Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 5, стр. 593-602

ВВЕДЕНИЕ

Простагландины – группа физиологически активных веществ липидной природы. Они регулируют важнейшие физиологические процессы в организме млекопитающих, в частности выступают медиаторами воспаления [1]. Ключевую роль в регуляции уровня простагландинов играет фермент простагландин-H-синтаза (PGHS; К.Ф. 1.14.99.1), известный также как циклооксигеназа (COX). Фермент катализирует две последовательные реакции – циклооксигеназную (окисление арахидоновой кислоты (AA) кислородом до простагландина G₂ [2]) и пероксидазную (восстановление перекисной группы простагландина G₂ до спиртовой в присутствии донора электронов [3]). В результате образуется простагландин Н₂ [4], который далее под действием специфических ферментов – конвертаз – превращается в другие физиологически активные соединения, такие как простагландины E₂, D₂, F_2α, тромбоксан A₂ и простациклин [5–7]. PGHS характеризуется быстрой инактивацией в процессе катализируемых реакций [8–12]. Существуют различные изоформы фермента: PGHS-1 постоянно нарабатывается в клетках и способствует их нормальному функционированию [13], PGHS-2 синтезируется в ответ на определенные стимулы, такие как цитокины или факторы роста [14]. Действие нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), широко используемых в медицине, направлено на ингибирование PGHS [15–17].

Традиционные эксперименты in vitro по исследованию свойств ферментов проводятся в закрытых системах, не предполагающих приток фермента, субстратов и других участников реакции. Однако организм представляет собой открытую систему, где происходят синтез и деградация фермента, а приток субстрата может регулироваться различными внешними по отношению к ферменту факторами. Кинетические характеристики закрытых систем могут совершенно не соответствовать кинетическому поведению открытых систем и, соответственно, систем in vivo. Тем не менее встречается очень мало исследований ферментов в открытых системах. В работе Gabrielsson et al. [18] рассматривается теоретическая модель, учитывающая факторы синтеза и деградации фермента, а также притока субстрата. В работе Westley et al. [19] исследовали различные типы ингибирования с учетом постоянного притока субстрата. Кинетическое поведение ферментов, подвергающихся инактивации в процессе реакции и действию медленных ингибиторов, до настоящего времени в открытых системах исследовано не было.

Цель настоящего исследования – моделирование кинетического поведения участка синтеза простагландинов в открытой системе при наличии ингибиторов индометацина и аспирина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние ингибиторов на поток образования и уровень простагландина в открытых системах, содержащих фермент PGHS, представляется целесообразным описать в рамках кинетического механизма, представленного на схеме 1 .

Схема 1 . Общая схема преобразования фермента и продукта реакции в открытой системе. E – свободный фермент (PGHS); ES – комплекс фермента с субстратом (S – арахидоновая кислота, AA); EI и E*I – комплексы фермента с ингибитором (I); E** – инактивированная форма фермента; V_E – скорость синтеза (притока) фермента; k₁, k_–1 – константы скорости образования и диссоциации комплекса ES соответственно; k₂ – константа скорости образования продукта реакции; K_i – константа ингибирования для быстрой обратимой стадии взаимодействия фермента с ингибитором; k₊ и k_– – константы скорости для медленной стадии ингибирования; k_P – константа преобразования физиологически активного продукта (P) в неактивные соединения (P*); λ – константа скорости инактивации фермент-субстратного комплекса в процессе реакции; k_d – константа скорости деградации фермента (принимаем, что это значение одинаково для всех форм фермента).

Схема предполагает постоянный приток активного фермента и его деградацию, инактивацию фермента в процессе реакции, превращение физиологически активного продукта в неактивные соединения и присутствие ингибитора, работающего по двухстадийному механизму. Полагаем, что концентрация субстрата регулируется внешними по отношению к исследуемой системе факторами, и в первом приближении концентрации субстрата и ингибитора считаем постоянными за время наблюдения (за исключением оговоренных случаев резкого изменения концентрации субстрата или ингибитора).

В механизме реакции присутствуют как быстрые стадии (в ходе измерения или моделирования мы наблюдаем только конечный результат взаимодействия, а не динамику процесса во времени), так и медленные стадии (можно наблюдать динамику процесса во времени). К быстрым стадиям относятся взаимодействие фермента с субстратом и первая стадия взаимодействия с ингибитором, а к медленным стадиям – преобразование продукта, вторая стадия взаимодействия фермента с ингибитором, синтез (приток) фермента, деградация фермента и инактивация фермента в процессе реакции.

Основные характеристики и механизмы действия фермента и ингибиторов получены из традиционных кинетических экспериментов в закрытых системах.

Быстрая инактивация фермент-субстратного комплекса (ES) в процессе реакции приводит к тому, что ферментативное превращение арахидоновой кислоты (S) в продукты ферментативной реакции (P) в условиях малого расходования субстрата в стационарном режиме в закрытых системах описывается следующим уравнением (см. работу Vrzheshch et al. [8]):

где [S]₀ – начальная концентрация субстрата, t – время протекания реакции, [S](t) – текущая концентрация субстрата в момент времени t, [P]_∞ – предельный выход продукта реакции (сумма концентраций P и продуктов его дальнейших превращений после полной инактивации фермента), Λ = k_d + + λ[S]/(K_m + [S]) – наблюдаемая константа скорости инактивации фермента в процессе реакции, k_d – константа скорости деградации фермента, K_m – константа Михаэлиса для реакции ферментативного превращения арахидоновой кислоты.

Линейная зависимость начальной скорости (V₀) ферментативной реакции и предельного выхода продукта реакции от общей концентрации фермента в закрытых системах позволяет получить число оборотов фермента до полной его инактивации – π_∞ (количество молекул продукта на одну молекулу фермента за время его работы до полной инактивации в процессе реакции, безразмерная величина):

где [E]₀ – общая концентрация фермента, добавляемого в реакционную систему.

В нашем случае с учетом [P]_∞ = V₀/Λ (см. работу Vrzheshch et al. [8]) и михаэлисовой зависимости V₀ от [S] (V₀ = k₂E₀[S]/(K_m + S)) получим:

Учитывая, что время наблюдения за реакцией в закрытой системе обычно лежит в пределах нескольких минут, и что эксперименты обычно проводятся при [S] ~ K_m, фактором деградации фермента можно пренебречь, и формула (3) упрощается:

что позволило нам определить из экспериментов в закрытых системах (см. “Эксперим. часть”) необходимые для моделирования в открытой системе значения K_m (6.35 мкМ), k₂ (60 с^–1), λ (0.084 с^–1) и π_∞ (714).

Наши кинетические эксперименты по ингибированию PGHS индометацином в закрытой системе (см. “Эксперим. часть”) подтвердили двухстадийную модель взаимодействия этого ингибитора с ферментом, в которой быстрая и медленная стадии полностью обратимы. Получены значения констант ингибирования для быстрой стадии (K_i = 27.7 мкМ) и констант скорости для медленной стадии (k₊ = 1.83 с^–1, k_– = 1.71 × 10^–3 с^–1).

В настоящей работе также моделировали действие необратимого ингибитора аспирина. Его характеристики, определенные в закрытых системах, взяли из работы Liu et al. [20]: константу ингибирования для быстрой обратимой стадии (K_i = = 4200 мкМ) и константу скорости для медленной необратимой стадии (k₊ = 0.0135 с^–1) при 20°C.

Для моделирования также использовали значения констант скорости первого порядка для процессов деградации фермента (k_d = 6.95 × 10^–5 с^–1) и распада физиологически активного продукта (k_P = 2.31 × 10^–3 с^–1). Эти характеристики были оценены с учетом времени полужизни глутаматдекарбоксилазы in vivo (2.77 ч [21] – наиболее “короткоживущий” фермент из представленных в работах [21–27]) и времени полужизни простагландинов G₂ и H₂ (~5 мин, [28]).

Моделирование открытой системы (схема 1 ) осуществляли путем аналитического решения соответствующих систем дифференциальных уравнений (см. дополнительные материалы к публикации).

Указанная система всегда стремится к единственному устойчивому стационарному состоянию. Достигшая стационарного состояния система в результате возмущения (изменения концентрации субстрата или ингибитора) переходит в нестационарное (переходное) состояние, и со временем (при указанных характеристиках это часы – рис. 1–3) система всегда приближается к новому стационарному состоянию.

В стационарном состоянии поток продукта реакции (скорость накопления продукта реакции (V_st)) оказался прямо пропорциональным потоку фермента (скорости синтеза фермента, V_E) с коэффициентом пропорциональности π_∞, который определен в формуле (2):

В присутствии медленного ингибитора, действующего по двухстадийному механизму (схема 1 ), π_∞ определяется следующим выражением:

Зависимость стационарного потока от концентрации субстрата принимает форму уравнения Михаэлиса–Ментен:

где $V_{{\max }}^{*}$ – наблюдаемое значение максимального потока продукта реакции, $K_{{\text{m}}}^{*}$ – наблюдаемое значение константы Михаэлиса для потока продукта реакции, $K_{{\text{i}}}^{*}$ – наблюдаемое значение константы ингибирования для потока продукта реакции.

Стационарный уровень продукта реакции (стационарная концентрация продукта реакции) прямо пропорционален его потоку:

Поскольку λ $ \gg $ k_d, получаем, что наблюдаемые значения максимального потока ($V_{{\max }}^{*}$) и константы Михаэлиса для потока продукта реакции ($K_{{\text{m}}}^{*}$) обратно пропорциональны значению константы скорости инактивации в процессе реакции. В частности, численное значение $K_{{\text{m}}}^{*}$ для потока продукта реакции в случае открытой системы в рассматриваемом случае на 3 порядка меньше значения K_m, определяемого в закрытой системе. Это не означает, что в открытой системе для фермента поменялось значение K_m – оно осталось тем же, но кинетическое поведение продуцируемого ферментом потока продукта реакции определяется $K_{{\text{m}}}^{*}$, в выражение для которой, в свою очередь, входит значение K_m (7). Величины K_m и $K_{{\text{m}}}^{*}$ имеют разный смысл, но их численные значения допустимо сравнивать во избежание недоразумений при интерпретации кинетического поведения фермента. Величина $K_{{\text{m}}}^{*}$ (5.25 × 10^–3 мкМ) говорит о том, что при концентрациях АА ~0.1 мкМ и выше поток простагландинов уже не зависит от концентрации АА (в обычных физиологических условиях концентрация АА in vivo составляет не более 0.1 мкМ, а возрастание концентрации до 1–10 мкМ и более – признак выраженного физиологического ответа организма [29]). Очевидно, использование численного значения K_m (6.35 мкМ) для интерпретации состояния фермента в организме будет приводить к недоразумениям.

В традиционных экспериментах по определению эффективности ингибиторов в закрытых системах медленные ингибиторы ведут себя как неконкурентные по отношению к AA [30]. Как видно из приведенных решений (7), в открытых системах подобных эффектов не наблюдается: ингибиторы медленного действия в потоке проявляют себя как полностью конкурентные, причем это верно и для обратимых, и для необратимых (k_– = 0) ингибиторов.

Анализ уравнений (7) показывает, что наличие ингибитора в открытой системе увеличивает амплитуду изменения стационарного потока продукта реакции (и, соответственно, уровня продукта реакции) в ответ на изменение концентрации AA (табл. 1). Это может играть важную роль в сложных регуляторных процессах в организме.

Нестационарные (переходные) состояния после возмущения открытой системы весьма интересны и могут отражать процессы, реально протекающие in vivo (рис. 1–3). Рассматривали варианты возмущения системы, находящейся в стационарном состоянии, при изменении концентрации ингибитора (рис. 1) или концентрации субстрата (рис. 2, 3). Момент возмущения системы во всех случаях соответствовал t = 0.

Концентрации AA для моделирования были подобраны таким образом, чтобы они соответствовали различным состояниям организма: обычным физиологическим условиям (0.01 мкМ [29]), выраженному физиологическому ответу (10 мкМ [29]), патологическому состоянию (500 мкМ [31]). Концентрации ингибиторов для моделирования были подобраны согласно данным фармакологических исследований. При максимальной разовой дозе индометацина (100 мг перорально) его пиковая концентрация в плазме составляла ~8 мкг/мл (~20 мкМ), а при минимальной дозе (25 мг перорально) – в ~10 раз меньше (~2 мкМ) [32]. При низкой разовой дозе аспирина (100 мг перорально) пиковая концентрация в плазме составляла 2.2 мкг/мл (~10 мкМ), а при высокой (1500 мг перорально) – 21.1 мкг/мл (~100 мкМ) [33].

Рис. 1а иллюстрирует влияние ингибиторов на открытую систему при физиологической концентрации АА. Новое стационарное состояние в случае индометацина достигается значительно быстрее, чем в случае аспирина. Это обусловлено разными значениями k₊ (1.83 с^–1 для индометацина, 0.0135 с^–1 для аспирина). При 2 мкМ индометацина (кривая 1) заметен двухфазный характер возмущения открытой системы под действием обратимого ингибитора: после достижения максимального ингибирования уровень продукта реакции повышается и достигает нового стационарного значения (соответствующее точное решение приведено в дополнительных материалах). Двухфазность обусловлена обратимостью медленной стадии ингибирования: возникающий после возмущения дополнительный поток расходования E, обусловленный формированием E*I, исчезает после достижения стационарной концентрации E*I.

Аспирин в выбранных концентрациях также уменьшает уровень продукта реакции, но в существенно меньшей степени. Это обусловлено различными значениями k₊, а также тем, что значение K_i для аспирина гораздо выше, чем для индометацина (4200 и 27.7 мкМ соответственно). В случае аспирина двухфазности не наблюдается. Это следствие необратимости данного ингибитора (см. табл. 2 в дополнительных материалах).

При повышении концентрации AA с 0.01 мкМ (рис. 1а) до 10 мкМ (рис. 1б) влияние ингибиторов на открытую систему существенно уменьшается – это следствие конкурентного характера ингибирования фермента в потоке (7). Для индометацина при 10 мкМ AA двухфазность выражена гораздо сильнее, чем при 0.01 мкМ AA, а для аспирина эффект ингибирования при повышенной концентрации субстрата практически отсутствует. При AA = 500 мкМ эффект ингибирования отсутствует и для индометацина, и для аспирина (данные не приведены).

Важная характеристика открытой системы – ее реакция на изменение концентрации субстрата. Уровень арахидоновой кислоты регулируется многими внешними по отношению к простагландиновому участку системами [34]. Повышение концентрации AA – своеобразный “маркер” протекания многих процессов, таких как воспаление [29].

При быстром повышении концентрации AA с физиологического уровня (0.01 мкМ) на 3 порядка (рис. 2) в отсутствие ингибитора наблюдается взрывной рост уровня продукта. Это обусловлено тем, что начальная концентрация AA сравнима с $K_{{\text{m}}}^{*}$ (7), и существенная доля молекул активного фермента при этих концентрациях не связана с субстратом. При увеличении концентрации AA на 3 порядка практически весь активный фермент связывается с субстратом, что приводит к быстрому повышению концентрации ES и, соответственно, повышению уровня продукта. В дальнейшем вследствие инактивации фермента в процессе реакции концентрация ES и, соответственно, уровень продукта снижаются до нового стационарного состояния.

Если же в открытой системе присутствует обратимый ингибитор индометацин (рис. 2а), картина меняется. В начальной фазе не наблюдается взрывного роста уровня продукта. Это обусловлено тем, что в стационарном состоянии значительная часть фермента связана с ингибитором и не может мгновенно катализировать реакцию при повышении уровня субстрата. Однако через несколько минут после возмущения системы уровень продукта реакции в присутствии 2 мкМ индометацина становится выше, чем в отсутствие ингибитора, и этот эффект наблюдается в течение ~1.5 ч (для 20 мкМ индометацина он менее выражен). Этот на первый взгляд парадоксальный факт объясняется тем, что при инкубации фермента с обратимым ингибитором накапливаются фермент-ингибиторные комплексы, и при существенном повышении концентрации субстрата фермент постепенно высвобождается из них, связываясь с субстратом, тем самым увеличивая поток продукта реакции. Таким образом, обратимый ингибитор ведет себя как “депо” для активного фермента. Для необратимого и гораздо более слабого ингибитора аспирина (рис. 2б) подобных эффектов не наблюдается.

Если моделировать ситуацию стремительного развития острого патологического процесса (рис. 3), в которой концентрация AA может достигать значений ~500 мкМ [31] (на рис. 3 предусмотрено возмущение открытой системы путем увеличения концентрации АА с 10 до 500 мкМ), то можно наблюдать следующее. В отсутствие ингибитора (кривая 1) уровень продукта реакции не изменяется в результате возмущения системы, потому что при 10 мкМ АА весь активный фермент уже связан с субстратом. Присутствие аспирина (кривые 4 и 5) не меняет картину. Однако в присутствии индометацина после возмущения системы уровень продукта реакции временно существенно повышается (это продолжается около часа, кривые 2 и 3), при этом эффект повышения более выражен при большей концентрации ингибитора, в отличие от рис. 2а. Это объясняется тем, что при таких высоких концентрациях субстрата индометацин практически не проявляет свои ингибирующие свойства из-за конкурентного характера ингибирования. Поэтому эффект “депо” для активного фермента здесь более выражен, чем при 10 мкМ AA (рис. 2а).

Особого внимания заслуживает зависимость константы Михаэлиса для стационарного потока ($K_{{\text{m}}}^{*}$) (7) от скорости инактивации фермента в процессе реакции. В отсутствие инактивации (λ = 0) $K_{{\text{m}}}^{*}$ равна определяемой в закрытых системах константе Михаэлиса для стационарной ферментативной кинетики (K_m). Инактивация PGHS в процессе реакции обусловливает низкое потоковое значение $K_{{\text{m}}}^{*}$, вследствие чего поток PG в рассматриваемом случае перестает зависеть от АА уже при физиологических концентрациях (10$K_{{\text{m}}}^{*}$ соответствуют ~0.05 мкМ АА), и при патологическом возрастании концентрации АА увеличиваться не будет. Следует отметить, что для открытых систем наряду со стационарными значениями потоков и концентраций важно обращать внимание на нестационарные состояния – “всплески” уровня продукта реакции при изменении концентраций ингибитора и субстрата. Как видно из рис. 2а и 3, во время этих нестационарных состояний можно наблюдать кажущееся парадоксальным повышение уровня продукта реакции в присутствии обратимого ингибитора. Также может иметь значение отмеченное увеличение амплитуды изменения уровня продукта реакции в стационарных состояниях открытой системы в присутствии конкурентных ингибиторов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали Tween-20, Трис, EDTA, диэтилдитиокарбамат натрия (DEDTC) (MP Biomedicals, Германия); индометацин, арахидоновую кислоту, ферроцианид калия, хлорид гемина, гидроксид натрия (Sigma-Aldrich, США); дитионит натрия, гидроксид калия (Panreac, Испания); пиридин (Merck, Германия); DMSO (ICN, Канада); соляную кислоту, этиловый спирт (Химмед, Россия).

Препарат фермента PGHS-1 получали из везикулярных желез барана согласно методике, опубликованной ранее [35], и хранили в специальном буферном растворе (50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0.5 мМ EDTA, 0.1 мМ DEDTC, 2 мкМ гемина, 0.1% (v/v) Tween-20) при –70°C [30]. Концентрация белка в полученном препарате составляла 0.5 мг/мл (измеряли бицинхониновым методом [36]).

Кинетические эксперименты. Во всех экспериментах по измерению циклооксигеназной активности фермента использовали буферный раствор A (50 мМ Трис-HCl, pH 8.0) c добавлением 0.1% (v/v) Tween-20, 1 мМ ферроцианида калия и 2 мкМ гемина. Ферментативную реакцию проводили в закрытой термостатируемой стеклянной ячейке с постоянным перемешиванием при 25°C. Объем реакционной смеси составлял 1.5 мл, объем добавляемого раствора фермента – 5–30 мкл.

Раствор арахидоновой кислоты (150 мМ) готовили в этиловом спирте и затем разбавляли буферным раствором A, содержащим эквивалент гидроксида калия, до 3.75 мМ; раствор ферроцианида калия (0.1 М) готовили в дистиллированной воде; раствор индометацина (5 мМ) готовили в смеси буферного раствора A и 15%-ного этилового спирта и затем разбавляли буферным раствором A до 0.03 мМ; раствор гемина (10 мМ) готовили в DMSO и разбавляли до 2 мМ буферным раствором A. Точную концентрацию гемина определяли спектрофотометрическим методом с использованием известных коэффициентов поглощения для восстановленного комплекса гемина с пиридином [37].

Эксперименты по взаимодействию фермента и ингибитора проводили согласно следующей схеме: в реакционную ячейку, содержащую буферный раствор A, Tween-20, ферроцианид калия и гемин, последовательно добавляли индометацин, фермент, а через определенный промежуток времени после добавления препарата фермента (время преинкубации) инициировали ферментативную реакцию субстратом (арахидоновой кислотой). В экспериментах, соответствующих нулевому времени преинкубации, изменяли порядок добавления арахидоновой кислоты и фермента.

Измерение параметров ферментативной реакции. Циклооксигеназную реакцию детектировали амперометрическим методом по изменению концентрации растворенного кислорода согласно ранее опубликованной методике [30]. Интегральные кривые (зависимости продукта реакции от времени) получали из исходных зависимостей концентрации кислорода от времени с учетом неферментативной реакции. Скорость неферментативной реакции определяли по линейной аппроксимации участка экспериментальной кривой перед инициацией реакции.

Для расчетов скорости реакции использовали аппроксимацию начального участка интегральной кривой. Диапазон аппроксимации начинался с t = 1 с (из-за фактора “мертвого времени” измерительной системы [30]) и составлял 5–15 с. Начальная скорость соответствует тангенсу угла наклона касательной к интегральной кривой при t = 0, определяемому из параметров аппроксимации.

Для расчета константы скорости инактивации фермента в процессе реакции использовали аппроксимацию первых 20–30 с интегральной кривой при 100 мкМ AA и отсутствии ингибитора по формуле (1).

Математическая обработка данных. Анализ экспериментальных данных и графическое представление теоретических зависимостей проводили с использованием пакета Origin 7.5 (OriginLab Corporation, США).

Совместную аппроксимацию массива экспериментальных данных (зависимостей скорости от времени преинкубации и концентрации ингибитора при различных концентрациях субстрата) проводили с помощью пакета MatLab (MathWorks, США). Значения искомых величин определяли при минимальном значении суммы квадратов отклонений скоростей (Sum):

где $V_{{\text{j}}}^{{\exp }}$ – экспериментально определенное значение относительной скорости (отношение скорости реакции к скорости в контрольной точке соответствующей экспериментальной серии, т.е. к скорости при 100 мкМ АА и при отсутствии ингибитора), $V_{{\text{j}}}^{{{\text{theor}}}}$ – соответствующее теоретически рассчитанное значение относительной скорости, вычисляемое по формуле: где K = k_–/k₊ – равновесная константа для медленной стадии ингибирования, τ – время преинкубации фермента с ингибитором до инициации реакции (также см. подпись к схеме 1 ).

Решение системы дифференциальных уравнений. Систему дифференциальных уравнений, соответствующую кинетической схеме 1 , решали аналитически. Правильность полученных решений и графических иллюстраций подтверждали численными расчетами с использованием пакета MatLab (MathWorks, США).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что свойства потоков в открытых по ферменту системах синтеза простагландинов (при наличии медленных обратимых ингибиторов и с учетом необратимой инактивации фермента в процессе реакции) демонстрируют качественно иное кинетическое поведение по сравнению со свойствами стационарных процессов в соответствующих закрытых системах. Наиболее значимый параметр, связывающий такие открытые и закрытые системы, – число оборотов фермента до полной его инактивации. Показано, что обратимые медленные ингибиторы в открытых системах могут выступать в роли депо для активного фермента, повышая на длительные периоды уровень простагландинов по сравнению с контролем в отсутствие ингибитора, а также могут существенно увеличивать амплитуду изменения уровня простагландинов в ответ на изменение концентрации арахидоновой кислоты. Эти свойства открытых систем синтеза простагландинов могут быть использованы при разработке стратегии применения нестероидных противовоспалительных препаратов для регуляции уровня и амплитуды модуляции уровня простагландинов.