1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 48, № 3, 2022

Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 3, стр. 279-295

Методы получения моноклональных антител для терапии и профилактики вирусных инфекций

Ю. А. Меркульева 1, *, Д. Н. Щербаков 1, А. А. Ильичев 1

1 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор” Роспотребнадзора, Центр геномных исследований мирового уровня по обеспечению биологической безопасности и технологической независимости в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий
630559 Новосибирская обл., Кольцово, Россия

* E-mail: j.a.merkulyeva@gmail.com

Поступила в редакцию 18.05.2021
После доработки 07.06.2021
Принята к публикации 17.06.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Вирусная угроза может возникнуть неожиданно и где угодно, быстро перейти в стадию эпидемии или пандемии, и тогда потребуется в короткие сроки разработать эффективные средства терапии и профилактики. Разработка вакцины занимает десятилетия, а применение противовирусных соединений часто малоэффективно и небезопасно. Быстрым ответом может быть использование иммунных сывороток переболевших лиц, однако ряд сложностей, связанных с их использованием, заставил исследователей переключиться на разработку более безопасных и эффективных препаратов на основе моноклональных антител (мАТ). Для того чтобы обеспечить защиту, подобные препараты должны обладать ключевой характеристикой – нейтрализующими свойствами, т.е. способностью блокировать заражение клеток вирусом. В настоящее время в арсенале исследователей имеется ряд подходов для получения мАТ, однако ни один из них нельзя назвать эталоном, каждый подход имеет собственные достоинства и недостатки. Выбор того или иного метода зависит как от особенностей вируса, так и от временных и технических ограничений. В предлагаемом обзоре проведен сравнительный анализ современных методов получения нейтрализующих мАТ, описаны актуальные тенденции дизайна антител для терапии и профилактики вирусных заболеваний.

Ключевые слова: моноклональные антитела, вирусные инфекции, гибридомная технология, дисплейные методы, сортировка В-клеток

СОДЕРЖАНИЕ

МЕХАНИЗМЫ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСНЫХ ПАТОГЕНОВ АНТИТЕЛАМИ..............280

ИСТОЧНИК МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ……………………….....................................282

МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ………283

Дисплейные методы……………........................285

Сортировка единичных В-клеток и клонирование генов VH/VL.............................................287

Иммортализация В-клеток…………………......287

Культуры одиночных В-клеток………………….288

Новое поколение методов: высокопроизводительное секвенирование, протеомика и вычислительные технологии.......................................289

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДИЗАЙН АНТИТЕЛ......290

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………................292

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………….292

ВВЕДЕНИЕ

Более века назад сыворотки крови человека и животных начали использовать для терапии и профилактики инфекционных заболеваний. Несмотря на успехи серотерапии, надежды на “волшебную пулю” оправдали себя не полностью. Так, сыворотки часто обладали слабой эффективностью, поскольку кроме специфичных антител содержали большое количество неспецифичных иммуноглобулинов и других белков, приводящих к нежелательным эффектам в виде анафилактического шока или сывороточной болезни.

С появлением вакцин и антибиотиков серотерапия существенно сдала свои позиции. Спустя десятилетия антитела вновь заявили о себе после разработки G. Köhler и C. Milstein гибридомной технологии получения моноклональных антител (мАТ) [1]. мАТ представляют собой иммуноглобулины, вырабатываемые клетками одного клона и связывающиеся с конкретным эпитопом целевого антигена. Использование мАТ исключало недостатки серотерапии, однако первые мАТ были получены из клеток мышей и потому часто вызывали иммунную реакцию при введении человеку. Позже благодаря развитию методов генной инженерии появилась возможность получать гуманизированные (химерные) мАТ [2]. Это в существенной степени снимало проблему нежелательного иммунного ответа.

Впоследствии новые технологии открыли возможность для получения мАТ человека, а также позволили менять биологические и физико-химические свойства антител и получать их варианты, которые не способна вырабатывать иммунная система.

Текущие активные разработки в области мАТ в существенной степени направлены на лечение онкологических заболеваний. В то же время вирусные заболевания, для которых нет доступных вакцин (например, ВИЧ-инфекция, лихорадки Ласса и Зика), заболевания, для которых эффективность противовирусных препаратов недостаточно выражена (COVID-19, грипп, бешенство и ряд других), также выступают объектом внимания многих ученых во всем мире [3].

На сегодняшний день ВОЗ и FDA одобрили к применению шесть препаратов на основе противовирусных мАТ (табл. 1). Несмотря на то, что первым одобренным мАТ был Palivizumab против респираторно-синцитиального вируса [4], все последующие разработки были сосредоточены на неинфекционных заболеваниях. Ежегодно десятки и сотни препаратов антител получали одобрение, но ни одного противовирусного мАТ одобрено не было. Однако в 2018 г. противовирусные антитела вновь заявили о себе. Впервые после долгого перерыва одобрен противовирусный препарат мАТ для лечения ВИЧ-инфекции, а в 2020 г. – сразу два препарата мАТ против вируса Эболы [5–8]. В 2020 г. FDA были одобрены мАТ Bamlanivimab и коктейль антител REGEN-COV для экстренного использования против новой коронавирусной инфекции COVID-19. Позже при расширенном исследовании было показано, что Bamlanivimab непригоден в качестве монотерапии (отмена разрешения FDA в апреле 2021 г.), но эффективен при совместном введении с Etesevimab [9–12]. Появление препаратов мАТ против SARS-CoV-2 стало опытом быстрой и эффективной разработки мАТ в условиях экстренной угрозы и напоминанием об эффективности терапии мАТ для лечения и профилактики вирусных инфекций.

Таблица 1.  

Препараты мАТ, одобренные для терапии и/или профилактики вирусных инфекций

№ Препарат мАТ (торговое название) Применение Мишень Вариант антитела Технология Производитель Год/Статус
1 Palivizumab (Synagis) Респираторно-синцитиальный вирус, профилактика инфекции у младенцев из группы высокого риска Гликопротеин F Гуманиз. (IgG1) Гибридомная технология MedImmune Inc. Одобрен FDA в 1998 г. [4]
2 Ibalizumab (Trogarzo) ВИЧ-1, лечение инфекции у взрослых при множественной лекарственной устойчивости ВИЧ-1 Рецептор CD4 Гуманиз. (IgG4) Гибридомная технология TaiMed Biologics Inc., Theratechnologies Inc. Одобрен FDA в 2018 г. [5]
3 Ansuvimab
(Ebanga) 		Эболавирус Заир, лечение инфекции у взрослых и детей Гликопротеин (GP) Чел. (IgG1) Иммортализация В-клеток вирусом Эпштейна–Барр Ridgeback Biotherapeutics Одобрен FDA в 2020 г. [6, 7]
4 Atoltivimab, Maftivimab и Odesivimab-ebgn
(Inmazeb) 		Эболавирус Заир, лечение инфекции у взрослых и детей Гликопротеин (GP) Чел. (IgG1) Гибридомная технология (генно-модифицированные мыши) Regeneron Pharmaceuticals Одобрен FDA в 2020 г. [8]
5 Etesevimab и Bamlanivimab SARS-CoV-2,
лечение инфекции любой степени тяжести 		Гликопротеин S (домен RBD) Чел. (IgG1) Нет данных Eli Lilly and Company Разрешен FDA для экстренного использования в 2021 г. [9, 10]
6 Casirivimab и Imdevimab
(REGEN-COV) 		SARS-CoV-2,
экстренное использование у амбулаторных пациентов из группы риска развития серьезных осложнений 		Гликопротеин S (домен RBD) Чел. (IgG1) Сортировка единичных В-клеток и ОТ-ПЦР (человек и генно-модифицированные мыши) Regeneron Pharmaceuticals Разрешен FDA для экстренного использования в 2021 г. [11, 12]

Примечание: Гуманиз. – гуманизированное антитело, Чел. – антитело человека, RBD – рецептор-связывающий домен.

МЕХАНИЗМЫ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСНЫХ ПАТОГЕНОВ АНТИТЕЛАМИ

Антитела (иммуноглобулины, Ig) представляют собой гликопротеины, которые обладают антиген-связывающей активностью, а также рядом эффекторных функций: способностью активировать систему комплемента, взаимодействовать с различными типами клеток, усиливать фагоцитоз. Антитела продуцируются плазматическими клетками в ответ на попадание в организм антигена и присутствуют в виде мембраносвязанных рецепторов на поверхности B-лимфоцитов и свободных антител в сыворотке крови [13].

Нейтрализующими принято считать антитела, которые блокируют вирус на этапах, предшествующих транскрипции и трансляции вирусной нуклеиновой кислоты, и тем самым снижают его инфекционность [14]. Для защиты организма от вирусных инфекций этого может быть достаточно, однако в ряде случаев антитела действуют совместно с клеточным иммунитетом.

При нейтрализации оболочечных вирусов антитела блокируют прикрепление или проникновение вируса в клетку-мишень (рис. 1). Антитела могут связываться с поверхностными белками вируса и тем самым блокировать прикрепление к клетке-мишени (1) или вмешиваться в уже установившийся контакт белков вируса и клетки (2). Если адсорбция уже произошла, антитела могут помешать проникновению, связываясь с фьюзогенными белками вируса (3). После проникновения вируса в эндосому антитела могут блокировать слияние с везикулярной мембраной – такой эффект возможен и для суперкапсидных, и для лишенных капсида вирусов (4). В случае безоболочечных вирусов антитела могут связываться после прикрепления вируса и мешать экструзии вирусного генома (5) [14, 15].

Рис. 1.

Механизмы нейтрализации суперкапсидных (1–4) и безоболочечных (4–6) вирусов антителами.

Недавно был открыт еще один механизм нейтрализации, который реализуется после проникновения вируса в клетку. В цитозоле клеток обнаружен белок TRIM21 – внутриклеточный рецептор убиквитинлигазы и антител, который связывается с IgG с более высокой аффинностью, чем любой другой рецептор в организме человека, быстро рекрутирует комплекс патоген–антитело и направляет его на протеасомную деградацию (6) [16].

Обычно нейтрализующую активность антител измеряют в отсутствие комплемента, однако часто допускают опосредованное комплементом усиление нейтрализации [15]. Следует заметить, что антитела могут блокировать проникновение вируса в клетку и за счет связывания с клеточными рецепторами, в таком случае корректнее использовать термин “антитело, блокирующее инфекцию” [14].

Антитела, не обладающие нейтрализующей активностью, также могут препятствовать вирусной репликации, активируя механизмы клеточного иммунитета. Опсонизация вирусных частиц и инфицированных клеток антителами через Fc-рецептор запускает комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP). В результате этих процессов разрушается вирусная оболочка или активируется фагоцитоз зараженных клеток [15, 17, 18]. Антитела также способны препятствовать вирусной инфекции за счет антителозависимого клеточно-опосредованного вирусного ингибирования (ADCVI). ADCVI включает большее количество механизмов и может объединять цитолитическую активность ADCC, фагоцитоз иммунных комплексов и нецитолитические механизмы – секрецию вирус-ингибирующих хемокинов (рис. 2) [19]. Кроме того, появляется все больше свидетельств иммуномодулирующего (вакциноподобного) эффекта препаратов моноклональных антител [20].

Рис. 2.

Механизмы ингибирования репликации вирусов ненейтрализующими антителами: CDC – комплемент-зависимая цитотоксичность, ADCP – антителозависимый клеточный фагоцитоз, ADCC – антителозависимая клеточная цитотоксичность, ADCVI – антителозависимое клеточно-опосредованное вирусное ингибирование.

В последнее время большое внимание приковано к так называемым “супер-антителам” – антителам, обладающим высокой эффективностью и/или широкой перекрестной реактивностью и способным, вопреки устоявшемуся мнению, быть эффективными не только до и вскоре после заражения, но и воздействовать на текущую инфекцию [21].

ИСТОЧНИК МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Разработка препарата мАТ, как правило, состоит из следующих этапов: 1) выделение антитела с нужными свойствами, 2) инженерия белка для улучшения его целевых свойств, 3) получение продуцентов со стабильной продукцией антител, 4) подбор условий культивирования продуцентов и очистки мАТ.

Противовирусные мАТ получают, как правило, из крови инфицированных или иммунизированных доноров, а также из синтетических библиотек, представляющих собой набор вариабельных фрагментов иммуноглобулинов.

Иммунная система донора (человека или животного), инфицированного патогеном, вырабатывает огромное количество антител ко всем возможным эпитопам, к тому же такие антитела проходят созревание в организме, что увеличивает их аффинность и специфичность. В-клетки памяти инфицированных доноров успешно используют для выделения антител. Однако не всегда при заражении вирусом развивается сильный иммунный ответ, и часто необходимо искать более подходящих доноров либо их вовсе нет. В таком случае прибегают к иммунизации донора самим патогеном или его антигенами. Повторные иммунизации позволяют стимулировать вторичный иммунный ответ и получить антитела, обладающие большей аффинностью.

Несмотря на то, что использование иммунных библиотек предпочтительнее, для получения противовирусных мАТ иногда используют наивный репертуар антител, основное преимущество которого – огромное разнообразие антител. Это делает его универсальным источником антител против любого антигена и дает возможность обнаружить антитела против антигенов, которые не вызывают сильный иммунный ответ [22].

В отличие от источников естественных антител, библиотеки синтетических фрагментов антител обладают уникальными преимуществами, включая полный контроль над дизайном библиотеки и условиями отбора. Технология позволяет генерировать огромное разнообразие антител, которое не может быть выработано иммунной системой донора. Однако такой вариант сопряжен с рисками получения антител, небезопасных для организма и неспособных выполнять свои функции in vivo. Несмотря на указанные недостатки, была продемонстрирована возможность применения мАТ, полученных из синтетических библиотек, для борьбы с вирусами и бактериальными токсинами [23].

МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ

При выборе стратегии выделения антител необходимо учитывать ряд параметров: источник антител, желаемый уровень аффинности и область применения антител, временные и бюджетные ограничения. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки (табл. 2).

Таблица 2.  

Сравнительная характеристика методов получения антител

№ Метод Время Относительная стоимость Специфич-ность мАТ Исходный репертуар антител Источник антител Плюсы Минусы
1 Фаговый дисплей 2–3 недели Низкая Низкая 1010–1013
(иммунная система и синтетические библиотеки) 		Человек, животные, синтетические библиотеки Легко доступен ген, кодирующий VH/VL Нет естественного спаривания VH/VL, ограничения бактериальной системы экспрессии
2 Гибридомная технология 6–8 месяцев Средняя Средняя 1010–1011
(иммунная система) 		Человек и животные Высокая вероятность работы мАТ in vivo Часто необходимо гуманизировать, синтезируются дополнительные цепи Ig, низкая выживаемость клонов
3 Культуры одиночных
В-клеток 		2–3 недели Высокая Высокая 1010–1011
(иммунная система) 		Человек и животные Прямой функциональный скрининг Смертность клонов, нет возможности обогатить
4 Иммортализованные
В-клетки 		2–3 недели Высокая Высокая 1010–1011
(иммунная система) 		Человек и животные Прямой функциональный скрининг Онкогенные вирусы и прочие технические сложности, низкий выход итоговых клонов
5 Сортировка
В-клеток 		1–2 недели Высокая Высокая 1010–1011
(иммунная система) 		Человек и животные Обогащенное разнообразие специфических антител Необходима разработка антигена

Первые мАТ были получены в 1976 г. с помощью гибридомной технологии, предложенной G. Köhler и C. Milstein [1]. Данная технология заключается в получении специализированных клеток для продукции мАТ – гибридом. Для этого выделяют B-лимфоциты из селезенки донора и гибридизуют с клеточной линией бессмертной миеломы с помощью агента, нарушающего клеточные мембраны, например, полиэтиленгликоля или вируса Сендай (рис. 3).

Рис. 3.

Схема получения моноклональных антител с помощью гибридомной технологии.

Далее клетки культивируют in vitro в селективной среде, где выживают только гибридные клетки, способные потенциально бесконечно расти и размножаться (как миелома) и синтезировать антитела (как В-лимфоциты). Индивидуальные клоны можно получить, например, методом предельного разведения, затем проводят скрининг индивидуальных клонов на наличие специфической активности антител и отбирают положительные варианты [24]. С помощью гибридомной технологии было получено первое противовирусное мАТ – Palivizumab [4].

Преимущество данной технологии заключается в использовании зрелых В-клеток, которые позволяют получить антитела, прошедшие селекцию и аффинное созревание в организме и обладающие естественным спариванием H-, L-цепей [25]. Такие антитела с большей вероятностью проявляют активность in vivo.

Вместе с тем этот подход имеет и ряд недостатков. Так, было показано, что гибридомы в ~32% случаев синтезируют дополнительные H- и L-цепи иммуноглобулинов, а это значит, что такие антитела не будут моноспецифичными [26].

Недостаток также заключается в трудоемкости технологии и низким выходом гибрида (~0.43% от всех В-клеток), а зависимость процесса от митоза замедляет сроки разработки мАТ [27].

Проблема получения мАТ человека при помощи гибридомной технологии заключается в отсутствии подходящей клеточной линии для слияния с В-клетками. Некоторые группы исследователей получали стабильные гибридомы при слиянии В-клеток человека с несекретирующими гетеромиеломами мыши (например, HMMA 2.5 [28]).

Несмотря на существующие недостатки, гибридомная технология с использованием методов генной инженерии остается весьма популярной. Так, с ее помощью был разработан ZMapp – препарат трех моноклональных антител, предназначенный для лечения инфекции, вызванной вирусом Эбола [29].

Дисплейные методы

Впервые концепцию пептидного фагового дисплея предложил в 1985 г. G.P. Smith. Подход заключается в получении популяции нитчатых фагов, экспонирующих на своей поверхности исследуемые белки, слитые с капсидным белком Р3 фаговой частицы. Отбор целевых молекул проводят методом аффинной селекции с использованием специфических лигандов (рис. 4) [30].

Рис. 4.

Дисплейные методы для получения моноклональных антител.

Первые антитела с использованием фагового дисплея были получены в 1990-е гг. [31]. Для получения фаговой библиотеки из лимфоцитов донора выделяют мРНК, в реакции обратной транскрипции получают фрагменты кДНК, кодирующие разнообразие VH- и VL-доменов иммуноглобулинов, и встраивают в фагмидный вектор. Такой вектор представляет собой минимальную плазмиду, содержащую ген фагового белка pIII, слитый с нуклеотидной последовательностью фрагмента антитела, фактор резистентности к селективному антибиотику и сайт упаковки генома фага М13. Библиотекой фагмид трансформируют клетки Escherichia coli, а затем инфицируют фагом-помощником. Фаг-помощник содержит полный геном М13, кодирующий все фаговые белки, но имеет дефектный сигнал упаковки. При сборке новых частиц pIII дикого типа и химерный белок рIII конкурируют за включение в фаг. Таким образом получают огромную коллекцию фаговых частиц с упакованной фагмидной ДНК, несущих (в подавляющем большинстве) только одну копию фрагмента антитела. Далее проводят аффинную селекцию с использованием целевых антигенов, а отобранные варианты фрагментов антител реконструируют в полноразмерные мАТ [32].

Такой подход стал популярным благодаря эффективности, простоте и низкой стоимости. Разнообразие комбинаторных библиотек составляет >1010 молекул. Эффективность подхода была продемонстрирована при исследовании вирусов гриппа. В работе были получены редкие антитела, нейтрализующие вирусы гриппа с использованием уникального механизма, что открывает новые возможности для разработки средств терапии и вакцин [33].

С помощью технологии фагового дисплея получен ряд противовирусных антител, например, m102.4 для профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусами Нипа и Хендра, Diridavumab против вируса гриппа и Foravirumab против вируса бешенства [34–36].

Важный недостаток фагового дисплея – проблемы, связанные с бактериальной системой экспрессии, основные из них – некорректный фолдинг молекул антител и отсутствие некоторых пост-трансляционных модификаций (например, гликозилирования и образования дисульфидных связей) [37].

Второй по популярности дисплейный метод – дрожжевой дисплей, в котором фрагменты антител экспрессируются на поверхности дрожжевых клеток. Специфические антитела отбирают через последовательные раунды мутагенеза и точной контролируемой селекции клеток с помощью проточной цитометрии [38]. Преимущество дрожжевой библиотеки – эукариотический посттрансляционный процессинг секретируемых белков. На сегодняшний день разработаны линии дрожжевых клеток, обеспечивающие более корректное гликозилирование антител [39].

Также для получения мАТ предложены дисплейные методы на основе фага λ и вируса осповакцины, дисплей на поверхности бактериальных клеток, а также бесклеточные дисплейные системы на основе мРНК и рибосом [40–44].

Разработаны дисплейные системы и на основе клеток млекопитающих. Этот подход обеспечивает получение терапевтических мАТ, отличающихся высоким уровнем экспрессии в клетках млекопитающих и сохраняющих нативный фолдинг, биологические и физико-химические свойства, однако данный подход ограничен меньшим размером библиотеки. Предложен ряд улучшений (например, использование дисплея на поверхности клеток млекопитающих в сочетании с соматической гипермутацией in vitro, совершенствование трансфекции и использование сортировки флуоресцентно-активированных клеток – FACS), позволяющих получать варианты антител с более высокой аффинностью [45, 46].

Существенный недостаток всех дисплейных методов – потеря нативного VH/VL-спаривания исходного репертуара антител. Поскольку было показано, что антитела с нативными легкими цепями с большей вероятностью связывают антиген, чем антитела с ненативным спариванием, считается, что дисплейные библиотеки содержат большой процент низкоаффинных антител и, как следствие, требуют многократных циклов созревания аффинности, отнимающих много времени [47, 48].

Для решения этой проблемы в дисплейных методах используют инкапсулирование единичных В-клеток в водно-жидкостной эмульсии с последующей амплификацией генов в эмульсионной ПЦР. Затем такое нативное разнообразие антител воспроизводят с помощью фагового дисплея [49].

Сортировка единичных В-клеток и клонирование генов VH/VL

В 1996 г. был предложен эффективный способ получения мАТ, основанный на сортировке единичных В-клеток (рис. 5) [50]. Отдельные клетки, как правило, выделяют с помощью FACS-сортировки [51]. При этом используют антигены, меченные флуоресцентным красителем. Специфичные В-клетки связываются с меченым белком и сортируются в отдельные ячейки. Затем из единичных B-клеток методом ОТ-ПЦР получают последовательности VH/VL-генов иммуноглобулинов и конструируют полноразмерные мАТ. ОТ-ПЦР с единичных клеток сохраняет пары VH/VL, к тому же этот метод позволяет получать мАТ в короткие сроки [52].

Рис. 5.

Получение моноклональных антител из В-клеток памяти: культуры единичных В-клеток, иммортализация и сортировка В-клеток.

Еще один подход к изоляции отдельных клеток – микрофлюидные технологии на основе микрокапель и клапанных систем – приобрел популярность благодаря использованию небольших количеств входного материала, низкой стоимости процесса, его высокой скорости и точному контролю [51, 53, 54].

Иммортализация В-клеток

Использование вируса Эпштейна–Барр для иммортализации B-клеток человека впервые было описано более 40 лет назад. Технология заключается в получении В-клеток памяти доноров, демонстрирующих эффективный иммунный ответ, и последующем заражением клеток вирусом Эпштейна–Барр. Далее выделяют клоны В-клеток, продуцирующие антитела. Культуральную жидкость, содержащую секретируемые антитела, используют для скрининга специфичности и нейтрализующей активности. Прямой функциональный скрининг значительно сокращает временные затраты и повышает вероятность получения антител, обладающих желаемыми свойствами [55]. Этот подход был применен к выделению нейтрализующих антител против вируса бешенства, SARS-CoV и других вирусов [56, 57]. Однако применение метода осложнено рисками, связанными с онкогенностью вируса Эпштейна–Барр и низким выходом иммортализованных клеток. Последние улучшения (например, использование агониста TLR9) позволили увеличить выход иммортализованных клеток более чем до 30%. С помощью такой технологии получен ряд высокоэффективных широконейтрализующих мАТ против вируса бешенства, SARS-CoV и других вирусов [58–60].

Культуры одиночных В-клеток

Использование иммортализации В-клеток считалось необходимым для получения функциональных В-клеточных культур. Однако был предложен альтернативный метод получения долгоживущих культур первичных одиночных В-клеток. Для этого В-клетки помещают на фидерный слой клеток, несущих на своей поверхности корецептор CD40L, а в питательную среду добавляют цитокины IL-2, IL-4, IL-21. В таких условиях единичные В-клетки активируются и формируют клеточную культуру, продуцирующую мАТ. Далее проводят прямой функциональный скрининг культуральной среды, из отобранных клонов методом ОТ-ПЦР получают нуклеотидные последовательности генов VH/VL и конструируют мАТ [61, 62]. Этот подход был применен для выделения нейтрализующих антител против ВИЧ-1, вирусов Денге и гриппа H1N1 [63–65].

Неоспоримое преимущество методов, основанных на скрининге В-клеток, – прямой функциональный анализ антител, полученных из естественных антителопродуцирующих клеток, что снижает ряд рисков, связанных с использованием других подходов (например, изменения структуры молекул антител или потеря некоторых вариантов антител из-за особенностей гетерологичной экспрессии). Тем не менее метод не лишен недостатков, среди которых низкая представленность специфичных В-клеток в сыворотке крови донора и их низкая выживаемость. Для повышения эффективности используют культуры плазматических клеток. Эти клетки содержат как минимум в 100 раз больше мРНК иммуноглобулинов и продуцируют антитела в конечной точке антиген-зависимого соматического гипермутагенеза, что повышает вероятность обнаружения антитела, обладающего высокой аффинностью и специфичностью [66]. Дополнительно повысить эффективность скрининга позволяет автоматизация процесса [62].

Новое поколение методов: высокопроизводительное секвенирование, протеомика и вычислительные технологии

Методы высокопроизводительного секвенирования позволяют получать обширную информацию о разнообразии репертуаров антител, которую используют для обнаружения специфических мАТ (рис. 6). Полагают, что частоты встречаемости последовательностей, полученных в результате секвенирования, отражают представленность клонов В-клеток в организме и, таким образом, дают материал для конструирования антител.

Рис. 6.

Схема получения моноклональных антител с помощью методов высокопроизводительного секвенирования и протеомики.

Так, на основе результатов массового параллельного секвенирования репертуара генов VH/VL плазматических клеток иммунизированных мышей были обнаружены наиболее часто встречающиеся аминокислотные последовательности VH и VL, на основе соразмерной распространенности они были объединены в пары, и получены scFv-фрагменты антител, из которых большая часть была специфична к антигену [67]. В другой работе из единичных В-клеток в перекрывающейся ОТ-ПЦР получали ДНК-фрагменты, кодирующие пары VH/VL, и секвенировали все полученные варианты. В результате было выявлено несколько наиболее широко представленных последовательностей антител, на основе которых были получены антитела, специфичные к гликопротеину вируса Эбола [68].

Сочетание методов геномики и протеомики также дает возможность идентифицировать специфичные мАТ из комбинаторного разнообразия репертуара антител донора. В таком случае данные секвенирования служат референсом/основой для интерпретации результатов, полученных при помощи масс-спектрометрии. Также для обнаружения антител объединяют результаты секвенирования с данными, полученными с использованием биоинформатических методов [69]. Например, используя известную последовательность антитела 10Е8 против ВИЧ-1 и данные секвенирования репертуара нуклеотидных последовательностей VH/VL ВИЧ-положительного донора, построили эволюционные филогенетические деревья и на основе относительных генетических расстояний от дикого типа 10E8 осуществили селективное спаривание цепей in silico. В результате было выделено 11 функциональных 10E8-подобных мАТ с нейтрализующей активностью [70]. Позже с использованием этой стратегии из репертуара другого ВИЧ-положительного донора также было выделено несколько широконейтрализующих мАТ [71].

Биоинформатические подходы использовали для быстрого поиска антител против нового коронавируса SARS-CoV-2. Для этого были созданы модели взаимодействия вирусного S-белка с антителами, специфичными к SARS-CoV – наиболее близкому по антигенному составу коронавирусу. На основе результатов моделирования было выбрано антитело CR3022, специфичное к SARS-CoV, способное взаимодействовать с S-белком SARS-CoV-2. Специфичность взаимодействия этого антитела подтвердили in vitro [72].

Последние достижения в вычислительных методах позволяют не только сократить время и затраты на обнаружение антител, но и строго контролировать параллельный скрининг нескольких физико-химических свойств. Ожидается, что развитие этих методов позволит, в конечном счете, разрабатывать антитела c необходимыми свойствами de novo [73].

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДИЗАЙН АНТИТЕЛ

В последнее время активно развиваются методы, позволяющие проводить рациональный дизайн антител и изменять такие их свойства, как аффинность, число и специфичность паратопов, молекулярный вес, изоэлектрическая точка, подвижность молекулы и потенциальная иммуногенность, а также эффекторные свойства и время полужизни молекулы.

Необходимость инженерии антител возникла еще при получении первых мАТ, поскольку гибридомная технология позволяла получать только антитела мыши, которые могли вызывать иммунный ответ в организме человека. В середине 1980-х гг. этот недостаток был частично устранен получением химерных, а затем и полностью гуманизированных (гиперхимерных) антител [74]. Под химерным антителом понимают молекулу иммуноглобулина животного, в которой структура белка модифицирована так, чтобы увеличить сходство с антителом человека. Как правило, заменяют константную область антитела животного на область антитела человека. В гиперхимерных антителах от иммуноглобулина животного остаются только петли гипервариабельных регионов (CDRs). Позже стало возможным получение антител человека с помощью технологий фагового дисплея и сортировки В-клеток, а также с использованием трансгенных животных [75].

Следует отметить, что последние пять лет в клиническую практику в основном вводятся именно антитела человека [76]. Тенденция характерна и для препаратов противовирусных антител. Согласно международной базе данных IMGT (www.imgt.org), подавляющее большинство препаратов противовирусных антител – это антитела человека или гуманизированные антитела (рис. 7).

Рис. 7.

Соотношение мАТ различной степени гуманизации, разработанных для терапии/профилактики вирусных инфекций (https://www.imgt.org, данные на ноябрь 2021 г.).

Биологические свойства антител зависят от структуры Fc-фрагмента, поэтому данный регион часто подвергают модификациям. Для большинства терапевтических применений желателен длительный период полужизни антител в сыворотке, т.к. это уменьшает необходимость повторных инъекций и сродство Fc-области к различным рецепторам. Регулировать эти процессы удается благодаря аминокислотным заменам белкового остова молекулы [77, 78]. Изменения сродства к рецепторам позволяет также добиться гликоинженерия антител. Предполагается, что дефукозилированные антитела обладают повышенной аффинностью к некоторым рецепторам, однако клинические эффекты еще предстоит исследовать [79].

Растворимость антител и способность к агрегации также становятся управляемыми характеристиками. Аминокислотные замены в областях, склонных к агрегации (APR), экспериментально показали увеличение растворимости антител, что подтверждает правильность этой инженерной стратегии [80].

Получение фрагментов антител различного размера (рис. 8) помогло усовершенствовать мАТ под конкретные цели [81]. Фрагменты антител имеют несколько преимуществ по сравнению с полноразмерными мАТ: более низкую стоимость препарата, сниженную иммуногенность, высокую способность проникновения в ткани, что дает возможность молекуле достигать труднодоступных мест [82]. В настоящее время разрабатываются одноцепочечные антитела (оцАТ) против ряда вирусов, включая ВИЧ-1, вирусы гриппа и гепатита С, респираторно-синцитиальный вирус и энтеровирусы [83]. Хотя оцАТ – очень сильные ингибиторы вирусных инфекций, ни одно из них не было одобрено для клинического использования против вирусной инфекции.

Рис. 8.

Схематическое изображение некоторых вариантов рекомбинантных моноклональных антител, фрагментов антител и их производных.

Еще один перспективный вариант мАТ – однодоменные антитела (наноантитела) и их производные. Такие антитела состоят из единственного вариабельного домена и способны связывать труднодоступные антигены, к тому же они обладают хорошей стабильностью и растворимостью [84]. Прообразом для их создания послужили неканоничные иммуноглобулины животных семейства Camelidae (верблюд, лама) и хрящевых рыб, полностью лишенные L-цепей [85, 86].

Несмотря на достоинства различных рекомбинантных фрагментов антител, почти все одобренные к применению мАТ на данный момент представляют собой полноразмерные иммуноглобулины (рис. 9).

Рис. 9.

Соотношение вариантов мАТ, одобренных для использования в терапии (https://www.imgt.org, данные на ноябрь 2021 г.).

Антитела можно использовать и как средство таргетной доставки лекарственного средства или токсина в конкретный участок, что может быть особенно полезно для уничтожения зараженных клеток [87].

Иммуноконъюгаты активно исследовали при лечении рака, несколько вариантов получили одобрение FDA [88]. В настоящее время разработано несколько конъюгатов на основе антител для эффективной и высокоспецифичной терапии различных вирусов, включая ВИЧ, цитомегаловирус, герпесвирусы, вирусы гриппа и бешенства [89].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день терапевтические мАТ – быстрорастущий класс биофармацевтических препаратов, демонстрирующий высокую эффективность в отношении многих онкологических, воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Несомненные преимущества мАТ – их предсказуемое действие, высокая специфичность и чистота.

Несмотря на скромный опыт применения в противовирусной терапии, использование нейтрализующих мАТ остается одним из самых перспективных направлений в борьбе с вирусными инфекциями. При возникновении новых вирусных эпидемий или биотеррористических угроз получение и применение антител, несомненно, наиболее рациональное стратегическое решение.

В настоящее время улучшение и появление новых подходов к получению антител позволяет в кратчайшие сроки получать высокоэффективные мАТ, а рациональный дизайн с использованием методов генной инженерии и биоинформатики открывает безграничные возможности их совершенствования.

Список литературы

  1. Köhler G., Milstein C. // Nature. 1975. V. 256. P. 495–497. https://doi.org/10.1038/256495a0

  2. Riechmann L., Clark M., Waldmann H., Winter G. // Nature. 1988. V. 332. P. 323–327. https://doi.org/10.1038/332323a0

  3. Zeitlin L., Cone R.A., Moench T.R., Whaley K.J. // Microbes Infect. 2000. V. 2. P. 701–708. https://doi.org/10.1016/s1286-4579(00)00355-5

  4. Pollack P., Groothuis J.R. // J. Infect. Chemotherapy. 2002. V. 8. P. 201–206. https://doi.org/10.1007/s10156-002-0178-6

  5. Rizza S.A., Bhatia R., Zeuli J., Temesgen Z. // Drugs Today (Barc). 2019. V. 55. P. 25–34. https://doi.org/10.1358/dot.2019.55.1.2895651

  6. Corti D., Misasi J., Mulangu S., Stanley D.A., Kanekiyo M., Wollen S., Ploquin A., Doria-Rose N.A., Staupe R.P., Bailey M., Shi W., Choe M., Marcus H., Thompson E.A., Cagigi A., Silacci C., Fernandez-Rodriguez B., Perez L., Sallusto F., Vanzetta F., Agatic G., Cameroni E., Kisalu N., Gordon I., Ledgerwood J.E., Mascola J.R., Graham B.S., Muyembe-Tamfun J.J., Trefry J.C., Lanzavecchia A., Sullivan N.J. // Science. 2016. V. 351. P. 1339–1342. https://doi.org/10.1126/science.aad522413

  7. Lee A. // Drugs. 2021. V. 81. P. 595–598. https://doi.org/10.1007/s40265-021-01483-4

  8. Sivapalasingam S., Kamal M., Slim R., Hosain R., Shao W., Stoltz R., Yen J., Pologe L.G., Cao Y., Partridge M., Sumner G., Lipsich L. // Lancet Infect Dis. 2018. V. 18. P. 884–893. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(18)30397-9

  9. Gottlieb R.L., Nirula A, Chen P., Boscia J., Heller B., Morris J., Huhn G., Cardona J., Mocherla B., Stosor V., Shawa I., Kumar P., Adams A.C., Van Naarden J., Custer K.L., Durante M., Oakley G., Schade A.E., Holzer T.R., Ebert P.J., Higgs R.E., Kallewaard N.L., Sabo J., Patel D.R., Klekotka P., Shen L., Skovronsky D.M. // JAMA. 2021. V. 325. P. 632–644. https://doi.org/10.1001/jama.2021.0202

  10. Jones B.E., Brown-Augsburger P.L., Corbett K.S., Westendorf K., Davies J., Cujec T.P., Wiethoff C.M., Blackbourne J.L., Heinz B.A., Foster D., Higgs R.E., Balasubramaniam D., Wang L., Bidshahri R., Kraft L., Hwang Y., Žentelis S., Jepson K.R., Goya R., Smith M.A., Collins D.W., Hinshaw S.J., Tycho S.A., Pellacani D., Xiang P., Muthur aman K., Sobhanifar S., Piper M.H., Triana F.J., Hendle J., Pustilnik A., Adams A.C., Berens S.J., Baric R.S., Martinez D.R., Cross R.W., Geisbert T.W., Borisevich V., Abiona O., Belli H.M., de Vries M., Mohamed A., Dittmann M., Samanovic M., Mulligan M.J., Goldsmith J.A., Hsieh C.L., Johnson N.V., Wrapp D., McLellan J.S., Barnhart B.C., Graham B.S., Mascola J.R., Hansen C.L., Falconer E. // Sci. Transl. Med. 2021. V. 13. P. eabf1906. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abf1906

  11. Hansen J., Baum A., Pascal K.E., Russo V., Giordano S., Wloga E., Fulton B.O., Yan Y., Koon K., Patel K., Chung K.M., Hermann A., Ullman E., Cruz J., Rafique A., Huang T., Fairhurst J., Libertiny C., Malbec M., Lee W.Y., Welsh R., Farr G., Pennington S., Deshpande D., Cheng J., Watty A., Bouffard P., Babb R., Levenkova N., Chen C., Zhang B., Romero Hernandez A., Saotome K., Zhou Y., Franklin M., Sivapalasingam S., Lye D.C., Weston S., Logue J., Haupt R., Frieman M., Chen G., Olson W., Murphy A.J., Stahl N., Yancopoulos G.D., Kyratsous C.A. // Science. 2020. V. 369. P. 1010–1014. https://doi.org/10.1126/science.abd082711.

  12. Weinreich D.M., Sivapalasingam S., Norton T., Ali S., Gao H., Bhore R., Musser B.J., Soo Y., Rofail D., Im J., Perry C., Pan C., Hosain R., Mahmood A., Davis J.D., Turner K.C., Hooper A.T., Hamilton J.D., Baum A., Kyratsous C.A., Kim Y., Cook A., Kampman W., Kohli A., Sachdeva Y., Graber X., Kowal B., DiCioccio T., Stahl N., Lipsich L., Braunstein N., Herman G., Yancopoulos G.D. // N. Engl. J. Med. 2021. V. 384. P. 238–251. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2035002

  13. Ройт А. // Основы иммунологии. M.: Мир, 1991. 328 с.

  14. Klasse P.J. // Adv. Biol. 2014. V. 2014. P. 1–24. https://doi.org/10.1155/2014/157895

  15. Mandel B. // Adv. Virus Res. 1978. V. 23. P. 205–268. https://doi.org/10.1016/S0065-3527(08)60101-3

  16. Mallery D., McEwan W.A., Bidgood S.R., Towers G.J., Johnson C.M., James L.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. P. 19985–19990. https://doi.org/10.1073/pnas.1014074107

  17. von Bredow B., Arias J.F., Heyer L.N., Moldt B., Le K., Robinson J.E., Zolla-Pazner S., Burton D.R., Evans D.T. // J. Virol. 2016. V. 90. P. 6127–6139. https://doi.org/10.1128/JVI.00347-16

  18. Linscott W.D., Levinson W.E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. V. 64. P. 520–527. https://doi.org/10.1073/pnas.64.2.520

  19. Schmaljohn A.L. // Curr. HIV Res. 2013. V. 11. P. 345–353. https://doi.org/10.2174/1570162x113116660057

  20. Pelegrin M., Naranjo-Gomez M., Piechaczyk M. // Trends Microbiol. 2015. V. 23. P. 653–665. https://doi.org/10.1016/j.tim.2015.07.005

  21. Walker L.M., Burton D.R. // Nat. Rev. Immunol. 2018. V. 18. P. 297–308. https://doi.org/10.1038/nri.2017.148

  22. Chan S.K., Rahumatullah A., Lai J.Y., Lim T.S. // Adv. Exp. Med. Biol. 2017. V. 1053. P. 35–59. https://doi.org/10.1007/978-3-319-72077-7_3

  23. Wu Y., Li S., Du L., Wang C., Zou P., Hong B., Yuan M., Ren X., Tai W., Kong Y., Zhou C., Lu L., Zhou X., Jiang S., Ying T. // Emerg. Microbes Infect. 2017. V. 6. P. e89. https://doi.org/10.1038/emi.2017.79

  24. Little M., Kipriyanov S.M., Le Gall F., Moldenhauer G. // Immunol. Today. 2000. V. 21. P. 364–370. https://doi.org/10.1016/S0167-5699(00)01668-6

  25. Zaroff S., Tan G. // Biotechniques. 2019. V. 67. P. 90–92. https://doi.org/10.2144/btn-2019-0054

  26. Bradbury A.R.M., Trinklein N.D., Thie H., Wilkinson I.C., Tandon A.K., Anderson S., Bladen K.L., Jones B., Force Aldred S., Bestagno M., Burrone O., Maynard J., Ferrara F., Trimmer J.S., Görnemann J., Glanville J., Wolf P., Frenzel A., Wong J., Koh X.Y., Eng H.Y., Lane D., Lefranc M.P., Clark M., Dübel S. // MAbs. 2018. V. 10. P. 539–546. https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1445456

  27. Yu X., McGraw P.A., House F.S., Crowe J.E. // J. Immunol. Methods. 2008. V. 336. P. 142–151. https://doi.org/10.1016/j.jim.2008.04.008

  28. Gorny M. // Antib. Technol. J. 2012. V. 2. P. 1–5. https://doi.org/10.2147/ANTI.S30489

  29. Qiu X., Wong G., Audet J., Bello A., Fernando L., Alimonti J.B., Fausther-Bovendo H., Wei H., Aviles J., Hiatt E., Johnson A., Morton J., Swope K., Bohorov O., Bohorova N., Goodman C., Kim D., Pauly M.H., Velasco J., Pettitt J., Olinger G.G., Whaley K., Xu B., Strong J.E., Zeitlin L., Kobinger G.P. // Nature. 2014. V. 514. P. 47–53. https://doi.org/10.1038/nature13777

  30. Smith G.P. // Science. 1985. V. 228. P. 1315–1317. https://doi.org/10.1126/science.4001944

  31. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. // Nature. 1990. V. 348. P. 552–554. https://doi.org/10.1038/348552a0

  32. Ledsgaard L., Kilstrup M, Karatt-Vellatt A., McCafferty J., Laustsen A.H. // Toxins. 2018. V. 10. P. 236. https://doi.org/10.3390/toxins10060236

  33. Lerner R.A. // Mol. BioSystems. 2011. V. 7. P. 1004–1012. https://doi.org/10.1039/C0MB00310G

  34. Zhu Z., Bossart K.N., Bishop K.A., Crameri G., Dimitrov A.S., McEachern J.A., Feng Y., Middleton D., Wang L.-F., Broder C.C., Dimitrov D.S. // J. Infect. Dis. 2008. V. 197. P. 846–853.https://doi.org/10.1086/528801

  35. Nachbagauer R., Shore D., Yang H., Johnson S.K., Gabbard J.D., Tompkins S.M., Wrammert J., Wilson P.C., Stevens J., Ahmed R., Krammer F., Ellebedy A.H. // J. Virol. 2018. V. 92. P. e00949-18. https://doi.org/10.1128/JVI.00949-18

  36. Frenzel A., Schirrmann T., Hust M. // MAbs. 2016. V. 8. P. 1177–1194. https://doi.org/10.1080/19420862.2016.1212149

  37. Joseph B.C., Pichaimuthu S., Srimeenakshi S., Murthy M., Selvakumar M., Ganesan M., Manjunath S.R. // J. Cell Sci. Ther. 2015. V. 6. P. 221. https://doi.org/10.4172/2157-7013.1000221

  38. Sun Y., Ban B., Bradbury A., Ansari G.A.S., Blake D.A. // Anal. Chem. 2016. V. 88. P. 9181–9189. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b02334

  39. Li H., Sethuraman N., Stadheim T. A., Zha D., Prinz B., Ballew N., Bobrowicz P., Choi B.K., Cook W.J., Cukan M., Houston-Cummings N.R., Davidson R., Gong B., Hamilton S.R., Hoopes J.P., Jiang Y., Kim N., Mansfield R., Nett J.H., Rios S., Strawbridge R., Wildt S., Gerngross T.U. // Nat. Biotechnol. 2006. V. 24. P. 210–215. https://doi.org/10.1038/nbt1178

  40. Huse W.D., Sastry L., Iverson S.A., Kang A.S., Alting-Mees M., Burton D.R., Benkovic S.J., Lerner R.A. // Science. 1989. V. 246. P. 1275–1281. https://doi.org/10.1126/science.2531466

  41. Daugherty P.S., Chen G., Olsen M.J., Iverson B.L., Georgiou G. // Protein Eng. 1998. V. 11. P. 825–832. https://doi.org/10.1093/protein/11.9.825

  42. Smith E., Zauderer M. // Curr. Drug Discov. Technol. 2014. V. 11. P. 48–55. https://doi.org/10.2174/157016381101140124163634

  43. Kanamori T., Fujino Y., Ueda T. // Biochim. Biophys. Acta – Prot. Proteomics. 2014. V. 1844. P. 1925–1932. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2014.04.007

  44. Lipovsek D., Plückthun A. // J. Immunol. Methods. 2004. V. 290. P. 51–67. https://doi.org/10.1016/j.jim.2004.04.008

  45. King D., Bowers P., Kehry M., Horlick R. // Curr. Drug Discov. Technol. 2014. V. 11. P. 56–64. https://doi.org/10.2174/15701638113109990037

  46. Zhou C., Jacobsen F.W., Cai L., Chen Q., Shen W.D. // MAbs. 2010. V. 2. P. 508–518. https://doi.org/10.4161/mabs.2.5.12970

  47. Adler A.S., Bedinger D., Adams M.S., Asensio M.A., Edgar R.C., Leong R., Leong J., Mizrahi R.A., Spindler M.J., Bandi S.R., Huang H., Tawde P., Brams P., Johnson D.S. // MAbs. 2018. V. 10. P. 431–443. https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1426422

  48. Hu D., Hu S., Wan W., Xu M., Du R., Zhao W., Gao X., Liu J., Liu H., Hong J. // PLoS One. 2015. V. 10. P. e0129125. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0129125

  49. Rajan S., Kierny M.R., Mercer A., Wu J., Tovchigrechko A., Wu H., Dall’Acqua W.F., Xiao X., Chowdhury P.S. // Commun. Biol. 2018. V. 1. P. 1–8. https://doi.org/10.1038/s42003-017-0006-2

  50. Babcook J.S., Leslie K.B., Olsen O.A., Salmon R.A., Schrader J.W. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 7843–7848. https://doi.org/10.1073/pnas.93.15.7843

  51. Perry S.T., Keogh E., Morton M., Koudstaal W., Pascual G. // J. Vis. Exp. 2019. V. 150. P. e59809. https://doi.org/10.3791/59809

  52. Thorsen T., Roberts R.W., Arnold F.H., Quake S.R. // Phys. Rev. Lett. 2001. V. 86. P. 4163–4166. https://doi.org/10.1103/PhysRevLett.86.4163

  53. Honjo T., Alt F., Neuberger M. // Molecular Biology of B Cells. Academic Press, 2003. 600 p.

  54. Singhal A., Haynes C.A., Hansen C.L. // Anal. Chem. 2010. V. 82. P. 8671–8679. https://doi.org/10.1021/ac101956e

  55. Lanzavecchia A., Corti D., Sallusto F. // Curr. Opin. Biotechnol. 2007. V. 18. P. 523–528. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2007.10.011

  56. Traggiai E., Becker S., Subbarao R., Kolesnikova L., Uematsu Y., Gismondo M.R., Murphy B.R., Rappuoli R., Lanzavecchia A. // Nat. Med. 2004. V. 10. P. 871–875. https://doi.org/10.1038/nm1080

  57. Ueki Y., Goldfarb I.S., Harindranath N., Gore M., Koprowski H., Notkins A.L., Casali P. // J. Exp. Med. 1990. V. 171. P. 19–34. https://doi.org/10.1084/jem.171.1.19

  58. Traggiai E., Becker S., Subbarao K., Kolesnikova L., Uematsu Y., Gismondo M.R., Murphy B.R., Rappuoli R., Lanzavecchia A. // Nat. Med. 2004. V. 10. P. 871–875. https://doi.org/10.1038/nm1080

  59. Ueki Y., Goldfarb I.S., Harindranath N., Gore M., Koprowski H., Notkins A.L., Casali P. // J. Exp. Med. 1990. V. 171. P. 19–34. https://doi.org/10.1084/jem.171.1.19

  60. Corti D., Lanzavecchia A. // Annu. Rev. Immunol. 2013. V. 31. P. 705–742. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-032712-095916

  61. Jin A., Ozawa T., Tajiri K., Obata T., Kondo S., Kinoshita K., Kadowaki S., Takahashi K., Sugiyama T., Kishi H., Muraguchi A. // Nat. Med. 2009. V. 15. P. 1088–1092. https://doi.org/10.1038/nm.1966

  62. Huang J., Doria-Rose N.A., Longo N.S., Laub L., Lin C.-L., Turk E., Kang B.H., Migueles S.A., Bailer R.T., Mascola J.R., Connorsl M. // Nat. Protoc. 2013. V. 8. P. 1907–1915. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.117

  63. Dejnirattisai W., Wongwiwat W., Supasa S., Zhang X., Dai X., Rouvinski A., Jumnainsong A., Edwards C., Than Ha Quyen N., Duangchinda T., Grimes J.M., Tsai W.Y., Lai C.Y., Wang W.K., Malasit P., Farrar J., Simmons C.P., Zhou Z.H., Rey F.A., Mongkolsapaya J., Screaton G.R. // Nat. Immunol. 2015. V. 16. P. 170–177. https://doi.org/10.1038/ni.3058

  64. Wrammert J., Smith K., Miller J., Langley W.A., Kokko K., Larsen C., Zheng N.-Y., Mays I., Garman L., Helms C., James J., Air G.M., Capra J.D., Ahmed R., Wilson P.C. // Nature. 2008. V. 453. P. 667–671. https://doi.org/10.1038/nature06890

  65. Walker L.M., Phogat S.K., Chan-Hui P.-Y., Wagner D., Phung P., Goss J.L., Wrin T., Simek M.D., Fling S., Mitcham J.L., Lehrman J.K., Priddy F.H., Olsen O.A., Frey S.M., Hammond P.W., Protocol G Principal Investigators, Kaminsky S., Zamb T., Moyle M., Koff W.C., Poignard P., Burton D.R. // Science. 2009. V. 326. P. 285–289. https://doi.org/10.1126/science.1178746

  66. Herzenberg L.A., De Rosa S.C. // Immunol. Today. 2000. V. 21. P. 383–390. https://doi.org/10.1016/s0167-5699(00)01678-9

  67. Reddy S.T., Ge X., Miklos A.E., Hughes R.A., Hyun Kang S., Hon Hoi K., Chrysostomou C., Hunicke-Smith S.P., Iverson B.L., Tucker P.W., Ellington A.D., Georgiou G. // Nat. Biotechnol. 2010. V. 28. P. 965–969. https://doi.org/10.1038/nbt.1673

  68. Wang B., Kluwe C.A., Lungu O.I., DeKosky B.J., Kerr S.A., Johnson E.L., Tanno H., Lee C.-H., Jung J., Rezigh A.B., Carroll S.M., Reyes A.N., Bentz J.R., Villanueva I., Altman A.L., Davey R.A., Ellington A.D., Georgiou G. // Sci. Rep. 2015. V. 5. P. 13926. https://doi.org/10.1038/srep13926

  69. Parola C., Neumeier D., Reddy S.T. // Immunology. 2018. V. 153. P. 31–41. https://doi.org/10.1111/imm.12838

  70. Zhu J., Ofek G., Yang Y., Zhang B., Louder M.K., Lu G., McKee K., Pancera M., Skinner J., Zhang Z., Parks R., Eudailey J., Lloyd K.E., Blinn J., Alam S.M., Haynes B.F., Simek M., Burton D.R., Koff W.C., NISC Comparative Sequencing Program, Mullikin J.C., Mascola J.R., Shapiro L., Kwong P.D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. P. 6470–6475. https://doi.org/10.1073/pnas.1219320110

  71. Zhu J., Wu X., Zhang B., McKee K., O’Dell S., Soto C., Zhou T., Casazza J.P., Mullikin J.C., Kwong P.D., Mascola J.R., Shapiro L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. P. E4088–E4097. https://doi.org/10.1073/pnas.1306262110

  72. Tian X., Li C., Huang A., Xia S., Lu S., Shi Z., Lu L., Jiang S., Yang Z., Wu Y., Ying T. // Emerg. Microbes Infect. 2020. V. 9. P. 382–385. https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1729069

  73. Sormanni P., Aprile F.A., Vendruscolo M. // Chem. Soc. Rev. 2018. V. 47. P. 9137–9157. https://doi.org/10.1039/c8cs00523k

  74. McCarthy M. // The Lancet. 1997. V. 349. P. 405. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(97)80027-X

  75. Lonberg N. // Handb. Exp. Pharmacol. 2008. V. 181. P. 69–97. https://doi.org/10.1007/978-3-540-73259-4_4

  76. Grilo A.L., Mantalaris A. // Trends Biotechnol. 2019. V. 37. P. 9–16. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.014

  77. Vaccaro C., Zhou J., Ober R.J., Ward E.S. // Nat. Biotechnol. 2005. V. 23. P. 1283–1288. https://doi.org/10.1038/nbt1143

  78. Lazar G.A., Dang W., Karki S., Vafa O., Peng J.S., Hyun L., Chan C., Chung H.S., Eivazi A., Yoder S.C., Vielmetter J., Carmichael D.F., Hayes R.J., Dahiyat B.I. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 4005–4010. https://doi.org/10.1073/pnas.0508123103

  79. Irvine E.B., Alter G. // Glycobiology. 2020. V. 30. P. 241–253. https://doi.org/10.1093/glycob/cwaa018

  80. van der Kant R., Karow-Zwick A.R., Van Durme J., Blech M., Gallardo R., Seeliger D., Aßfalg K., Baatsen P., Compernolle G., Gils A., Studts J.M., Schulz P., Garidel P., Schymkowitz J., Rousseau F. // J. Mol. Biol. 2017. V. 429. P. 1244–1261. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2017.03.014

  81. Holliger P., Hudson P.J. // Nat. Biotechnol. 2005. V. 23. P. 1126–1136. https://doi.org/10.1038/nbt1142

  82. Bates A., Power C.A. // Antibodies. 2019. V. 8. P. 28. https://doi.org/10.3390/antib8020028

  83. Wu Y., Jiang S., Ying T. // Front. Immunol. 2017. V. 8. P. 1802. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01802

  84. Тиллиб С.В. // Мол. биология. 2020. Т. 54. № 3. С. 362–373. https://doi.org/10.31857/S0026898420030167

  85. Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hammers C., Bajyana Songa E., Bendahman N., Hammers R. // Nature. 1993. V. 363. P. 446–448. https://doi.org/10.1038/363446a0

  86. Greenberg A.S., Avila D., Hughes M., Hughes A., McKinney E.C., Flajnik M.F. // Nature. 1995. V. 374. P. 168–173. https://doi.org/10.1038/374168a0

  87. Bakhtiar R. // Biotechnol. Lett. 2016. V. 38. P. 1655–1664. https://doi.org/10.1007/s10529-016-2160-x

  88. Chau C.H., Steeg P.S., Figg W.D. // The Lancet. 2019. V. 394. P. 793–804. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(19)31774-X

  89. Spiess K., Jakobsen M.H., Kledal T.N., Rosenkilde M.M. // J. Leukoc. Biol. 2016. V. 99. P. 911–925. https://doi.org/10.1189/jlb.2MR1015-468R

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал