Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 2, стр. 270-275

ВВЕДЕНИЕ

6S РНК – обширный класс бактериальных некодирующих РНК (нкРНК) длиной ~200 нт. Несмотря на отсутствие гомологии, все 6S РНК обладают строго консервативной вторичной структурой, идеально повторяющей конформацию промотора ДНК в открытом комплексе с РНК-полимеразой (РНКП) [1]. Благодаря этой особенности 6S РНК может блокировать активный центр фермента, что в масштабе клетки приводит к приостановке процесса транскрипции и, как следствие, экономии ресурсов в неблагоприятных условиях [2]. Интересно, что для “отмены” ингибирования транскрипции существует специальный механизм: РНКП способна синтезировать короткие транскрипты (пРНК) непосредственно на матрице 6S РНК, что приводит к конформационным изменениям фермент-субстратного комплекса и высвобождению из него РНКП [3]. Этот процесс является своеобразным исключением из правила, поскольку в данном случае ДНК-зависимая РНКП использует для транскрипции РНК-субстрат. На сегодняшний день среди прокариотических нкРНК только 6S РНК обладает такой уникальной особенностью. Таким образом, синтез пРНК является одним из главных критериев, проверяемых при изучении новых молекул – предполагаемых аналогов 6S РНК из различных бактерий [4].

Иногда пРНК могут быть обнаружены при тщательном анализе транскриптомных данных (RNA-Seq) [5], что тем не менее требует последующей экспериментальной проверки. “Классическим” методом детекции РНК является нозерн-блот-гибридизация (нозерн-блоттинг) с комплементарными зондами. Крайне малая длина пРНК (14–30 нт) обусловливает необходимость использования специальных протоколов и модифицированных олигонуклеотидных зондов для повышения чувствительности метода, что, тем не менее, далеко не всегда приводит к положительным результатам. На данный момент всего в трех бактериях удалось обнаружить пРНК в условиях in vivo с помощью нозерн-блоттинга: Escherichia coli [6], Bacillus subtilis [7, 8] и Rhodobacter sphaeroides [9]. При этом в клетках E. coli и R. sphaeroides количество пРНК было достаточным для детекции с помощью ³²P-меченных ДНК-зондов, тогда как для B. subtilis был разработан специальный протокол с использованием модифицированных ДНК-зондов, содержащих остатки ковалентно-замкнутых нуклеозидов (LNA) и остаток дигоксигенина (DIG). Было показано, что такой способ является гораздо более чувствительным по сравнению с классическим радиоактивным [10]. Тем не менее детектировать 6S-2 пРНК B. subtilis (факт синтеза которой в условиях in vivo долгое время оставался предметом научных споров) удалось только с помощью еще более усложненного протокола, используя РНК/LNA-зонды с экстремальным количеством модифицированных нуклеозидов и двумя метками DIG на 5'- и 3'-концах молекулы [8].

Детекция пРНК также осложняется особенностями их синтеза, который происходит лишь в определенных, заранее не известных условиях клеточного роста. Например, для E. coli активный синтез пРНК был зафиксирован только при резкой смене условий культивирования, когда к клеткам, выращенным на минимальной среде M9, добавляли 10-кратный избыток питательной среды LB, тем самым моделируя “выход” из неблагоприятных условий роста и “снятие” 6S РНК-опосредованного ингибирования транскрипции. Причем максимальная транскрипция пРНК наблюдалась лишь в течение первых 4 мин после смены культуральной среды [6]. Активный синтез 6S-1 пРНК B. subtilis также удалось детектировать только в условиях резкого “выхода” из стационарной фазы и только в течение первых 2 мин [7]. В то же время данный протокол не приводил к изменениям в синтезе 6S-2 пРНК B. subtilis, и соответствующие транскрипты были обнаружены только в экспоненциальной фазе роста клеток [8]. Уникальная ситуация наблюдалась у бактерии R. sphaeroides, в которой удалось детектировать пРНК во всех фазах клеточного роста с весьма незначительной активацией их синтеза в ответ на смену питательной среды, тогда как максимальное количество данных транскриптов приходилось на раннюю экспоненциальную фазу [8]. Однако данный феномен является скорее исключением из правила.

В большинстве случаев для доказательства синтеза пРНК с матрицы 6S РНК проводят эксперименты по транскрипции in vitro в присутствии различных ³²P-меченных нуклеозидтрифосфатов (NTP) с последующим разделением продуктов реакции методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях [11]. Причем для изучения новых 6S РНК, выделенных из редких бактерий, возможно использовать “чужеродные” РНКП, например, РНКП E. coli или B. subtilis, а также коммерчески доступные ферменты [13]. Как правило, стартовая точка транскрипции располагается в центральном “пузыре” 6S РНК с 3'-конца молекулы (хотя в литературе описано несколько случаев синтеза пРНК с “обратной” стороны “пузыря” [4, 5]), что позволяет предсказать нуклеотидную последовательность образующихся пРНК. Однако интерпретация полученных результатов часто осложняется тем, что в процессе транскрипции образуется набор продуктов разной длины, а визуализация соответствующих сигналов зависит от используемого ³²P-меченного NTP и нуклеотидного состава пРНК. Последовательный перебор меченых NTP и их комбинаций, а также условий транскрипции не всегда приводит к положительному результату и пониманию, с какой стороны 6S РНК происходит транскрипция. Поэтому для подтверждения ее специфичности также используют нозерн-блоттинг с зондами, комплементарными пРНК [12, 13].

Ранее мы охарактеризовали две новые 6S РНК из азотфиксирующих бактерий Bradyrhizobium japonicum и Sinorhizobium meliloti [13]. При исследовании синтеза пРНК в этих бактериях возникли сложности с подбором условий для эффективной транскрипции in vitro и, как следствие, трудности с определением стартовой точки и длин пРНК, необходимых для дизайна соответствующих комплементарных зондов для нозерн-блоттинга. Таким образом, актуальной задачей являлся поиск альтернативного способа проверки возможности синтеза пРНК на матрице 6S РНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе для детекции пРНК, образующихся в процессе транскрипции на матрице 6S РНК, был предложен метод “зеркального” нозерн-блоттинга. Основное отличие от “классического” протокола состоит в том, что метка содержится не в зонде, а непосредственно встраивается в пРНК в процессе транскрипции. В нашем случае для этих целей мы использовали коммерчески доступный DIG-11-UTP (Roche, Швейцария). Далее следует гибридизация DIG-меченной пРНК (если она была синтезирована в ходе транскрипции) с “материнской” 6S РНК-мишенью (рис. 1а), иммобилизованной непосредственно на мембране в виде “точек” (dot-blot). Таким образом “зондом” в данном случае выступает сама 6S РНК, не содержащая меток. Последующая детекция DIG с помощью хемолюминесценции является быстрой и безопасной альтернативой ³²P-авторадиографии [14]. В результате такого эксперимента нельзя определить длину образующихся пРНК и предсказать их нуклеотидную последовательность, но можно быстро установить сам факт синтеза de novo транскриптов с матрицы 6S РНК.

Рис. 1.

(а) – Сравнение “классического” и “зеркального” методов детекции пРНК; (б) – анализ продуктов in vitro транскрипции с 6S РНК S. meliloti (Sm) и B. japonicum (Bj) в качестве матрицы для РНКП (дорожки 1 и 3) в присутствии DIG-11-UTP методом гель-электрофореза с последующим переносом de novo синтезированных пРНК на мембрану, иммобилизацией в присутствии EDC и непосредственной детекцией DIG с помощью хемолюминесценции. Дорожка 2 – отрицательный контроль, реакция в отсутствие 6S РНК.

Разработанный метод “зеркального” нозерн-блоттинга был верифицирован при анализе синтеза пРНК на 6S РНК из трех бактерий: B. subtilis, S. meliloti и B. japonicum. В реакции использовали “чужеродную” РНКП E. coli. Продукты трех in vitro транскрипций, проведенных в присутствии DIG-11-UTP, гибридизовали с тремя идентичными мембранами (рис. 2а), на которых были иммобилизованы соответствующие 6S РНК и различные синтетические олигорибонуклеотиды (отрицательные контроли). Для контроля детекции использовали 5'-DIG-меченный олигонуклеотид смешанной ДНК/LNA-природы, использованный ранее в работе Beckmann et al. [12]. Во всех трех случаях были получены специфические сигналы, соответствующие гибридизации пРНК с ее комплементарной 6S РНК-мишенью. Наиболее интенсивный сигнал визуализировался в случае пРНК B. subtilis (рис. 2б), что согласуется с данными об ее крайне эффективном синтезе с матрицы 6S-1 РНК B. subtilis как в условиях in vitro [12, 13], так и in vivo [8]. В случае пРНК S. meliloti и B. japonicum аналогичные сигналы характеризовались существенно меньшей интенсивностью, что привело к более высокому уровню фоновых сигналов вплоть до визуализации разметки мембраны и мест иммобилизации РНК (рис. 2в, 2г). Мы также проанализировали продукты in vitro транскрипций с 6S РНК S. meliloti и B. japonicum, проведенных в присутствии DIG-11-UTP, “классическим” способом, включающим разделение продуктов реакции методом гель-электрофореза с последующей иммобилизацией и детекцией на мембране (см. “Эксперим. часть”). Как видно из рис. 1б, в обоих случаях – в присутствии 6S РНК S. meliloti и B. japonicum (но не в отсутствие 6S РНК) – наблюдали появление сигналов с меньшей электрофоретической подвижностью, которые были интерпретированы нами как DIG-меченные пРНК.

Рис. 2.

“Зеркальный” точечный нозерн-блоттинг пРНК B. subtilis (Bs), S. meliloti (Sm) и B. japonicum (Bj). (а) – Схема эксперимента: использовали три одинаковые мембраны, на которые были точечно иммобилизованы препараты 6S РНК (1 мкг каждой) и синтетические олигорибонуклеотиды Bs14, Bs16, Bj17, Bj24, Sm16, Sm18 и Sm23 (100 пмоль каждого, отрицательные контроли, см. “Эксперим. часть”); Ec – 6S РНК E. coli; (+) – положительный контроль детекции (DIG-меченный олигонуклеотид, 10 пмоль). Каждую мембрану гибридизовали с продуктами in vitro транскрипции на матрице 6S РНК B. subtilis (б), S. meliloti (в) или B. japonicum (г).

Отметим, что использование DIG-11-UTP в качестве метки является определенным лимитирующим фактором, поскольку может быть применимо только для пРНК, содержащих остатки уридина.

Таким образом, мы впервые предложили новый “альтернативный” метод детекции пРНК с помощью “инвертированного” или “зеркального” нозерн-блоттинга. Главным его преимуществом является отсутствие необходимости подбора и синтеза специфических зондов, поскольку это не всегда возможно (и не всегда необходимо) на начальных этапах исследования и при первичном скрининге различных мутантных 6S РНК или предполагаемых аналогов 6S РНК. Мы полагаем, что подобные эксперименты можно проводить и в радиоактивном варианте при достаточно высокой эффективности синтеза пРНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Подготовка мембран. В данной работе были использованы препараты 6S РНК S. meliloti, B. japonicum и 6S-1 РНК B. subtilis, полученные с помощью Т7-транскрипции и охарактеризованные ранее [11, 13], а также ряд олигорибонуклеотидов – аналогов пРНК, использованных в качестве отрицательных контролей: Bs14: 5'-GUUCGGUCAAAACU-3'; Bs16: 5'-AAAGGUUAAAACUUAA-3'; Sm16: 5'-CGUGUAUGGCCCCGGG-3'; Sm18: 5'‑CGUGUAUGGCCCCGGGGA-3'; Sm23: 5'‑CGUGUAUGGCCCCGGGGAUUGUG-3'; Bj17: 5'-CG-AUAAGGCCCCGGGGA-3'; Bj24: 5'‑CGAUAAGGCCCCGGGGAUAUAUGG-3' (синтезированы в Сколковском институте науки и технологий, Россия) [11, 13]. Водные растворы РНК в объеме 5 мкл, содержащие 1 мкг 6S РНК, 100 пмоль аналогов пРНК или 10 пмоль положительного контроля для детекции DIG (5'-DIG-aGttTtgAccGaAc-3', где N – остаток LNA, n – дезоксирибонуклеозид; синтезирован фирмой “Exicon”, Дания), предварительно денатурировали при 95°C (5 мин), быстро охлаждали во льду и сразу наносили на предварительно размеченную положительно заряженную нейлоновую мембрану (Roche, Швейцария) по схеме, приведенной на рис. 2а. Для иммобилизации РНК мембраны облучали УФ-светом (256 нм) в течение 5 мин, а затем прогревали 1 ч при 80°C. Перед гибридизацией мембрану помещали в пластиковый флакон объемом 50 мл с закручивающей крышкой и промывали 5 мл буфера DIG Easy Hyb (Roche, Швейцария) в течение 1 ч при медленном перемешивании.

Транскрипция in vitro. Перед реакцией транскрипции проводили ренатурацию 6S РНК (20 пмоль) в 13 мкл буфера TE (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA, pH 8.0): образец нагревали до 95°C (2 мин) и далее ступенчато охлаждали (0.5°C/10 с) в амплификаторе t100 (Bio-Rad, США). Затем препараты 6S РНК смешивали с 4 мкл буфера для транскрипции (финальная концентрация (ф.к.): 40 мМ Tris‑HCl, 150 мМ KCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 0.01% (v/v) Triton X-100, pH 7.5) и 1 мкл (1 ед. акт.) σ⁷⁰-холофермента РНКП E. coli (New England Biolabs, США) и преинкубировали в течение 10 мин при 37°C для образования комплекса 6S РНК с РНКП. Реакцию инициировали добавлением 2 мкл смеси DIG RNA Labeling (Roche, Швейцария, ф.к.: 1 мМ ATP, 1 мМ CTP, 1 мМ GTP, 650 мкМ UTP, 350 мкМ DIG-11-UTP, pH 7.5) с последующей инкубацией при 37°C в течение 1 ч. Реакцию останавливали добавлением 80 мкл буфера DIG Easy Hyb, прогревали 5 мин при 95°C и немедленно добавляли к 5 мл буфера DIG Easy Hyb.

Гибридизация и детекция. Полученный раствор добавляли к промытой мембране и инкубировали в течение 16 ч при комнатной температуре при медленной ротации флакона. Дальнейшие манипуляции по отмывке мембраны и детекции сигналов проводили с помощью коммерческих наборов DIG Wash and Block Buffer Set и DIG Detection Kit (Roche, Швейцария) строго в соответствии с протоколом производителя. Сигналы хемолюминесценции визуализировали посредством системы гель-документации ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad, США). На рис. 2 представлены результаты одного из трех независимых экспериментов (начиная со стадии транскрипции in vitro) с наиболее четкими сигналами люминесценции.

Подтверждение синтеза DIG-меченных пРНК. Для подтверждения синтеза DIG-пРНК S. meliloti и B. japonicum после окончания реакции в аликвоту целевой смеси (10 мкл) добавляли 10 мкл формамида, выдерживали при 95°C в течение 10 мин и наносили в 10%-ный неденатурирующий ПААГ. После проведения электрофореза (2 ч, 30 мА, 1× TBE) гель промывали в 0.5× TBE и с помощью прибора Semidry Blotter (Хеликон, Россия) переносили продукты реакции на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Roche, Швейцария). Затем РНК иммобилизовали на мембране с помощью 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) [10]. Полученную мембрану тщательно промывали водой и далее проводили прямую детекцию пРНК с помощью коммерческих наборов DIG Wash and Block Buffer Set и DIG Detection Kit (Roche, Швейцария). На рис. 1б представлен результат одного из двух проведенных независимых экспериментов (начиная с реакции транскрипции in vitro).