Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 4, стр. 495-505

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время продолжается разработка соединений, способных избирательно воздействовать на мишени в нервной системе насекомых, такие как потенциал-чувствительные натриевые каналы (ПЧНК). ПЧНК – трансмембранные белки, состоящие из четырех гомологичных повторов (D I–IV). Первые четыре спирали (S1–S4) каждого повтора и петли между ними составляют потенциал-чувствительный домен (ПЧД), реагирующий на изменение трансмембранного потенциала; еще две спирали (S5 и S6) входят в состав единого пóрового домена (ПД), пропускающего ионы. Активация ПЧД I–III необходима для открытия ПД, в то время как активация ПЧД IV приводит к быстрой инактивации каналов [1, 2].

Среди природных нейротоксинов находят модуляторы и блокаторы ионных каналов, зачастую имеющие белковую природу и селективно действующие на определенный вид каналов у определенных организмов. В частности, в яде скорпионов найдены так называемые α-токсины (α-NaTx), ингибирующие инактивацию ПЧНК за счет связывания с ПЧД IV (петли S1–S2 и S3–S4) и ПД I (петля S5–S6) каналов [3]. Некоторые α‑NaTx могут избирательно воздействовать на каналы млекопитающих (их называют млекотоксинами), другие – на каналы насекомых (инсектотоксины), а третьи (α-подобные) характеризуются широким спектром активности [4, 5]. Изучение природы селективности α-NaTx может помочь не только в фундаментальных исследованиях: специфичные инсектотоксины, по-видимому, могут использоваться в качестве инсектицидов, безопасных для позвоночных [6].

В 2013 г. после сравнительного анализа свойств молекулярной поверхности разных групп α-NaTx была выдвинута гипотеза, что их селективность определяется прежде всего модулем специфичности – частью токсина, образованной N-концевой областью (называемой также RT‑петлей), петлей в шпильке β₂–β₃ и C-концевой областью токсина, скрепленной с N-концевой частью дисульфидной связью (рис. 1а) [7]. Исследованная недавно с помощью криоэлектронной микроскопии структура комплекса млекотоксина Aah2 из яда скорпиона Androctonus australis с химерным ПЧНК показала, что модуль специфичности действительно формирует контакты с каналом, тогда как остальная часть токсина (сердцевинный модуль) практически не взаимодействует с каналом [3].

Рис. 1.

Структура α-NaTx. (a) – Общий план строения на примере α-подобного токсина BeM9 (PDB ID: 5MOU [11]). Зеленым цветом выделен модуль специфичности согласно гипотезе [7], состоящий из RT-петли, β₂–β₃-петли и С‑концевого участка, тогда как остальная часть называется сердцевинным модулем; голубым цветом показан β-лист из трех β-тяжей (β₁–β₃), оранжевым – α-спираль, желтым – связи атомов серы, участвующих в построении дисульфидных мостиков, фиолетовым – аминокислотные остатки, подверженные заменам; (б, в) – строение RT-петли у BeM9 и типичного млекотоксина Aah2 (PDB ID: 1PTX [14]). У Aah2 наблюдается мотив гнезда: боковая цепь остатка D8 ориентирована внутрь RT-петли и образует водородные связи (показаны красным пунктиром) с –NH-группами основной цепи остатков V10 и N11, тогда как у BeM9 K8 ориентирован наружу и систему связей не образует; (г) – сравнение аминокислотных последовательностей BeM9, его двойного мутанта BeM9^EG и Ааh2. Цветовые обозначения аналогичны панели (а).

α-Подобный токсин M9 (BeM9) из яда скорпиона Mesobuthus eupeus (ранее назывался Buthus eupeus) – один из наиболее изученных α-NaTx; его пространственная структура была исследована в Институте биоорганической химии еще в 1980-х гг., став первой изученной структурой α‑NaTx [8, 9]. Ранее мы использовали этот α‑NaTx для получения на его основе специфичного млекотоксина: на каркас BeM9 был перенесен модуль специфичности токсина Aah2; кроме того, потребовалась замена нескольких аминокислотных остатков сердцевинного модуля [10]. Внимательное изучение пространственного строения BeM9 выявило ключевое значение остатка R60 в C-концевой области токсина для организации модуля специфичности за счет формирования сети водородных связей с образованием особого варианта мотива “ниши” – так называемой “аргининовой руки” [11]. Мутант R60K теряет возможность взаимодействовать с каналами млекопитающих, становясь инсектотоксином.

В данном исследовании мы сосредоточились на роли другой части модуля специфичности (RT-петле; рис. 1б) и получили новое производное BeM9, обладающее избирательностью в отношении ПЧНК насекомых.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор аминокислотных замен для модификации BeM9. Сравнение аминокислотных последовательностей α-NaTx показало, что у млекотоксинов в RT-петле присутствует высококонсервативный остаток аспарагиновой кислоты в 8-м положении. У инсектотоксинов и α-подобных токсинов в этом положении обычно имеется нейтральный (Q) или положительно заряженный остаток (K, как у BeM9). Интересно при этом, что у классического инсектотоксина BjαIT из яда Hottentotta judaicus здесь, как и у млекотоксинов, находится остаток аспарагиновой кислоты [12]. Внимательный анализ пространственной структуры различных α-NaTx показал, что у млекотоксинов данный остаток участвует в поддержании определенной конформации RT-петли за счет формирования множества водородных связей с ‒NH-группами основной цепи (так называемый мотив гнезда [13], рис. 1в). Мы решили узнать, играет ли непосредственно отрицательный заряд остатка в 8-м положении важную роль во взаимодействии с каналами млекопитающих. Чтобы при этом предотвратить образование мотива гнезда, мы провели замену K8 у BeM9 на остаток не аспаргиновой, а глутаминовой кислоты, длина боковой цепи которой не оптимальна для этого мотива.

Как было обнаружено ранее [7], RT-петля у млекотоксинов характеризуется сравнительно высокой подвижностью. Отчасти это объясняется тем, что на участке, соединяющем RT-петлю с α-спиралью, у млекотоксинов встречается характерный остаток глицина G17 (по нумерации Aah2). На основании анализа аминокислотных последовательностей и пространственной структуры α-NaTx мы предположили, что изменение заряда и подвижности RT-петли за счет двух мутаций (K8E и Y17G, рис. 1г) придаст α-подобному токсину BeM9 специфичность к каналам млекопитающих. Для проверки этого предположения мы приступили к получению производных BeM9 с указанными заменами.

Получение рекомбинантного BeM9 и его производных. Для получения достаточного материала для исследования активности мы использовали бактериальную экспрессионную систему и плазмиду, кодирующую BeM9, полученную в предыдущем исследовании [7, 11]. ДНК, кодирующая BeM9-K8E (BeM9^E) и BeM9-K8E,Y17G (BeM9^EG), была получена с помощью ПЦР с перекрывающимися синтетическими олигонуклеотидами. Гены целевых полипептидов клонировали в одной рамке считывания с геном белка-носителя тиоредоксина (Trx). Слитные белки Trx-BeM9, Trx-BeM9^E и Trx-BeM9^EG выделяли из общего лизата бактериальных клеток с помощью металл-хелатной хроматографии. Целевые полипептиды отделяли от Trx с использованием бромциана. Хроматографическая чистота полипептидов более 95% была достигнута с помощью двух раундов ВЭЖХ.

Корректный синтез целевых полипептидов с образованием дисульфидных связей был подтвержден путем измерения молекулярной массы очищенных продуктов методом MALDI-масс-спектрометрии: измеренные массы BeM9, BeM9^E и BeM9^EG составляли 7335.1, 7336.1 и 7230.1 Да соответственно (расчетные массы 7335.2, 7336.2 и 7230.0 Да); выход – 2 мг с 1 л среды LB. Существенная проблема при гетерологической экспрессии белков – правильное формирование дисульфидных связей. В случае BeM9 и его производных эта проблема решается за счет Trx: известно, что он способствует корректному фолдингу дисульфид-содержащих белков [15]. Недавно решенная с помощью спектроскопии ЯМР пространственная структура рекомбинантного BeM9 подтверждает корректность образования S–S-мостиков [11].

Изучение активности производных BeM9 на ПЧНК. Эффекты производных BeM9 были изучены в сравнении с исходным токсином в концентрации 1 мкМ в отношении ряда ПЧНК. Был применен стандартный подход, подразумевающий экспрессию генов каналов (α-субъединиц и соответствующих вспомогательных β-субъединиц) в ооцитах Xenopus laevis (рис. 2). Как и исходный токсин, BeM9^E и BeM9^EG не проявляли активности в отношении Na_v1.2, но были активны на канале таракана BgNa_v1, хотя активность стала менее выраженной (табл. 1). В отличие от BeM9, у BeM9^E была резко снижена активность на Na_v1.5 и Na_v1.6, тогда как BeM9^EG не проявил активности на этих каналах вообще. Таким образом, BeM9^EG не был активен на всех протестированных каналах млекопитающих и был классифицирован как инсектотоксин.

Рис. 2.

Активность токсина BeM9 и его производных на изоформах потенциал-чувствительных натриевых каналов. Показаны токи через мембрану ооцитов, экспрессирующих клонированные изоформы ПЧНК, в контроле и после инкубации с токсинами в концентрации 1 мкМ. Пунктирная линия показывает нулевой уровень тока. Амплитуда тока приведена в условных единицах I/(|I_min|) (см. пояснения в “Эксперим. части”). Представлены репрезентативные записи по крайней мере трех независимых экспериментов.

В 2019 г. была определена пространственная структура комплекса химерного канала hNa_v1.7-Na_vPas (фрагменты аминокислотной последовательности канала таракана Periplaneta americana Na_vPas, включая внеклеточные петли ПЧД IV и контактирующий участок ПД I, были заменены на соответствующие участки канала человека Na_v1.7) с млекотоксином Aah2 (PDB ID: 6NT4 [3]). Мы предположили, что модели комплексов BeM9 с ПЧНК млекопитающих и насекомых, построенные на ее основе, могут объяснить природу селективности BeM9^EG. Для этого были построены статичные модели BeM9 и BeM9^EG с каналами Na_v1.4 человека и BgNa_v таракана и изучены межмолекулярные контакты в них (подробности моделирования см. в “Эксперим. части”). Мы ожидали увидеть явное изменение межмолекулярных контактов, способствующее потере аффинности BeM9^EG к каналам млекопитающих, однако результаты простейшего моделирования этого не показали. Согласно полученной модели, остатки Y17/G17 не формируют контакты с каналом и не могут напрямую влиять на активность токсина. K8 в BeM9 не участвует во взаимодействии с каналами, в то время как в BeM9^EG Е8 образует межмолекулярную ионную связь с остатком К1439/1705 (номер остатка у hNa_v1.4/BgNa_v) (рис. 3в, 3г). Однако в случае BeM9 с К1439/1705 аналогичный контакт тоже имеет место, но его образует другой остаток – Е15.

Рис. 3.

Модели комплексов потенциал-чувствительных натриевых каналов с α-токсином BeM9 и его мутантом BeM9^EG. (а) – Общий вид комплекса ПЧНК с α-NaTx с внеклеточной стороны. ПЧНК изображен цветной поверхностью с индивидуально раскрашенными гомологичными повторами: D I (фиолетовый), D II (синий), D III (голубой), D IV (зеленый). Расположенные в центре части каждого повтора формируют ПД, дистальные части образуют ПЧД I–IV. Токсин (показан оранжевым) связывается с каналом в области ПЧД IV, частично захватывая ПД I; (б) – сайт связывания токсина (увеличен). Петля S3–S4 обозначена светло-зеленым, S1–S2 – темно-зеленым, ПД I – фиолетовым, C-конец токсина отмечен синей сферой; (в, г) – ионные связи RT-петли BeM9 c S3–S4-петлей ПЧНК. Желтым показана молекула токсина (BeM9 на панели (в) и BeM9^EG на панели (г)), голубым – Na_v1.4, зеленым – BgNa_v. Оранжевым выделены ключевые аминокислотные остатки токсина, участвующие во взаимодействии с каналами или подверженные мутагенезу.

Анализ комплексов не позволяет сказать, почему изменяется селективность BeM9^EG, поскольку структура петли S3–S4 крайне консервативна. Мы предположили, что причина этого явления кроется прежде всего в аллостерических эффектах, что привело нас к анализу изменения структуры и внутримолекулярных контактов у токсина после внесения мутаций.

Анализ изменений структуры BeM9, вызванных мутациями. Поскольку мы не смогли объяснить изменения специфичности, моделируя статичные комплексы BeM9/ПЧНК, было решено изучить динамические свойства молекулы токсина BeM9 и его производного BeM9^EG. Для этого мы рассчитали для каждого из них молекулярную динамику длительностью 100 нс в трех повторностях, а затем провели поиск структурных изменений с помощью анализа внутримолекулярных контактов нескольких типов: водородных связей, гидрофобных взаимодействий, солевых мостиков, стэкинга и π-катионных взаимодействий, представляя их в виде карты контактов – массива точек 66 × 66 (рис. 4).

Рис. 4.

Карты внутримолекулярных контактов токсина BeM9 и его мутанта BeM9^EG. Координаты каждой точки соответствуют номерам остатков, которые могут образовывать контакт. Интенсивность окраски точек для водородных связей и гидрофобных контактов (см. шкалу справа) пропорциональна доле времени от суммарной длительности трех траекторий молекулярной динамики (3 × 100 нс), в течение которой этот контакт существует. Остальные типы контактов показаны качественно: если контакт существует более 10% времени, он выделен точкой, если менее – не показан. Контакты, находящиеся в окрестностях RT-петли, обведены красной рамкой и представлены более крупными точками. Красными рамками выделены области наиболее значимых отличий между BeM9 и BeМ9^EG, отражающие эффекты мутаций К8Е и Y17G. Для π-катионных взаимодействий и солевых мостиков приведена одна карта: сверху над диагональю изображены солевые мостики, снизу – π-катионные взаимодействия.

Анализ внутримолекулярных контактов, а также вычисление значений среднеквадратичных флуктуаций (Root Mean Square Fluctuation, RMSF) показали, что одна из мутаций (Y17G) повышает подвижность петли перед α-спиралью за счет потери гидрофобных взаимодействий и стэкинга Y17–Y23, а также увеличения гибкости основной цепи за счет введения остатка глицина. Новообразовавшийся в BeМ9^EG контакт Y14–Y23, по-видимому, не оказывает стабилизирующего действия на данный участок токсина. Ключевые эффекты мутации Y17G показаны на рис. 5.

Рис. 5.

Влияние мутации Y17G на структуру BeM9^EG. (а) – Дифференциальная карта гидрофобных контактов между BeМ9 и BeМ9^EG в окрестностях RT-петли и α-спирали, полученная вычитанием карт гидрофобных (нижняя левая часть карты) и стэкинговых (верхняя правая часть) контактов BeM9 из BeМ9^EG (рис. 4). Голубым показана потеря гидрофобных контактов у BeМ9^EG по сравнению с BeM9, коричневым – их приобретение; интенсивность цвета отражает потерю или приобретение контактов между соответствующими остатками в долях времени от траектории (согласно шкале справа). Синим показана потеря стэкинг-взаимодействия Y17–Y23 у BeM9, красным – формирование стэкинг-взаимодействия Y14–Y23 у BeМ9^EG; на панелях (б, в) приведены типичные конформации, выбранные из расчетов молекулярной динамики; (б) – структура BeM9: зеленым показаны остатки, участвующие в стэкинг-взаимодействиях; оранжевым – не участвующие в данной структуре, но участвующие в BeМ9^EG; фиолетовым – остатки, у которых возрастает подвижность после мутации; серым – все другие остатки; (в) – структура BeМ9^EG: окраска аналогична BeM9, но оранжевым обозначены остатки, не участвующие в стэкинг-взаимодействиях у BeМ9^EG, но участвующие у BeM9; (г) – значения RMSF BeM9 (желтый) и BeМ9^EG (зеленый), усредненные по трем траекториям. Черная линия под графиком соответствует сердцевинному модулю, синим обозначены β-тяжи, красным – α-спираль, фиолетовым – окрестности замены Y17G, где после мутации возрастает подвижность (та же область, что и на панелях (б, в)).

Влияние ключевой мутации К8Е раскрывается через изменение системы солевых мостиков и π-катионных взаимодействий (рис. 6). Мотив гнезда, как и предполагалось, у мутанта не наблюдается (рис. 6б). Кроме того, в BeM9 существует стабильная система взаимодействующих пар остатков K8–Y14 и K8–E15, смена заряда в 8-й позиции на противоположный разрушает ее за счет отталкивания одноименных зарядов E8–E15. Также у мутанта утрачивается контакт Е15–К20, что может объясняться эффектом обеих замен. K8 может балансировать между Y14 и Е15, а E15 – между K8 и K20, что может обеспечивать переход между двумя стабильными конформациями BeM9, тогда как в BeM9^EG структура в целом более подвижна и менее упорядочена.

Рис. 6.

Влияние мутации K8E на структуру BeM9. Зеленым показаны остатки К8, Y14, E15 и K20, участвующие в ионных и π-катионных взаимодействиях, оранжевым – они же, но не участвующие, серым – другие остатки. Красным пунктиром показаны взаимодействия между остатками. Приведенные конформации взяты из расчетов молекулярной динамики. (а) – Структура BeM9. Сверху показан солевой мостик K8–E15, снизу – солевой мостик Е15–К20 и π-катионное взаимодействие K8–Y14. Слева от структур показаны доли времени моделирования, в течение которых наблюдаются соответствующие контакты, усредненные по трем траекториям; (б) – структура BeМ9^EG. Сверху показана структура RT-петли аналогично рис. 1б и 1в, снизу – общий вид структуры.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение рекомбинантных производных BeM9. Синтез нуклеотидных последовательностей, кодирующих BeM9^E и BeM9^EG, был проведен с помощью лигирования олигонуклеотидных фрагментов (табл. 2) и ПЦР аналогично описанной ранее процедуре для BeM9 [7, 16]. Полученные полноразмерные последовательности были клонированы в экспрессионный вектор pET-32b (Novagen, США) по сайтам рестрикции KpnI и BamHI. В результате в составе вектора были получены химерные гены слитных белков, состоящих из Trx и токсина: Trx-BeM9^E и Trx-BeM9^EG.

Экспрессию химерных генов проводили в штамме Escherichia coli BL21(DE3) [17]. Культуру бактерий, трансформированных с использованием экспрессионного вектора, выращивали в среде LB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) при 37°C и интенсивном перемешивании. Индукцию экспрессии целевых генов осуществляли добавлением в среду 0.2 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида, после чего культуру инкубировали еще 4 ч. По истечении этого времени бактерии осаждали, ресуспендировали в стартовом буфере для аффинной хроматографии (300 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5) и лизировали с помощью ультразвука.

Слитные белки имели в своем составе гексагистидиновую последовательность, которая позволяет проводить их очистку с помощью металл-хелатной хроматографии [18] на сорбенте TALON Superflow Metal Affinity Resin (Clontech, США). Элюцию сорбированных белков проводили буфером, содержащим имидазол (150 мМ имидазол, 300 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5). Последовательность производных BeM9 не содержит остатков метионина, поэтому целевые токсины отщепляли от Trx с помощью бромциана по описанной методике [19]. Для этого в последовательность химерных генов был специально введен метиониновый кодон непосредственно перед геном токсина. Очистку отщепленных от Trx производных BeM9 проводили с помощью офВЭЖХ.

Масс-спектрометрия. Полипептиды анализировали с помощью времяпролетной MALDI-масс-спектрометрии с использованием спектрометра Ultraflex TOF-TOF (Bruker Daltonics, США), анализ проводили, как описано ранее [20]. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (Sigma-Aldrich, США). Измерения проводили как в линейном, так и в рефлекторном режимах. Масс-спектры анализировали с помощью программного обеспечения Data Analysis 4.3 и Data Analysis Viewer 4.3 (Bruker, США).

Электрофизиология. Активность полученных производных сравнивали с исходным токсином BeM9 по эффекту в отношении ПЧНК, экспрессированных в ооцитах лягушки X. laevis. Выделение ооцитов, получение РНК, а также сбор и анализ данных проводили, как описано ранее [7, 10]. Мы использовали гены ряда изоформ ПЧНК млекопитающих: Na_v1.2 и 1.4 крысы (r), Na_v1.5 человека (h), Na_v1.6 мыши (m), вспомогательных субъединиц rβ1 и hβ1, а также α-субъединицы BgNa_v1 и вспомогательной субъединицы TipE, клонированных из генома таракана Blattella germanica и дрозофилы. Для оценки эффективности токсинов мы использовали величину, равную отношению регистрируемой величины тока через мембрану ооцита спустя 30 мс после подачи тестового импульса к пиковому току (I_{30 мс}/I_min). В случае канала Na_v1.5 из-за быстрой кинетики его работы использовали отношение тока через 5 мс после тестового импульса к пиковому току (I_{5 мс}/I_min). Все данные анализировали с помощью программного обеспечения pClamp Clampfit версии 10.4 (Molecular Devices, США) и Origin Pro версии 8.0 (OriginLab, США).

Молекулярное моделирование. Для сравнительного анализа использовали комплексы токсинов BeM9 и BeM9^EG с каналами человека Na_v1.4 и таракана BgNa_v. Основой для моделирования стал комплекс химерного канала hNa_v1.7-Na_vPas с Aah2 (PDB ID: 6NT4 [3]), куда путем пространственного совмещения на место Aah2 вставили исследуемые токсины, а на место hNa_v1.7-Na_vPas – исследуемые каналы. Структуры hNa_v1.4 и BgNa_v получили на основе hNa_v1.7-Na_vPas при помощи моделирования по гомологии в программе MODELLER v. 9.19 [21]. На основе шаблона построили 20 моделей и выбрали 3 модели с лучшим показателем оценивающей функции. Для минимизации энергии комплексов использовали вакуумные кубические ячейки (160 × 160 × 160 ų), программу GROMACS 5.1.2 [22] и силовое поле amber99sb-ildn.ff [23].

Внутримолекулярные эффекты от мутаций в BeM9 оценивали с помощью сравнительного моделирования α-подобного токсина BeM9 дикого типа (PDB ID: 5MOU) и его двойного мутанта, специфичного к ПЧНК насекомых, – BeM9^EG. Модель BeM9^EG построили на основе гомологии с BeM9 в программе MODELLER v. 9.19 [21].

Для сравнения динамики молекул использовали метод молекулярной динамики. Радиус отсечки ван-дер-ваальсовых и электростатических взаимодействий составил 10 и 12 Å соответственно. Для расчетов молекулярной динамики токсинов построили кубические ячейки (55 × 55 × 55 ų) c моделью воды SPC [24], содержащие противоионы для электронейтральности и уравновешенные по энергии путем нагревания до 300 К в течение 100 пс. Молекулярную динамику проводили в периодических граничных условиях при Т = 300 К и P = 1 бар, поддерживаемых при помощи термостата V-rescale [25] и баростата Берендсена [26] соответственно. Длина и шаг траектории составили 100 нс и 2 фс соответственно. Для каждой изучаемой молекулы было проведено по три независимых расчета для статистического сравнения.

Молекулярные контакты. Для расчета внутри- и межмолекулярных контактов использовали программное обеспечение IMPULSE (разработано Н.А. Крыловым, статья готовится к публикации). Все парные взаимодействия, обнаруженные в траекториях, классифицировали как водородные связи, гидрофобные контакты, солевые мостики (ионные связи), параллельный и Т-образный стэкинг на основании взаимного расположения, энергии взаимодействия и типа контактирующих остатков. Полученные данные перевели в формат точечных карт размером 66 × 66, где координаты точек соответствуют номерам остатков, а интенсивность окраски отражает долю времени существования контакта от времени моделирования (100 нс), собственным скриптом Python.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках выполненной работы мы попытались выяснить, какие механизмы стоят за наблюдаемым изменением селективности α-подобного токсина BeM9 при внесении двух замен (K8E и Y17G) в его структуру. Мутации привели к неожиданному результату: BeM9^EG потерял активность на каналах млекопитающих, оставшись активным на каналах насекомых, тогда как мы ожидали обратного эффекта. Чтобы выяснить причину такого изменения активности, мы сравнили модели комплексов ПЧНК млекопитающих и насекомых с BeM9 и BeM9^EG, а также провели при помощи метода молекулярной динамики сравнительный анализ внутримолекулярных контактов в этих токсинах.

Анализ комплексов показал, что характер взаимодействия с ПЧНК изменяется: остаток K1439/1705 каналов формирует ионную связь с E15 у BeM9, а К8 во взаимодействии не участвует, тогда как в случае BeM9^EG с K1439/1705 контактирует остаток Е8. Однако петля S3–S4 и, в частности, остаток K1439/1705 консервативны, поэтому построенные модели могут объяснить изменение активности по отношению ко всем ПЧНК, но не изменение селективности токсина. Это показывает, что простые модели комплексов неинформативны, а причина изменения селективности может заключаться в аллостерических эффектах.

Анализ молекулярной динамики изолированных токсинов показал, что в области замены Y17G BeМ9^EG имеет бóльшую подвижность. Это может объясняться потерей стэкингового контакта Y17–Y23, а также гибкостью основной цепи в области остатка глицина. Замена K8E разрушает переключаемую систему связей K8–E15–K20 и Y14–K8–E15, что может уменьшить стабильность RT-петли и ее окружения. В BeМ9^EG эти связи утеряны, поэтому RT-петля и ее окрестность становятся более подвижными, и система из двух стабильных конформаций исчезает. Мы предполагаем, что такая перестройка токсина в результате внесения мутаций и приводит в конечном итоге к нарушению стабильности его комплекса с ПЧНК млекопитающих. Дальнейшее детальное изучение структуры и конформационной мобильности модуля специфичности α-NaTx может раскрыть природу “двойной” активности α-подобных токсинов и способствовать созданию селективных лигандов на различные типы ПЧНК.