1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 47, № 5, 2021

Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 5, стр. 642-646

Сy5-меченый фосфатидилхолин

Ю. А. Грачёва 1, Д. С. Третьякова 2, О. Г. Замышляева 1, Е. С. Кудряшова 1, Е. Л. Водовозова 2, А. Ю. Федоров 1, И. А. Болдырев 2, *

1 Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
603950 Нижний Новгород, просп. Гагарина, 23, Россия

2 ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН
117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Россия

* E-mail: ivan@lipids.ibch.ru

Поступила в редакцию 30.10.2020
После доработки 11.11.2020
Принята к публикации 14.11.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Флуоресцентные липидные зонды широко применяются в качестве инструментов для исследования биологических функций липидов (метаболических путей и молекулярных механизмов заболеваний) и изучения свойств биологических мембран. В данной статье мы описываем новый флуоресцентный липидный зонд – Cy5-меченый фосфатидилхолин (Cy5-PC), приводим его геометрические параметры, методику синтеза, спектральные характеристики и данные по подвижности в липидной мембране. Су5-PC – хороший зонд для биоимиджинга – интенсивность его флуоресценции сохраняет линейную зависимость вплоть до высоких значений концентрации. Однако применение Cy5-PC в исследованиях мембранной динамики невозможно, т.к. зонд нечувствителен даже к фазовому переходу в липидной мембране.

Ключевые слова: флуоресцентные липидные зонды, цианиновые красители, биологические мембраны

ВВЕДЕНИЕ

Флуоресцентные липидные зонды – распространенный инструмент для исследования биологических функций липидов [1]. Поведение липидных зондов в мембране зависит от структуры флуорофора. Оно различается для дифенилгексатриена [2], пирена [3], 4-нитробензо-2-окса-1,3-диазола (NBD) [4–6], производных группы BODIPY [7, 8] и других флуорофоров [9, 10]. Цианиновые флуорофоры широко применяются для мечения белков [11] и нуклеиновых кислот [12–15]. Для изучения биологических мембран используются диалкильные производные цианинов (DII, DIO, DID и DIR), сильно отличающиеся по структуре от молекул липидов [16, 17]. Стремясь разработать флуоресцентные зонды, как можно более близкие по структуре к природным липидам, мы синтезировали фосфолипидный аналог Cy5-PC – фосфатидилхолин c флуорофором Cy5, присоединенным через ацильный линкер в sn-2-положение глицерина. Это распространенный дизайн липидных зондов для мембранных исследований [18–21]. Однако именно Cy5-меченых фосфатидилхолинов до сих пор не было предложено. Су5 – достаточно полярный флуорофор, он применялся (в виде конъюгата с дибензоциклооктином для последующей реакции циклоприсоединения к азиду) для мечения встроенного в клеточную мембрану гликолипида, модифицированного азидогруппой по остатку маннозы [22, 23]. Мы считаем, что введение Су5 в гидрофобную часть молекулы фосфолипида представляет не меньший интерес. Во-первых, относительно неполярные метки, обладающие подходящими для биоимиджинга спектральными характеристиками, все равно вытесняются из плотно упакованной гидрофобной области мембраны в приповерхностную полярную область [8]. Во-вторых, полярные метки, такие как NBD, располагаются в полярной области мембраны независимо от места крепления в молекуле липида [5]. И, наконец, Cy5 сорбируется на поверхности липидной мембраны из водного раствора, даже если флуорофор содержит сульфогруппы [24].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектральные характеристики Cy5-PC идентичны таковым для исходного флуорофора Cy5: λвозб/λэм = 646/664 нм (рис. 1а). С ростом концентрации Cy5-PC в растворе эффект внутреннего фильтра не проявляется вплоть до оптической плотности 0.3 (что соответствует концентрации 1.2 мкМ, молярный коэффициент поглощения ε ~ 250 000) (рис. 1б). Это позволяет использовать Cy5-PC в больших локальных концентрациях в мембранах, не опасаясь самотушения его флуоресценции, что важно для биоимиджинга липосом в экспериментах in vitro и in vivo.

Рис. 1.

(а) – Cпектры возбуждения и испускания зонда Cy5-PC в этаноле; (б) – зависимость интенсивности флуоресценции Cy5-PC от концентрации; (в) – зависимость анизотропии флуоресценции Cy5 от вязкости среды (смеси глицерина с водой); (г) – анизотропия флуоресценции фосфолипидных зондов Cy5-PC и TMB-PC [8] в бислое DMPC в зависимости от температуры.

Анизотропия флуоресценции (r) – мера подвижности флуорофора. Если последний быстро и свободно вращается, анизотропия флуоресценции будет стремиться к нулю. Если молекула зафиксирована в пространстве, величина r будет равна предельному значению, характеристическому для данного флуорофора (но не более максимально возможного значения 0.4). Измерения анизотропии флуоресценции позволяют оценить свойства среды, в которой находится флуорофор: с ростом вязкости среды подвижность флуорофора уменьшается, а величина r растет (рис. 1в). По изменению анизотропии флуоресценции отслеживают изменение фазового состояния липидной мембраны. На рис. 1г показано изменение анизотропии флуоресценции для BODIPY-меченого липида, TMB-PC [8], в липидном бислое из 1,2-димиристоил-sn-глицерофосфохолина (DMPC) при изменении температуры. DMPC при 24°С переходит из гелевой (So) в жидкую неупорядоченную фазу (Ld), и в районе точки фазового перехода анизотропия меняется скачкообразно. Однако в случае Cy5-PC фазовый переход в липидном бислое практически не отражается на анизотропии флуоресценции зонда.

Можно было предположить, что вращение флуорофора Cy5 затормаживается за счет электростатических взаимодействий с фосфатными группами двух соседних липидов в мембране. Действительно, расстояние между катионными центрами (атомами N) Сy5 равно 9.8 Å (данные из оптимизированной геометрии флуорофора, программное обеспечение ORCA [25], уровень теории B3LYP), что очень близко к расстоянию между фосфатами соседних липидов – 9.1 Å (исходя из средней площади на один липид в 65 Å2 [26]). Однако в работе Lam et al. [27] с помощью полноатомной молекулярной динамики показано, что ароматические системы цианиновых флуорофоров, включая атомы азота, погружены в область углеводородных цепей и не взаимодействуют с фосфатными группами липидов.

Мы считаем, что пониженная чувствительность анизотропии флуоресценции Cy5 к изменению фазового состояния внутри бислоя обусловлена коротким временем жизни возбужденного состояния. Для цианиновых красителей оно составляет менее 2 нс [28]. За это время соседние с зондом молекулы липидов не успевают переместиться на заметное расстояние. Соответственно, и сам флуорофор не успевает изменить своего положения в пространстве. Иными словами, короткое время жизни флуоресценции цианинового флуорофора не позволяет отличить друг от друга липидные среды с высоким (в фазе Ld) и низким (в фазе So) коэффициентом диффузии. Для зонда TMB-PC время жизни возбужденного состояния превышает 6 нс [8]. Этого оказывается достаточно, чтобы почувствовать разницу между динамикой липидов в жидкокристаллической и гелевой фазах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Спектры ЯМР (δ, м.д.; КССВ – J, Гц) регистрировали на спектрометре DD2 400 (Agilent, США) в CD3OD при 25°С, используя TMS в качестве внутреннего стандарта. Масс-спектр получен на масс-спектрометре Microflex LT (Bruker, Германия); MS (MALDI-TOF). Электронные спектры (в этаноле) регистрировали на спектрофотометре СФ2000 (ООО “ОКБ Спектр”, Россия), спектры флуоресценции (в этаноле) – на спектрофлуориметре Hitachi F-4000 (Япония), спектральные щели 5 нм. Спектр испускания в диапазоне 620−800 нм снимали при возбуждении 600 нм; спектр возбуждения в диапазоне 525−685 нм – при испускании 695 нм.

Синтез Cy5-PC из лизофосфатидилхолина (LysoPC) и карбоксипентильного производного Cy5 проводили в условиях реакции Штеглиха, как описано ранее [21] (схема 1 ). Целевой продукт выделяли хроматографией на силикагеле 60, элюируя градиентом метанола в хлороформе от 10 до 20%, затем системой CHCl3 : MeOH : H2O, 65 : 25 : 4 (выход 46%; темно-синее маслообразное вещество). Выход реакции синтеза зонда Cy5-PC (схема 1 ) составил 46%. Структура была подтверждена методами масс- (m/z 960.1 [M]+) и ЯМР-спектроскопии.

Схема 1 . Схема синтеза флуоресцентного липидного зонда Cy5-PC. LysoPC – лизофосфатидилхолин, Cy5 – карбоксипентильное производное Cy5, DIC – диизопропилкарбодиимид, DMAP – 4-диметиламинопиридин.

1H-ЯМР-спектр (400 MГц): 8.33–8.24 (м, 2H), 7.50 (д, J 7.1, 2H), 7.44–7.39 (м, 2H), 7.34–7.30 (м, 2H), 7.29–7.24 (м, 2H), 6.71–6.65 (м, 1H), 6.32 (д, J 13.8, 2H), 4.31 (с, 2H), 4.16–4.10 (м, 2H), 3.76–3.57 (м, 7H), 3.31 (с, 3H), 3.27 (д, J 3.5, 9H), 2.35 (тд, J 14.4, 13.3, 7.0, 4H), 1.73 (с, 14H), 1.60 (квинтет, J 8.5, 7.7, 2H), 1.56–1.50 (м, 2H), 1.28 (уш. с, 26H), 0.89 (т, J 6.3, 3H).

31P-ЯМР-спектр (162 MГц): –1.11.

13C-ЯМР-спектр (101 MГц): 175.38, 174.95, 174.64, 174.50, 174.35, 155.62, 155.51, 144.24, 143.53, 142.67, 142.55, 129.73, 126.87, 126.23, 126.15, 123.43, 123.28, 112.00, 111.89, 104.58, 104.32, 71.98, 67.40, 67.35, 64.97, 63.52, 60.66, 54.77, 54.74, 50.51, 44.81, 34.86, 33.05, 31.73, 30.77, 30.73, 30.59, 30.42, 30.15, 28.16, 28.05, 27.88, 27.25, 25.99, 25.69, 23.73, 23.70, 14.46.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтезированный нами Cy5-PC оказался зондом с узкой областью использования. Его применение в исследованиях мембранной динамики невозможно, т.к. зонд нечувствителен даже к фазовому переходу в липидной мембране. Однако Су5-PC – хороший зонд для биоимиджинга – интенсивность его флуоресценции сохраняет линейную зависимость вплоть до высоких значений концентрации. Cy5-PC найдет применение для окрашивания мембран клеток и искусственных липидных мембран.

Список литературы

  1. Varandas P., Cobb A., Segundo M., Silva E. // Bioconjugate Chem. 2020, V. 31, P. 417–435. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.9b00660

  2. do Canto A., Robalo J., Santos P., Palace Carvalho A., Prates Ramalho J., Loura L. // Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 2016. V. 1858. P. 2647–2661. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2016.07.013

  3. Fraňová M.D., Vattulainen I., Ollila O.H.S. // Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 2014. V. 1838. P. 1406–1411. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2014.01.030

  4. Filipe H., Bowman D., Palmeira T., Cardoso R., Loura L., Moreno M. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2015. V. 17. P. 27534–27547. https://doi.org/10.1039/C5CP04191K

  5. Filipe H., Pokorna S., Hof M., Amaro M., Loura L. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2019, V. 21. P. 1682–1688. https://doi.org/10.1039/C8CP06064A

  6. Amaro M, Filipe H., Prates Ramalho J., Hof M., Loura L. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2016. V. 18. P. 7042–7054. https://doi.org/10.1039/C5CP05238F

  7. Sachl R., Boldyrev I., Johansson L. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2010. V. 12. P. 6027–6034. https://doi.org/10.1039/b926953c

  8. Tretiakova D.S., Alekseeva A.S., Galimzyanov T.R., Boldyrev A.M., Chernyadyev A.Y., Ermakov Y.A., Batishchev O.V., Vodovozova E.L., Boldyrev I.A. // Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 2018. V. 1860. P. 2337–2347. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2018.05.020

  9. Faller R. // Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 2016. V. 1858. P. 2353–2361. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2016.02.014

  10. Loura L., Prates Ramalho J. // Biophys. Rev. 2009. V. 1. P. 141–148. https://doi.org/10.1007/s12551-009-0016-5

  11. Leisle L., Chadda R., Lueck J., Infield D., Galpin J., Krishnamani V., Robertson J., Ahern C. // eLife. 2016. V. 5. P. e19088. https://doi.org/10.7554/eLife.19088

  12. Fegan A., Shirude P., Balasubramanian S. // Chem. Commun. (Camb). 2008. V. 17. P. 2004–2006. https://doi.org/10.1039/B801629A

  13. Gerowska M., Hall L., Richardson J., Shelbourne M., Brown T. // Tetrahedron. 2012. V. 68. P. 857–864. https://doi.org/10.1016/j.tet.2011.11.041

  14. Lapa S.A., Guseinov T.O., Pavlov A.S., Shershov V.E., Kuznetsova V.E., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2020. V. 46. P. 557–562. https://doi.org/10.1134/S1068162020040111

  15. Shershov V.E., Miftakhov R.A., Kuznetsova V.E., Timofeev E.N., Grechishnikova I.V., Spitsyn M.A., Guseinov T.O., Lapa S.A., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 68. P. 217–220. https://doi.org/10.1134/S1068162019030051

  16. Shim S.H., Xia C., Zhong G., Babcock H.P., Vaughan J.C., Huang B., Wang X., Xu C., Bi G.Q., Zhuang X. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. P. 13978–13983. https://doi.org/10.1073/pnas.1201882109

  17. Daubeuf S., Bordier C., Hudrisier D., Joly E. // Cytometry A. 2009. V. 75. P. 380–389. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20679

  18. Boldyrev I.A., Zhai X., Momsen M.M., Brockman H.L., Brown R.E., Molotkovsky J.G. // J. Lipid Res. 2007. V. 48. P. 1518–1532. https://doi.org/10.1194/jlr.M600459-JLR200

  19. Boldyrev I.A., Molotkovsky J.G. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2006. V 32. P.78–83. https://doi.org/10.1134/S1068162006010080

  20. Polozov I.V., Molotkovsky J.G., Bergelson L.D. // Chem. Phys. Lipids. 1994. V 69. P. 209–218. https://doi.org/10.1016/0009-3084(94)90002-7

  21. Alekseeva A., Tretiakova D., Melnikova D., Molotkovsky U., Boldyrev I. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2016. V. 42. P. 305−309. https://doi.org/10.1134/S1068162016030031

  22. Shen L., Cai K., Yu J., Cheng J. // Bioconjugate Chem. 2019. V 30. P. 2317−2322. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.9b00509

  23. Shen L., Cai K., Yu J., Cheng J. // ACS Omega. 2020. V. 5. P. 14111–14115. https://doi.org/10.1021/acsomega.0c01644

  24. Hughes L., Rawle R., Boxer S. // PLoS One. 2014. V. 9. P. e87649. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087649

  25. Neese F. // WIREs Comput. Mol. Sci. 2012. V. 2. P. 73–78. https://doi.org/10.1002/wcms.81

  26. Petrache H.I., Dodd S.W., Brown M.F. // Biophys. J. 2000. V. 79. P. 3172–3192. https://doi.org/10.1016/S0006-3495(00)76551-9

  27. Lam K., Tajkhorshid E. // Biophys. J. 2020. V. 119. P. 24–34. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2020.05.027

  28. Gustafson T., Cao Q., Achilefu S., Berezin M. // ChemPhysChem. 2012. V. 13. P. 716 –723. https://doi.org/10.1002/cphc.201100916

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал