Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 2, стр. 228-234

ВВЕДЕНИЕ

Разнообразные злокачественные образования печени входят в десятку самых распространенных онкологических заболеваний. Высокая функциональность печени даже на поздних стадиях развития гепатоклеточной карциномы, холангиокарциномы и других онкологических заболеваний затрудняет своевременную диагностику, поэтому часто единственным вариантом лечения остается резекция и пересадка печени. Несмотря на успехи хирургических подходов, лекарственная терапия предпочтительна из-за меньших рисков для пациентов.

При развитии рака печени изменяется экспрессия многих генов, которые могут выступать в качестве потенциальных мишеней для терапии и диагностики [1, 2]. Одним из основных онкогенов, вызывающих повышенную пролиферацию гепатоцитов, является малая субъединица 26S протеасомы, отвечающей за расщепление белков – ганкирин. Ганкирин состоит из семи тандемно расположенных аминокислотных повторов (анкириновых повторов) и синтезируется практически во всех эукариотических клетках [3]. Повышенный уровень ганкирина в гепатоцитах мыши приводит к увеличению деградации супрессоров канцерогенеза, в том числе семейства транскрипционных факторов CEBP. Также увеличение уровня ганкирина приводит к индукции гемангиомы за счет активации белка HIF-1, что свидетельствует о роли ганкирина в ответе на гипоксию в дополнение к его функциям онкобелка [4]. Все перечисленные свойства делают ганкирин привлекательным маркером и потенциальной мишенью для терапии гепатоклеточной карциномы.

В настоящее время разрабатываются различные подходы к снижению экспрессии ганкирина в раковых клетках. Известны малые молекулы и пептиды, ингибирующие связывание ганкирина с рядом белков-партнеров [5, 6], однако эти ингибиторы обладают ограниченной эффективностью за счет блокирования только части функций ганкирина. Альтернативным решением является подавление экспрессии мРНК ганкирина с использованием терапевтических нуклеиновых кислот [7]. Одним из подходов к регуляции количества мРНК, а следовательно, и белка в клетке является метод РНК-интерференции [8].

На сегодняшний день ряд препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов и малых интерферирующих РНК (siРНК) уже одобрен для применения в клинической практике при лечении наследственных метаболических заболеваний. Эти препараты характеризуются высоким терапевтическим индексом и эффективностью, а также пролонгированностью действия. Успехи применения терапевтических нуклеиновых кислот для лечения онкологических заболеваний пока более скромные, однако они активно используются для валидации новых мишеней [9, 10]. Синтетические siРНК представляют собой короткие РНК-дуплексы, способные активировать механизм РНК-интерференции. Антисмысловая цепь siРНК связывается с белком Ago2, образуя комплекс RISC, который в свою очередь взаимодействует с целевой мРНК, вызывая ее деградацию и ингибирование трансляции [11]. siРНК обладают высокой селективностью к мРНК-мишеням, что делает siРНК привлекательным инструментом для терапии [12]. Несмотря на развитие ряда инструментов для дизайна siРНК [13–16], создание активных siРНК остается сложной задачей.

В рамках данной работы нами были осуществлены дизайн, синтез и тестирование siРНК, подавляющих экспрессию гена ганкирина на уровне мРНК путем РНК-интерференции. На основании анализа вторичной структуры мРНК ганкирина были выбраны сайты связывания siРНК и проверена эффективность siРНК в линии гепатоцитов мыши AML12 in vitro. Для siРНК-кандидатов, показавших наибольшую активность in vitro, была подтверждена эффективность подавления экспрессии гена ганкирина in vivo в печени мышей линии BALB/C.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка эффективности ингибирования мРНК ганкирина в клетках печени мышей. Для дизайна siРНК, подавляющих экспрессию мРНК ганкирина, нами был проведен анализ последовательности мРНК ганкирина мыши (NM_001164177.1, NM_016883.4 NCBI) с исключением возможных участков связывания эндогенных микроРНК, а также последовательностей, встречающихся в других РНК транскриптома мыши. В результате анализа были выбраны семь siРНК, специфичных к мРНК ганкирина. Для увеличения их стабильности к действию внутриклеточных нуклеаз в процессе синтеза нами были использованы 2′-О-метильные пиримидиновые нуклеотиды и введены тиофосфатные группы между двумя последними нуклеотидами с 3′-конца. Все пиримидиновые нуклеотиды в составе смысловой цепи могут быть заменены, в то время как в антисмысловой цепи необходимо заменять пиримидиновые нуклеотиды только в составе динуклеотидов уридин(цитидин)-аденозин, т.к. при значительной или полной замене возможно снижение эффективности действия siРНК [17].

На следующем этапе мы сравнили эффективность подавления мРНК ганкирина под действием siРНК. Уровень экспрессии мРНК определяли через 24 ч после трансфекции siРНК в гепатоциты мыши AML12 методом ОТ-ПЦР. Степень ингибирования мРНК ганкирина составила (80 ± 7)% для siРНК 1, 3 и 4, для siРНК 5 и 6 – около (65 ± 5)%, а для siРНК 2 и 7 – не более 40% относительно уровня мРНК в контрольных клетках (рис. 1). Для объяснения наблюдаемой разницы в эффективности ингибирования мы проанализировали расположение siРНК на процессированной форме мРНК ганкирина (NM_016883.4) (рис. 2а), а также вторичную структуру мРНК ганкирина в участках связывания siРНК (рис. 2б, 2в).

Рис. 1.

Эффективность ингибирования мРНК ганкирина в гепатоцитах мыши AML12 под действием siРНК 1–7. Контрол. siРНК – siРНК к мРНК люциферазы светлячка; wt – контрольные клетки без обработки. ** p < 0.01; *** p < 0.001.

Рис. 2.

(а) – Cхема расположения синтезированных siРНК относительно экзонов мРНК ганкирина мыши; (б, в) – модель участков мРНК ганкирина мыши (NM_016883.4) с отмеченными местами связывания siРНК и обозначением вероятности образования/стабильности элементов вторичной структуры (цветная шкала): (б) – участок 200–700 нт, (в) – участок 1000–1300 нт мРНК ганкирина мыши.

Следует отметить, что siРНК 2 и 7 комплементарны 3′-концу последнего экзона мРНК ганкирина, а также попадают в область с наибольшей структурной лабильностью. Видимо, именно возможность образования набора различных структур данной области мРНК ганкирина и определило низкую эффективность siРНК 2 и 7 (рис. 2в). siРНК, продемонстрировавшие среднюю эффективность, попали или на одноцепочечный участок в виде шпильки в структуре мРНК (siРНК 6) или на участок двойной спирали (siРНК 5) (рис. 2б). Возможно, полученные результаты обусловлены недоступностью таких участков из-за связывания с регуляторными белками. Наиболее эффективные siРНК (1, 3 и 4) комплементарны областям мРНК ганкирина, содержащим в своем составе как шпилечный одноцепочечный участок, так и часть двойной спирали (рис. 2б). Полученные результаты важны для дизайна активных siРНК, однако необходимо учитывать, что релевантность результатов моделирования вторичной структуры РНК с реальной структурой в клетке ограничена [18].

Оценка эффективности ингибирования мРНК ганкирина в печени мыши. Мы отобрали две наиболее активные siРНК (3 и 4) для проверки их эффективности in vivo. Для этого siРНК были загружены в липидные наночастицы на основе липидоида С12-200 для адресной доставки в гепатоциты [19]. Мы определили эффективность ингибирования мРНК ганкирина in vivo после однократной инъекции частиц (дозы siРНК 0.05, 0.2, 0.5, 1 и 2 мг/кг). siРНК 3 и 4 показали высокую эффективность (подавление более 90%) in vivo уже при дозе 0.2 мг/кг (рис. 3). Важно отметить, что благодаря химической модификации siРНК даже при высоких дозах (1–2 мг/кг) не проявляли токсических эффектов и не активировали иммунную систему [10].

Рис. 3.

Эффективность ингибирования мРНК ганкирина в гепатоцитах мышей линии BALB/C при инъекции липидных частиц с siРНК 3 и 4. Контрол. siРНК – siРНК к мРНК люциферазы светлячка; PBS – инъекция буфера PBS внутривенно (200 мкл). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Дизайн и синтез siРНК. Дизайн siРНК к мРНК ганкирина (NM_001164177.1, NM_016883.4 NCBI) и контрольной siРНК к мРНК люциферазы светлячка (XM_031473197.1) был проведен по методике, представленной в работе Leboeuf et al. [10]. siРНК (табл. 1) были синтезированы по амидофосфитной схеме (MerMade 12, BioAutomation, США), очищены методом ионообменной хроматографии, а их чистоту подтверждали методом ВЭЖХ-МС.

Клеточные линии. Гепатоциты мыши AML12 (АТСС, США) культивировали в среде DMEM/F12, содержавшей 5 мМ глутамин и 10% фетальной бычьей сыворотки, при 37°С и 5% СО₂.

Трансфекция клеток AML12 siРНК. Клетки AML12 (~1 × 10⁵ клеток) трансфицировали siРНК в концентрации 10 нМ с помощью реагента Lipofectamine-RNАiMAX (Invitrogen, США) по протоколу производителя. В качестве контрольной siРНК использовали siРНК к гену люциферазы светлячка (табл. 1). Суммарную РНК выделяли через 24 ч после трансфекции, эффективность ингибирования анализировали методом ОТ-ПЦР.

Анализ транскрипции генов. Суммарную РНК из органов мыши или клеток AML12 выделяли с помощью реагента Trizol^® (Invitrogen, США) по методике производителя. Далее ~1 мкг суммарной РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Scientific, США) по методике производителя для удаления остатков геномной ДНК и проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора реагентов Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США). Реакционную смесь разбавляли в 3 раза водой и проводили реакцию амплификации в режиме реального времени (ОТ-ПЦР) с использованием набора реагентов PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, США) по методике производителя (0.3 мкМ смеси праймеров, 0.2 мкг кДНК). Для амплификации мРНК ганкирина использовали праймеры, последовательности которых представлены в табл. 2 (дизайн праймеров проведен в рамках данной работы); количество целевой РНК нормировали по мРНК Gapdh. Продукты реакции анализировали методом гель-электрофореза в 1%-ном агарозном геле в ТАЕ-буфере (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА, pH 7.6).

Предсказание вторичной структуры мРНК ганкирина. Для определения возможной вторичной структуры мРНК ганкирина (NM_001164177.1, NM_016883.4 NCBI) использовали программу ViennaRNA (http://rna.tbi.univie.ac.at/), которая позволяет предсказывать вторичные структуры РНК, обладающие минимальной свободной энергией, и учитывать вероятности образования пар оснований для РНК.

Получение липидных частиц, содержащих siРНК. Формулирование siРНК (табл. 1) в липидные наночастицы проводили путем смешивания водного раствора (10 мМ цитратный буфер, pH 3.0) 0.4 мг/мл siРНК со спиртовым раствором смеси липидов в микрофлюидном картридже на приборе The NanoAssemblr™ Benchtop (Precision Nanosystems, США). Липидная смесь содержала следующие компоненты: ионизируемый липидоид C12‑200, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) (Avanti Polar Lipids, США), холестерин (Sigma-Aldrich, США), С14-PEG-2000 (Avanti Polar Lipids, США) в молярном соотношении (%) 50 : 10 : 38.5 : 1.5. Количество липидов на единицу siРНК рассчитывали из массового соотношения siРНК к ионизируемому липидоиду C12-200 – 1 : 5. Для формирования частиц требуемого размера водную и спиртовую фазы смешивали в соотношении 3 : 1 по объему с общей скоростью смешивания 10 мл/мин. После смешения фаз полученную водно-спиртовую суспензию частиц диализовали в 500 объемах фосфатно-солевого буфера (pH 7.4, 12 ч, комнатная температура). После диализа частицы фильтровали в стерильных условиях через фильтр с мембраной из PES 0.22 мкм (Merck, США) и хранили при 4°С.

После фильтрации качество полученных частиц анализировали по двум параметрам: загрузка siРНК и размер частиц (80–90 ± 5) нм (Zetasizer Nano ZSP, Malvern Panalitycal, США). Концентрацию загруженной в липидные наночастицы siРНК определяли по разнице значений уровня флуоресцентного сигнала при окрашивании реагентом RiboGreen (Thermo Fischer Scientific, США) суспензии частиц до их разрушения и после. Для разрушения частиц использовали детергент Triton X-100 (Sigma-Aldrich, США).

Определение эффективности siРНК in vivo. Для оценки эффективности синтезированных siРНК in vivo мышам линии BALB/C (самки, n = 48, возраст 7–8 недель, 17–20 г, питомник “Столбовая”, Москва, Россия) внутривенно вводили липидные частицы, содержащие siРНК 3 и 4, либо частицы с контрольной siРНК, синтезированные по описанной выше методике.

До проведения эксперимента мышей взвешивали, рассчитывали необходимый для введения объем раствора siРНК, загруженной в липидные наночастицы. Препараты вводили в хвостовую вену в дозах siРНК 0.05, 0.2, 0.5, 1 и 2 мг/кг (три мыши в группе). В качестве дополнительной контрольной группы использовали животных, которым вводили 200 мкл раствора PBS внутривенно (три мыши в группе). Через 72 ч после введения животных наркотизировали с помощью 2%-ного изофлурана и извлекали печень. Кусочки печени (~30–50 мг) помещали в жидкий азот, после чего выделяли суммарную РНК реагентом Trizol^® (Invitrogen, США) по методике производителя и анализировали уровень снижения мРНК ганкирина методом ОТ-ПЦР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках данной работы нами были проведены дизайн, синтез и валидация siРНК для подавления экспрессии ганкирина in vitro и in vivo. Согласно результатам моделирования вторичной структуры мРНК ганкирина мыши, наиболее эффективные siРНК комплементарны фрагментам мРНК, формирующим одновременно одно- и двуцепочечные участки. Полученные siРНК могут быть использованы для изучения роли ганкирина в развитии ряда онкологических и метаболических заболеваний в моделях на животных.