoerythrin (Invitrogen, США), CD66-Phycoerythrin/ Cy5, CD3-Phycoerythrin и CD19-Phycoerythrin (Abcam, США)). По истечении времени трансфекции (4 ч) эритроциты лизировали добавлением 40 объемов свежеприготовленного раствора 150 мМ NH₄Cl, 10 мМ NaHCO₃, 0.1 мM ЭДТА (рН 7.5) в течение 7 мин, затем клетки центрифугировали (5 мин, 200 g), отмывали PBS и фиксировали 2%-ным раствором формальдегида в PBS. Далее проводили анализ флуоресценции на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 CXP с использованием каналов флуоресценции (530 ± 30), (572 ± 30) или (675 ± 30) нм.

Определение динамики изменения концентрации siРНК и ее холестерин-содержащих аналогов в плазме мышей после внутривенного введения. В работе использовали 10–14-недельных самок мышей линии C57BL/6 (n = 9, по 3 мыши в каждой экспериментальной группе) разведения вивария Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Животных содержали по 8–10 особей в клетке, мыши имели свободный доступ к еде и воде. После введения 0.5 мкг/г siРНК или ее холестеринового производного в объеме 100 мкл в хвостовую вену мышей проводили забор крови из ретроорбитального синуса через 5 мин, 2, 3 и 24 ч. Кровь центрифугировали (5 мин при 500 g), образцы плазмы разбавляли в 10 раз раствором для лизиса клеток (137 мM NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 1.8 мМ, KH₂PO₄, рН 7.4, 0.25% Triton X-100). Далее проводили выделение siРНК, для этого раствор нагревали до 95°С в течение 10 мин. Затем образцы охлаждали на льду (10 мин) и центрифугировали (10 мин, 4°С, 12 000 g). Отобранный супернатант нагревали до 95°С (10 мин) и сразу добавляли в готовую смесь БиоМастер для ОТ-ПЦР (Биолаб-микс, Россия) из расчета 2 мкл супернатанта на 38 мкл смеси Биомастер с использованием праймера 5'-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACTTGGCT-3'. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при температуре 42°С. Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР в режиме реального времени при помощи амплификатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США), используя готовую смесь HS-qPCR SYBR Blue (Биолабмикс, Россия) и праймеры 5'‑GTTGGGGATATACAACTTGTCA-3' (прямой) и 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' (обратный). Нормирование проводили путем построения калибровочных кривых с использованием известного количества siРНК (10, 1 и 0.1 пмоль), добавляемых к такому же количеству плазмы, как в пробах. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Bio-Rad iQ5 v.2.0 (Bio-Rad, США).

Исследование накопления siРНК и ее холестерин-содержащих аналогов в клетках крови мышей. Мышам линии C57BL/6 внутривенно вводили 1.7 и 9 мкг/г флуоресцентно-меченой siРНК; через 0.5, 1 и 4 ч после инъекции у мышей отбирали кровь из ретроорбитального синуса. Популяции клеток окрашивали соответствующими антителами с флуоресцентными метками (CD11b-Phycoerythrin/Cy5 (Invitrogen, США), CD20-Phycoerythrin/ Cy5 и CD3-Phycoerythrin (Abcam, США)) в течение 20 мин. Затем проводили лизирование эритроцитов, как описано выше, и анализ флуоресценции клеток на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 CXP.

Накопление siРНК и ее холестерин-содержащих аналогов в костном мозге и спленоцитах мышей. Мышам линии C57BL/6 проводили внутривенные инъекции 9 мкг/г siРНК или ее конъюгата с холестерином. Через 6 ч после этого животных подвергали эвтаназии путем дислокации шейных позвонков и проводили выделение костного мозга и спленоцитов. Для этого извлекали бедренные и большие берцовые кости. Концы костей удаляли, диафизы дважды промывали 3 мл буфера PBS. Клетки суспендировали, лизирование эритроцитов осуществляли, как описано выше, после этого готовили препараты и анализировали на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 CXP. Для получения спленоцитов извлекали селезенку и гомогенизировали ее раздавливанием между стеклами. Гомогенат смывали со стекла 3–4 мл буфера PBS. Лизирование эритроцитов в клеточной суспенции осуществляли, как описано выше, после этого готовили препараты и анализировали на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 CXP.

Статистический анализ данных. Для получения статистически достоверных результатов экспериментальные точки повторяли минимум трехкратно, результаты измерений представляли в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), для оценки достоверности результатов использовали критерий Стьюдента.