Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 1, стр. 75-86

ВВЕДЕНИЕ

Пенициллины, относящиеся к группе бета-лактамных антибиотиков, широко используются в ветеринарной практике. Остаточные количества этих соединений могут присутствовать в продукции животного происхождения и поступать в организм человека, нанося существенный вред здоровью. Они могут спровоцировать серьезные аллергические реакции, привести к изменению микрофлоры кишечника, а также служить причиной возникновения резистентных штаммов микроорганизмов [1]. В Евразийском экономическом союзе и Евросоюзе установлены максимально допустимые уровни остатков бета-лактамов в непереработанной пищевой продукции животного происхождения. В частности, для пенициллина G, ампициллина (Amp) и амоксициллина (Amox) они составляют 4 мкг/кг в молоке и 50 мкг/кг в мясе [2, 3].

Для обеспечения биобезопасности продуктов питания предложены различные методы определения пенициллинов. Один из них – жидкостная хроматография с масс-селективной детекцией [4–6] – метод дорогостоящий, трудоемкий и длительный из-за сложной и продолжительной подготовки образцов перед анализом. Альтернативой ему выступают быстрые и относительно недорогие иммунохимические методы. Для их разработки и применения необходимы белковые реагенты (рецепторы или антитела), способные к высокочувствительному связыванию пенициллинов, а также высокомолекулярные производные этих антибиотиков как гаптенов – ферментные конъюгаты, иммуногены и конъюгированные антигены.

Белки, обладающие высоким специфическим сродством к пенициллинам, можно разделить на два вида. Первый – это пенициллин-связывающие белки (PBP), выполняющие у бактерий строительную и защитную функцию, такие как высокомолекулярная мембранная транспептидаза PBP2х из Streptococcus pneumonia R6 [7] и карбоксиконцевой фрагмент трансмембранного бета-лактамного рецептора BlaR-CTD из Bacillus licheniformis [8]. Эти белки распознают структуру антибиотика, включающую бета-лактамный цикл, и связывают различные бета-лактамы, относящиеся не только к пенициллинам, но и к цефалоспоринам. Такая широкая специфичность бактериальных PBP – главное преимущество при использовании в рецепторно-аналитических системах, однако она же и ограничивает их применение, поскольку максимально допустимые уровни пенициллинов и цефалоспоринов в продуктах питания существенно различаются [2, 3].

Другой вид белков, способных связывать пенициллины, представлен специфическими антителами к ним. Описано получение как поликлональных [9–13], так и моноклональных антител [14–16] к пенициллинам. Также получены антитела, которые распознают расщепленные гидролизом бета-лактамные антибиотики [13, 17]. Лишь в единичных случаях чувствительность к пенициллинам систем иммуноферментного анализа (ELISA), в которые включены упомянутые антитела, составляет ~1 нг/мл [10, 13, 16]. С учетом максимальных допустимых уровней бета-лактамов в продуктах питания такая чувствительность ELISA может быть недостаточной при определении пенициллина G, Amp и Amox в молоке, разведенном в 5–10 раз. При этом многократное разведение образца – зачастую единственный способ снижения неспецифического влияния его компонентов на взаимодействие антитело–антиген.

Удобный вариант иммунохимических и рецепторных систем – хроматографический анализ в формате тест-полосок. Описан иммунохроматографический анализ широкого спектра бета-лактамов с использованием PBP [18, 19] и специфического к Amp моноклонального антитела [20].

В литературе предложены разные подходы к получению конъюгатов бета-лактамных антибиотиков с белками. Описано использование кросс-линкеров, обеспечивающих алифатическую или ароматическую вставку между белком и антибиотиком [7, 9–11, 14, 15, 18], применение соединений, непосредственно (без линкеров) ковалентно связывающих антибиотик с белком [7–10, 12, 14, 15, 19], “физиологический” метод конъюгирования, в основе которого лежит высокая реакционная способность бета-лактамного цикла [7, 13, 14]. Каждый из этих методов не лишен недостатков. Так, использование глутарового альдегида ограничено высокой вероятностью сшивки полипептидных цепей белков и получения конъюгатов с нестабильными физико-химическими свойствами. Из-за наличия в структуре аминопенициллинов как карбоксильной, так и аминогруппы применение водорастворимого карбодиимида не гарантирует получение конъюгатов только по одной из групп. Иммунореагенты, синтезированные по “физиологическому” пути, не могут быть использованы в биоанализе на основе рецепторных белков, а применение их в анализе с участием специфических антител требует проводить пробоподготовку, обеспечивающую полное разрушение бета-лактамного цикла антибиотика в составе образца продукта [13, 17].

Цель данного исследования – разработка нового способа синтеза конъюгатов аминопенициллинов с белками, который основан на формировании устойчивой связи между белком и гаптеном, исключает возможность образования внутри- и межмолекулярных сшивок полипептидных цепей и не приводит к разрушению бета-лактамного кольца пенициллинов. В круг задач также входило получение высокоафинных к ампициллинам антител, которые в комбинации с синтезированными по предложенной методике конъюгатами могут быть использованы в высокочувствительных тест-системах ELISA для определения пенициллинов в продуктах питания.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез производных аминопенициллинов и их конъюгатов с белками. Предложен двухстадийный метод получения конъюгатов аминопенициллинов с использованием гомобифункциональных кросс-линкеров. Он заключается в синтезе N-гидроксисукцинимидных эфиров (OSu-эфиров) карбоксипроизводных аминопенициллинов и выделении их из реакционной среды с возможностью продолжительного хранения и последующего простого и быстрого конъюгирования с белками.

Один из использованных в работе кросс-линкеров – ди-N-гидроксисукцинимидный эфир терефталевой кислоты pPh(OSu)₂ – получали из соответствующего дихлорангидрида, к раствору которого в хлористом метилене добавляли 3.5-кратный избыток N-гидроксисукцинимида (NHS). В результате реакции, протекающей в присутствии основания, продукт pPh(OSu)₂ выпадал в виде белого осадка. Ди-N-гидриксисукцинимидный эфир адипиновой кислоты Ad(OSu)₂ синтезировали с использованием диизопропилкарбодиимида, который приливали к раствору смеси адипиновой кислоты и NHS в диоксане. Ad(OSu)₂ осаждали из реакционной среды диэтиловым эфиром после удаления осадка диизопропилмочевины, также образовавшейся в результате реакции. Структуры синтезированных кросс-линкеров подтверждены данными ЯМР- и масс-спектров. В спектре ¹Н-ЯМР pPh(OSu)₂ присутствуют сигналы протонов метиленовых групп сукцинимидного фрагмента (δ 2.92 м.д.) и бензольного кольца (δ 8.34 м.д.), в спектре ¹Н-ЯМР Ad(OSu)₂ – сигналы протонов метиленовых групп сукцинимидного фрагмента (δ 2.81 м.д.) и адипиновой кислоты (δ 1.68–1.74 и 2.74 м.д.). В масс-спектре синтезированных кросс-линкеров наблюдали пики, соответствующие молекулярным ионам [M + Na]⁺ и [2М + + Na]⁺.

Схема синтеза “линкерных” конъюгатов аминопенициллинов представлена на рис. 1. Структуры заместителя R и линкера X, а также характеристики использованных исходных реагентов и полученных производных антибиотиков приведены в табл. 1. На первой стадии растворы Amp или Amox в органическом растворителе добавляли к 1.1–1.2-кратному мольному избытку диэфира pPh(OSu)₂ или Ad(OSu)₂. О полноте протекания реакции судили по исчезновению окрашиваемого нингидрином пятна на пластинке для тонкослойной хроматографии. Из реакционной среды активированные эфиры Amp-pPh-OSu, Amp-Ad-OSu или Amox-pPh-OSu осаждали диэтиловым эфиром. В масс-спектрах полученных производных аминопенициллинов наблюдали протонированные молекулы [M + Н]⁺ и молекулярные ионы [M + Na]⁺ (табл. 1).

На второй стадии навески синтезированных производных аминопенициллинов растворяли в диметилформамиде (DMF), их 20-кратные мольные избытки добавляли к растворам пероксидазы из корней хрена (HRP) в 0.1 М NaHCO₃, рН 8.3 (объемная доля органического растворителя в конечной реакционной смеси не превышала 5%), и выдерживали в течение 16 ч при 4°С. Модификацию тироглобулина (TG) проводили в аналогичных условиях, используя существенно больший (670-кратный) мольный избыток Amp-pPh-OSu. В результате получены конъюгаты, в которых молекула Amp или Amox через шестичленый алифатический мостик или ароматическое ядро присоединена к аминогруппам остатков аминокислот полипептидной цепи белка. Степень включения антибиотиков в конъюгаты определяли после удаления избытков несвязавшихся реагентов, сравнивая масс-спектры исходных и модифицированных белков (табл. 1). Из-за слишком большой молекулярной массы TG вывод о его превращении в Amp-pPh-TG делали на основании существенного возрастания поглощения света раствором этого конъюгата в диапазоне 250–280 нм.

Следует отметить, что Cliquet et al. [14] уже использовали схожую вставку ароматического фрагмента между молекулами Amp и белка. Amp ацилировали OSu-эфиром 3-малеимидобензойной кислоты и добавляли к растворам бычьего сывороточного альбумина (BSA) или овальбумина, в молекулы которых предварительно в результате двухстадийной модификации были введены дополнительные сульфгидрильные группы. Предложенный нами метод синтеза конъюгатов аминопенициллинов с использованием ди-OSu-эфиров проще и быстрее, не требует продолжительной модификации белка и приводит к получению стабильных связей.

Синтез “безлинкерных” конъюгатов Amp-HRP и Amp-rhLF осуществляли по той же схеме (рис. 1), добавляя водорастворимый 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) к смеси Amp с HRP или рекомбинантным лактоферрином человека (rhLF). Синтез Amp-HSA проводили по ранее предложенной методике [19] через промежуточную стадию получения активированного эфира Amp в результате взаимодействия антибиотика с N-гидроксисульфосукцин-имидом (sNHS) в присутствии EDC, который затем добавляли к раствору сывороточного альбумина человека (HSA). Степень включения Amp, рассчитанная на основании масс-спектров конъюгатов и исходных белков, приведена в табл. 1.

Связывание низкомолекулярных производных и ферментных конъюгатов аминопенициллинов с PBP. Пенициллины – неустойчивые соединения из-за лабильности бета-лактамного кольца. Для того чтобы выяснить, происходит ли разрушение бета-лактамного цикла антибиотиков в условиях синтеза производных, проверяли их связывающую активность в отношении PBP, распознающего интактную бета-лактамную группировку. Ранее этот PBP использовали в непрямом рецепторном анализе в микропланшетном формате и рецепторно-хроматографической тест-системе для определения бета-лактамных антибиотиков [19]. В нашей работе с применением этого белка исследована устойчивость бета-лактамного кольца Amp в условиях ацилирования антибиотика диэфиром pPh(OSu)₂ (органический растворитель DMF, основание Et₃N, повышенная температура) и синтеза белковых конъюгатов (рН 8.3, 16 ч при 4°С). В табл. 2 приведены значения связывающей активности Amp и его производных, рассчитанные так, как описано в “Эксперим. части”. Обнаружено, что кратковременное нагревание до 50°С раствора Amp в DMF в присутствии основания Et₃N, выдерживание раствора антибиотика в течение 16 ч при 4°С в 0.1 М NaHCO₃ (рН 8.3) и ацилирование аминогруппы ди-N-гидроксисукцинимидным эфиром pPh(OSu)₂ не приводят к изменению взаимодействия Amp с PBP (связывающая активность находилось в пределах 95–105%, что соответствует допустимой вариации результатов биоанализа). В то же время после инкубации Amp в растворе с рН 8.3 при 37°С в течение более длительного времени, чем продолжительность синтеза, наблюдалось уменьшение связывания антибиотика в системе рецепторного анализа на 63%. Таким образом, показано, что ни на одном этапе синтеза низкомолекулярного производного Amp и его белковых конъюгатов не происходит разрушение бета-лактамного цикла.

В системе конкурентного рецепторного анализа провели сравнение характеристик связывания синтезированных пероксидазных конъюгатов аминопенициллинов. Для получения колориметрического сигнала A₄₅₀ в диапазоне 1.4–1.6 о.е. линкерные конъюгаты Amp-pPh-HRP, Amp-Ad-HRP и Amox-pPh-HRP использовали в концентрации 0.5 мкг/мл, а безлинкерный конъюгат Amp-HRP – 2.5 мкг/мл. Показано, что линкерные конъюгаты взаимодействуют с PBP в присутствии возрастающих количеств Amp одинаковым образом, отличающимся от характера связывания “прямого” конъюгата Amp-HRP. Аналитическая чувствительность модельных рецепторных систем с использованием линкерных конъюгатов или Amp-HRP составляла в среднем 0.11 и 0.25 нг/мл соответственно. В этих системах концентрация Amp, вызывающая 50%-ное ингибирование связывания пе-роксидазных конъюгатов (IC₅₀) Amp-pPh-HRP, Amp-Ad-HRP и Amox-pPh-HRP, в среднем составлялa 0.60 нг/мл, а при использовании Amp-HRP – 0.76 нг/мл (рис. 2). Такая разница может быть связана с частичным разрушением бета-лактамного кольца в ходе синтеза конъюгата Amp-HRP. Причиной также может выступать меньшая доступность антибиотика в составе конъюгата, в котором ампициллин напрямую связан с белком.

Иммуногенные конъюгаты аминопенициллинов в получении поликлональных антител. Синтезированные конъюгаты Amp-pPh-TG и Amp-rhLF использовали для наработки поликлональных антител к ампициллину в результате иммунизации двух групп кроликов. Для оценки иммуногенности конъюгатов полученные антисыворотки испытывали в биоаналитической системе непрямого ELISA, включающей иммобилизованный на твердой фазе безлинкерный конъюгат Amp-HSA с низким включением антибиотика, а также Amp в возрастающих концентрациях и антисыворотки в различных разведениях. Для выявления количества связавшихся специфических антител использовали ферментный конъюгат антител козы против иммуноглобулинов кролика и цветную реакцию окисления TMB в присутствии Н₂О₂, катализируемую HRP. Интенсивность детектируемого сигнала A₄₅₀ зависела от содержания анти-Amp-антител в образце антисыворотки и концентрации Amp в жидкой фазе системы. Установленные параметры непрямого ELISA в сравнении с литературными данными [12] приведены в табл. 3. Рабочий титр антисывороток, полученных в результате иммунизации конъюгатом Amp-pPh-TG, оказался в ~3 раза выше, чем в случае использования в качестве иммуногена Amp-rhLF.

Повышенная иммуногенность первого конъюгата может быть связана с природой белка-носителя. Ранее группой ученых было показано, что использование TG для получения антител к Amp предпочтительнее применения белков с меньшей молекулярной массой, таких как BSA или овальбумин [14]. Мы подтвердили ранее установленный факт, что введение в молекулу иммуногена ароматического линкера между Amp и белком-носителем не мешает наработке специфических анти-Amp-антител [14]. Более того, нами показано, что использование иммуногена такой структуры способствует формированию антител с высокой чувствительностью к пенициллинам.

Ранее исследователи обращали внимание на то, что в группе кроликов только отдельные особи активно отвечают на введение иммуногена, содержащего ампициллин [9, 10]. Нами также обнаружено, что чувствительность продуцируемых антител к Amp в непрямом ELISA существенно различалась не только между группами кроликов, но и внутри группы, иммунизированной одним и тем же конъюгатом. Так, в случае иммуногена Amp-rhLF аналитическая чувствительность анализа варьировалась в диапазоне 2–20 нг/мл, а при введении конъюгата Amp-pPh-TG – в диапазоне 0.1–1.0 нг/мл.

Следует отметить, что нами получены антитела, характеризующиеся групповой специфичностью к пенициллинам, с помощью которых в одном анализе может быть определено суммарное содержание по меньшей мере трех антибиотиков пенициллинового ряда: ампициллина, пенициллина G и амоксициллина (другие члены ряда не испытывались). При иммунизации кроликов конъюгатом, синтезированным с использованием в качестве кросс-линкера глутарового альдегида [9, 10], получены антитела со схожей групповой специфичностью, однако по параметру “чувствительность” они существенно уступают лучшим поликлональным антителам, описанным в данной работе.

Поликлональные антитела и пероксидазные конъюгаты в прямом ELISA. Иммуноаналитические свойства синтезированных пероксидазных конъюгатов аминопенициллинов изучены в модельных гетерофазных системах прямого взаимодействия с биоспецифически иммобилизованными антителами из антисывороток к Amp-pPh-TG и Amp-rhLF. В случае антисыворотки к Amp-pPh-TG (рис. 3а) конъюгаты, содержащие линкеры, использовали в концентрации 0.07 мкг/мл, безлинкерный конъюгат Amp-HRP – в концентрации 0.25 мкг/мл. Аналитическая чувствительность составила в среднем 0.03 нг/мл для всех ферментных конъюгатов (описание расчета приведено в “Эксперим. части”). Параметр IC₅₀ варьировался от 0.20 до 0.40 нг/мл, причем его максимальное значение наблюдали в случае использования конъюгата Amp-pPh-HRP. Для этого же конъюгата отмечено, что в конце калибровочного графика его связывание с антителами составило 40% от максимального. В то же время конъюгаты Amp-Ad-HRP, Amox-pPh-HRP и Amp-HRP вытеснялись Amp в концентрации 2 нг/мл на 70–80%.

Определено, что синтезированные линкерные конъюгаты Amp-pPh-HRP, Amp-Ad-HRP и Amox-pPh-HRP взаимодействуют с антителами из антисыворотки к Amp-rhLF схожим образом (рис. 3б). Ферментный конъюгат Amp-pPh-HRP использовали в прямом ELISA в концентрации 0.3 мкг/мл, конъюгаты Amp-Ad-HRP и Amox-pPh-HRP – в концентрации 0.5 мкг/мл. Чувствительность анализа составила 2.0 нг/мл, величина IC₅₀ была 17–20 нг/мл. Совпадающий по общей структуре с иммуногеном конъюгат Amp-HRP, взятый в концентрации 0.3 мкг/мл, образовывал комплексы с антителами к Amp-rhLF, однако не вытеснялся из них даже при использовании ампициллина в концентрации 1 мкг/мл.

Таким образом, показано, что прямой ELISA с использованием антител к Amp-pPh-TG чувствительнее непрямого анализа (табл. 3). Результаты, полученные в прямом ELISA (рис. 3), подтвердили, что антитела из антисыворотки к Amp-pPh-TG более чувствительны к антибиотикам группы пенициллинов, чем поликлональные антитела из антисыворотки к Amp-rhLF. Кроме того, нами, как и ранее Wang et al. [21], продемонстрировано, что гетерологичные конструкции иммуногена и конъюгированного антигена, отличающиеся по структуре гаптена, использованного для их синтеза, обеспечивают лучшие параметры иммуноанализа. Причем в случае антисыворотки к Amp-pPh-TG этот эффект наблюдали как при изменении линкера между гаптеном и белком, так и при сохранении линкерного фрагмента неизменным и переходе от Amp к Amox.

В наиболее чувствительной из использованных модельных систем прямого ELISA определили динамику продуцирования специфических поликлональных антител и провели контроль их антиген-связывающей активности (связывание ферментного конъюгата и IC₅₀) при введении кролику иммуногена Amp-pPh-TG (рис. 4). Показано, что антисыворотка с лучшими характеристиками связывания получена по истечении 33 недель с начала иммунизации, т.е. после десятого введения иммуногена. При дальнейшей иммунизации чувствительность и специфичность антител в антисыворотке остались на прежнем уровне, концентрация специфических антител не увеличилась. Ранее в литературе также сообщалось о необходимости продолжительной иммунизации кроликов для получения антител, специфических к пенициллинам [10]. Однако опубликованы и сведения о возможности быстрого получения антисыворотки с высоким титром [12], но с низкой аналитической чувствительностью (~5.0 нг/мл).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали ампициллина тригидрат, амоксициллина тригидрат, натриевую соль пенициллина G, BSA, EDC, sNHS, NHS, дихлорангидрид терефталевой кислоты, адипиновую кислоту, диизопропилкарбодиимид, DMF, триэтиламин, TMB, полный адъювант Фрейнда, Tween-20, антитела козы против иммуноглобулинов кролика, меченые HRP (Sigma-Aldrich, США), HRP (Pan-reac Quimica SLU, Испания). PBP – рекомбинантный аналог природного рецептора PBP2x из Streptococcus pneumoniae R6 и моноклональное антитело к нему приобретены у Glory Sciences Co., Ltd, КНР (www.glorybios.com).

TG, выделенный из экстрактов послеоперационной ткани щитовидной железы человека, и два типа очищенных антител овцы против иммуноглобулинов мыши и кролика получены от УП “ХОП ИБОХ НАН Беларуси”. HSA предоставлен РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий (Республика Беларусь). rhLF выделен и очищен в Институте микробиологии НАН Беларуси из молока коз-продуцентов, трансгенных по гену лактоферрина человека.

Соли, основания, кислоты и органические растворители белорусских и российских производителей имели классификацию не ниже ч.д.а. Буферные растворы готовили на деионизированной воде с удельным электрическим сопротивлением 17–18 МОм см, полученной в модульной системе очистки воды Arium^® pro VF (Sartorius, Германия).

Пероксидазные конъюгаты аминопенициллинов очищали на колонке с Superose 12 (1.0 × × 30.0 см), уравновешенной 0.15 М NaCl, при скорости потока 12 мл/ч в автоматическом режиме на установке для быстрой хроматографии белков (Pharmacia Biotech, Швеция).

ELISA выполняли в разборных микропланшетах из полистирола, состоящих из двенадцати 8‑луночных полосок (стрипов), купленных у Greiner Bio-One (Германия) или ООО “Хема-медика” (Россия).

Спектры ¹H- и ¹³С-ЯМР регистрировали на приборе AVANCE 500 (Bruker BioSpin Gmbh, Германия) в d₆-ДМСО. Химические сдвиги определяли относительно остаточных сигналов растворителей. Масс-спектры OSu-эфиров получали с использованием масс-селективного детектора Agilent 6410 Triple Quad в комплекте с жидкостным хроматографом Agilent 1200 SL (Agilent Technologies, Inc., США). Определение молекулярных масс белков и их конъюгатов методом масс-спектрометрии проводили с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометра Microflex LRF System (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Измерение колориметрического сигнала в лунках микропланшета проводили с помощью приборов АИФ М/340 (ОАО “Витязь”, Беларусь) и iMark™ (Bio-Rad Laboratories Inc., США).

Бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)терефталат, pPh(OSu)₂. К охлажденному на бане со льдом раствору 1.00 г (4.9 ммоль) дихлорангидрида тере-фталевой кислоты в 30 мл хлористого метилена добавляли 2.00 г (17.4 ммоль) NHS и 2.4 мл (17.4 ммоль) триэтиламина. Перемешивали 30 мин при охлаждении и 48 ч при 20–25°С. Выпавший осадок pPh(OSu)₂ отфильтровывали, промывали 5 мл хлористого метилена, суспендировали в 20 мл этого растворителя, опять отфильтровывали и высушивали в вакуумном эксикаторе с P₂O₅ при 20–25°С. Получили 1.37 г (78%) диэфира pPh(OSu)₂. Масс-спектр: m/z 383.0 [M + Na]⁺, 743.1 [2M + Na]⁺. C₁₆H₁₂N₂O₈. Вычислено: 360.1. Спектр ¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ: 2.92 (8H, c, 2 × –ОС–СН₂–СН₂–СО–), 8.34 (4H, c, 4 × CH). Спектр ¹³С-ЯМР (ДМСО-d₆) δ: 25.6, 130.1, 131.0, 161.0, 170.2.

Бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)адипинат, Ad(OSu)₂. К раствору 0.44 г (3.0 ммоль) адипиновой кислоты в 15 мл диоксана добавляли 0.73 г (6.3 ммоль) NHS, перемешивали при охлаждении на ледяной бане в течение 10 мин и вносили 0.97 мл (6.3 ммоль) диизопропилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивали 1 ч при 10–15°С и 20 ч при 20–25°С. Выпавший осадок ди-изопропилмочевины отфильтровывали, из фильтрата отгоняли значительную часть растворителя и добавляли диэтиловый эфир. В результате выпадал ди-N-гидроксисукцинимидный эфир Ad(OSu)₂, который повторно растворяли в диоксане и опять осаждали диэтиловым эфиром. Н-адосадочную жидкость сливали, целевое соединение высушивали в вакуумном эксикаторе с P₂O₅ при 20–25°С. Получили 0.57 г (56%) диэфира Ad(OSu)₂. Масс-спектр: m/z 363.1 [M + Na]⁺, 703.2 [2M + Na]⁺. C₁₄H₁₆N₂O₈. Вычислено: 340.1. Спектр ¹Н-ЯМР (d₆-ДМСО) δ: 1.68–1.74 (4Н, м, 2 × –ООС–CH₂–СН₂–), 2.74 (4Н, т, J 6.1 Гц, 2 × × (–ООС–СН₂–)), 2.81 (8Н, с, 2 × (–ОС–СН₂–СН₂–СО–)). Спектр ¹³С-ЯМР (d₆-ДМСО) δ: 23.3, 25.5, 29.7, 168.8, 170.3.

OSu-эфиры аминопенициллинов. К раствору 50.0 мг (139 мкмоль) pPh(OSu)₂ или 50.0 мг (147 мкмоль) Ad(OSu)₂ в 2 мл DMF добавляли 50.0 мг (124 мкмоль) ампициллина тригидрата. Затем приливали 50 мкл (360 мкмоль) триэтиламина и перемешивали реакционную смесь в течение 3 ч. За ходом реакции следили по тонкослойной хроматографии в системе этилацетат–метанол–уксусная кислота 4 : 2 : 1, проявляли пластинки УФ-светом и раствором нингидрина в н-бутаноле. Растворитель упаривали при 50°С, остаток растворяли в метаноле и осаждали продукт диэтиловым эфиром. Надосадочную жидкость сливали, осадок промывали диэтиловым эфиром и высушивали в вакуумном эксикаторе с P₂O₅ при 20–25°С. Выход составил 71 и 90% для Amp-pPh-OSu и Amp-Ad-OSu соответственно.

Синтез производного Amox проводили аналогичным образом, используя 50.0 мг (119 мкмоль) амоксициллина тригидрата и 50.0 мг (139 мкмоль) pPh(OSu)₂. Выход Amox-pPh-OSu составил 76%.

Выделенные OSu-эфиры аминопенициллинов использовали для синтеза конъюгатов без дополнительной очистки.

Пероксидазные конъюгаты Amp-pPh-HRP, Amp-Ad-HRP и Amox-pPh-HRP. К 0.5 мл раствора 2.0 мг (46 нмоль) HRP в 0.1 М NaHCO₃ приливали 25 мкл раствора 0.55 мг (920 нмоль) Amp-pPh-OSu, 0.53 мг (920 нмоль) Amp-Ad-OSu или 0.56 мг (920 нмоль) Amox-pPh-OSu в DMF. Перемешивали и инкубировали в течение 16 ч при 4°С. Очистку пероксидазных конъюгатов Amp-pPh-HRP, Amp-Ad-HRP и Amox-pPh-HRP проводили гель-фильтрацией на колонке с Superose 12 в режиме быстрой хроматографии белков.

Иммуноген Amp-pPh-TG. К 6.0 мл 28.0 мг (42 нмоль) раствора TG в 0.1 М NaHCO₃ добавляли 16.7 мг (28 мкмоль) Amp-pPh-OSu в 0.3 мл DMF. Перемешивали и инкубировали 4 ч при 20–25°С, очищали обессоливанием на Sephadex G-25, уравновешенной 0.15 М NaCl.

Конъюгаты Amp-HRP и Amp-rhLF синтезировали по методикам, предложенным ранее [7, 9, 12], с некоторыми модификациями. К раствору 2.0 мг (46 нмоль) HRP в 0.1 М MES-буфере (рН 6.0) и 0.15 М NaCl добавляли 2.0 мг (5.0 мкмоль) ампициллина тригидрата и 2.0 мг (10 мкмоль) EDC. Инкубировали в течение 16 ч при 4°С, затем очищали гель-фильтрацией в автоматическом режиме. Иммуноген Amp-rhLF получали аналогичным образом, очищали обессоливанием на колонке с Sephadex G-25, уравновешенной 0.15 М NaCl.

Конъюгат Amp-HSA синтезировали по ранее предложенной методике [19], используя 0.8 мг (2.3 мкмоль) Amp, 0.7 мг (3.7 мкмоль) EDC, 0.8 мг (3.7 мкмоль) sNHS и 15 мг (0.2 мкмоль) HSA. Очистку конъюгата проводили хроматографией на колонке с Sephadex G-25, уравновешенной 0.02 М натрий-фосфатным буфером (PBS).

Буферные растворы. PBS содержал 0.05 М раствор смеси гидро- и дигидрофосфата натрия (рН 7.4) и 0.15 М NaCl. Блокирующий буферный раствор приготовлен на основе PBS, содержал 5 г/л BSA. Раствор для иммобилизации специфических антител и проведения ELISA включал PBS, 1 г/л BSA, 0.02% Tween-20. Буфер для промывания лунок планшета содержал PBS и 0.02% Tween-20. Хромоген-субстратную смесь готовили, добавляя одну часть 0.4 мМ раствора TMB в диметилсульфоксиде к 20 частям 3.0 мМ Н₂О₂ в 0.04 М натрий-цитратном буфере (рН 4.0). Стоп-раствор представлял собой 1 М H₂SO₄.

Рецепторный анализ. В лунки полистирольного планшета вносили по 100 мкл 5 мкг/мл раствора антител овцы к иммуноглобулинам мыши в 0.1 М NaHCO₃. Инкубировали 16 ч при 4°С, затем содержимое лунок удаляли, лунки промывали, вносили в них по 200 мкл блокирующего буферного раствора и снова инкубировали 16 ч при 4°С. Далее раствор из лунок выливали, вносили по 100 мкл моноклонального антитела к PBP в концентрации 2 мкг/мл в буферном растворе и проводили иммунохимическую иммобилизацию антитела, выдерживая планшет в течение 16 ч при 4°С. Затем раствор из лунок удаляли и вносили 50 мкл растворов Amp в диапазоне концентраций 0.1–4.0 нг/мл, 25 мкл растворов синтезированных пероксидазных конъюгатов в подобранном разведении и 25 мкл 0.25 мкг/мл раствора PBP. Проводили инкубацию в течение 1 ч при 20–25°С, промывали лунки моющим буфером, вносили по 100 мкл хромоген-субстратной смеси, инкубировали 15 мин при 20–25°С, затем добавляли по 100 мкл стоп-раствора. Измеряли оптическую плотность растворов в лунках при 450 нм.

Проверка устойчивости бета-лактамного кольца в условиях получения производных аминопенициллинов. В ходе синтеза эфира Amp-pPh-OSu отбирали по 10 мкл реакционной среды, из которой готовили растворы с концентрациями Amp 0.1–4.0 нг/мл. Растворы с такими же концентрациями Amp готовили из растворов 50 мкг/мл Amp в воде или 0.1 М NaHCO₃, предварительно выдержанных в течение 1 месяца при –20°С, 16 ч при 4°С или 16 ч при 37°С. Приготовленные растворы Amp и его производных использовали в рецепторном анализе, описанном выше. Рассчитывали связывающую активность относительно свежеприготовленного раствора Amp по формуле для расчета CR, как описано ниже в подразделе “Аналитические характеристики биоанализа”, используя в качестве соединения X ампициллин, подвергнутый воздействию исследуемых условий.

Получение антисыворотки к Amp. Использовали половозрелых самок кроликов породы шиншилла весом 2.5 кг, которых содержали в условиях вивария. Две группы животных по три особи в каждой иммунизировали синтезированными конъюгатами Amp-pPh-TG или Amp-rhLF. В первую иммунизацию подкожно в область шеи вводили по 1.0 мг иммуногена в 1 мл смеси равных объемов 0.15 М NaCl и полного адъюванта Фрейнда. Через 2–3 недели повторно подкожно вводили по 0.5 мг конъюгированного антигена в 0.5 мл смеси равных объемов 0.15 М NaCl и неполного адъюванта Фрейнда. Последующие инъекции конъюгатов в неполном адъюванте Фрейнда проводили с интервалом 4–6 недель, забор крови осуществляли на 7–10-й день после иммунизации. Кровь отбирали из краевой вены уха в пробирки с активаторами свертывания. Сыворотку отделяли центрифугированием. Титр антисыворотки в ELISA определяли как кратность ее разведения, при которой колориметрический сигнал A₄₅₀ составлял 1.2–2.0 о.е.

Система непрямого ELISA. Конъюгат Amp-HSA иммобилизовали на внутренней поверхности лунок полистирольного микропланшета из 100 мкл раствора с концентрацией 0.25 мкг/мл в 0.01 М NaHCO₃ путем инкубации в течение 18 ч при 4°С. Затем содержимое лунок планшета удаляли и вносили по 150 мкл блокирующего буфера, инкубировали в течение 18 ч при 4°С. В лунки вносили по 50 мкл раствора Amp в диапазоне концентраций 0.01–1000 нг/мл и по 50 мкл раствора антисыворотки в титре от 1 : 5000 до 1 : 100 000. Инкубировали в течение 1 ч при 37°С, затем лунки промывали, вносили в них по 100 мкл пероксидазного конъюгата антител козы к иммуноглобулинам кролика и проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С. После промывки твердой фазы в лунки добавляли по 100 мкл хромоген-субстратной смеси, выдерживали в течение 15 мин при 20–25°С и добавляли 100 мкл стоп-раствора. Измеряли оптическую плотность растворов в лунках при 450 нм.

Система прямого ELISA. В лунки полистирольного планшета вносили по 100 мкл 5 мкг/мл раствора антител овцы к иммуноглобулинам кролика в 0.1 М растворе NaHCO₃ и инкубировали в течение 16 ч при 4°С. Затем содержимое лунок планшета удаляли, промывали лунки моющим буфером, вносили по 200 мкл блокирующего буфера и инкубировали в течение 16 ч при 4°С. Далее содержимое лунок удаляли, вносили по 100 мкл антисыворотки кролика к Amp-pPh-ТG в титре 1 : 50 000 или антисыворотки к Amp-rhLF в титре 1 : 20 000, инкубировали в течение 16 ч при 4°С. Лунки планшета промывали, добавляли по 50 мкл растворов Amp в диапазоне концентраций 0.03–1000 нг/мл и 50 мкл растворов синтезированных пероксидазных конъюгатов аминопенициллинов. Инкубировали 1 ч при 20–25°С, затем лунки промывали, вносили в них по 100 мкл хромоген-субстратной смеси, выдерживали в течение 15 мин при 20–25°С и добавляли по 100 мкл стоп-раствора. Измеряли оптическую плотность растворов в лунках при 450 нм.

Аналитические характеристики биоанализа. Аналитическую чувствительность определяли как концентрацию Amp в нг/мл, при которой связывание пероксидазного конъюгата аминопенициллина или твердофазного антигена Amp-HSA с PBP или специфическими поликлональными антителами отличается от 100% на троекратную величину ошибки измерения B₀: (B₀ – 3 SD). Параметр IC₅₀ находили как концентрацию раствора Amp, при внесении которого в лунки происходит 50%-ное ингибирование связывания PBP или анти-Amp-антител с конъюгатами Amp или Amox, выражающееся в уменьшении колориметрического сигнала в 2 раза по сравнению с лункой, не содержащей антибиотик. CR вычисляли по следующему уравнению:

где CR(X) – перекрестная реактивность PBP или специфических поликлональных антител к соединению Х; IC₅₀(Amp) – концентрация Amp, вызывающая снижение связывания PBP или специфических поликлональных антител с конъюгатом Amp на 50%, нг/мл; IC₅₀(X) – концентрация соединения X, вызывающая снижение связывания PBP или специфических поликлональных антител с конъюгатом Amp на 50%, нг/мл.

Все биоаналитические параметры измеряли не менее чем в трех повторах. Обработку данных проводили с помощью программы Microsoft Excel. На рис. 2 и 4 планки погрешностей обозначают среднеквадратичное отклонение (SD), p < 0.05.

Если у читателей возникнет интерес к конъюгатам или антителам, полученным в данной работе, просим обращаться с запросами о передаче бесплатных образцов к автору для связи.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате реакции ацилирования Amp и Amox ди-OSu-эфирами дикарбоновых кислот получены новые активированные эфиры карбоксипроизводных аминопенициллинов. С их использованием по простой методике с образованием устойчивой амидной связи синтезированы конъюгаты, в которых антибиотик и белок разделены ароматическим или алифатическим фрагментом. Установлено, что в ходе синтеза низкомолекулярных производных аминопенициллинов и в условиях дальнейшего получения белковых конъюгатов по предложенному методу не происходит разрушение бета-лактамного кольца антибиотика.

Проведено сравнение новых пероксидазных конъюгатов с алифатической или ароматической вставкой между антибиотиком и белком Amp-pPh-HRP, Amp-Ad-HRP, Amox-pPh-HRP с конъюгатом, синтезированным в этой же работе путем прямого (безлинкерного) присоединения аминопенициллина непосредственно к остаткам аминокислот полипептидной цепи белка Amp-HRP. Методом рецепторного анализа выявлено, что PBP лучше взаимодействует с линкерными конъюгатами, чем с продуктами прямого присоединения аминопенициллинов к белку-носителю. Модельные рецепторные системы, включающие конъюгаты Amp-pPh-HRP, Amp-Ad-HRP или Amox-pPh-HRP, дают возможность определять пенициллины с большей чувствительностью, чем система с конъюгатом Amp-HRP.

Важно отметить, что системы рецепторного биоанализа на основе PBP и пероксидазных конъюгатов аминопенициллинов в форме готовых наборов реагентов могут применяться на практике для скрининговых исследований содержания широкого спектра бета-лактамов (пенициллинов и цефалоспоринов) в различных продуктах животного происхождения.

Антитела, полученные в результате продолжительной иммунизации кроликов конъюгатом Amp-rhLF (молекулярная масса белка-носи-теля – 80 кДа), имели низкую чувствительность в ELISA и чрезвычайно высокое сродство к конъюгату Amp-HRP. Для получения высокоаффинной антисыворотки с большим содержанием специфических к пенициллинам антител потребовалась иммунизация в течение такого же промежутка времени синтезированным линкерным конъюгатом Amp-pPh-TG на основе белка с молекулярной массой 660 кДа. Эти поликлональные антитела также проявляли несколько большее сродство к пероксидазному конъюгату, схожему по структуре с иммуногеном, чем к остальным конъюгатам.

Показано, что в системе прямого ELISA с иммунохимически иммобилизованными поликлональными антителами (иммуноген – Amp-pPh-TG) и конъюгатом Amp-Ad-HRP в жидкой фазе Amp достоверно определяется в диапазоне концентраций 0.03–2.00 нг/мл, т.е. на порядок с более высокой чувствительностью, чем в иммуноаналитических системах, описанных в научной литературе.

Разработанная нами система может служить прототипом набора реагентов для ультрачувствительного двухстадийного (биоспецифическое связывание и колориметрическая детекция) прямого ELISA для выявления пенициллинов в пищевых продуктах.