Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 3, стр. 296-301

ВВЕДЕНИЕ

Гликан-связывающие белки (лектины, белки-транспортеры, ферменты углеводного обмена) растительной клетки изучены значительно хуже, чем соответствующие белки млекопитающих, несмотря на то, что представленность углеводной составляющей в растительной клетке существенно выше. Хотя N-гликаны в гликопротеинах животных и растений имеют схожее строение, у последних есть специфическая особенность – β-ксилозный остаток, соединенный с коровой β-маннозой [1, 2]. Наличие необычного Xyl-заместителя предполагает выполнение специфических функций в жизнедеятельности растительной клетки и, соответственно, функционирование специфических углевод- связывающих белков.

Цель данной работы – синтез типичного для растительной клетки структурного фрагмента N‑гликопротеиновых цепей – дисахарида Xylβ1-2Manβ в виде 3-аминопропилгликозида для последующего поиска, выделения и выяснения клеточной локализации ксилоза-узнающих белков в растительных экстрактах. Наличие аминогруппы в составе спейсера дисахарида Xylβ1-2Manβ-sp делает возможной иммобилизацию на чипе [3–5], получение из него флуоресцентного зонда, аффинного адсорбента и других инструментов исследования.

РУЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Стереоселективное химическое β-маннозилирование – одна из наиболее сложных задач олигосахаридного синтеза. Существует несколько путей ее решения, в частности, Lichtenthaler et al. в своих работах применяли подход [6], суть которого заключается в 4-стадийном получении 2-оксогликозилбромида из D-глюкозы, гликозилирование им гликозил-акцептора в присутствии нерастворимых солей серебра и последующее стереоселективное восстановление боргидридом натрия до получения β-маннозида. В работах [7–9] показано, что 4,6-О-бензилиденовые тиогликозиды с несоучаствующими группами (Bn, 2,3-изопропилиденовая, триметилсилильная) при С2 и С3 обеспечивают более высокую β-селективность в сравнении с донорами, не обладающими этими группами. Известно также, что при использовании в качестве гликозил-донора диизопропилиденового производного тиогликозида маннозы гликозилирование протекает почти с количественным выходом (89%), но с низкой селективностью (α/β, 1 : 1) [9].

Поскольку взаимодействие 3-трифторацетамидопропанола с полностью бензилированным бромидом или тиогликозидом маннозы в наших экспериментах привело к преимущественному образованию α-аномера (α/β ≈ 2 : 1), мы решили использовать для этой реакции дибензилиденовое производное (II), которое легко получить из полного ацетата (I) [10] дез-О-ацетилированием и последующим введением бензилиденовых групп (Bd) по схеме 1 . Реакция гликозилирования 3‑трифторацетамидопропанола производным (II) в дихлорметане в присутствии N-иодсукцинимида (NIS) и трифторметансульфокислоты (TfOH) при комнатной температуре с последующей заменой Bd-групп на ацетильные привела к получению смеси аномеров, из которой после хроматографического разделения (здесь и далее – на силикагеле) выделены индивидуальные β- и α-маннозиды (IIIβ) и (IIIα) с выходом 33 и 46% соответственно. После их дезацетилирования и снятия N-трифторацетильной защиты получены аминопропильные производные маннозы (IVβ) и (IVα) с выходом >90%. Конфигурацию аномерного центра остатка маннозы определяли с помощью ¹Н-ЯМР: величины КССВ сигналов аномерных протонов при С1 для β-маннозидов (J_1,2 < 1.1 Гц) и α-маннозидов (J_1,2 1.8 Гц), положение химического сдвига сигнала протона при С3 [11] (α-маннозиды характеризуются более слабопольным химическим сдвигом сигналов протонов при С3 по сравнению с положением этого сигнала в β-маннозидах) (табл. 1). Кроме того, положения сигналов протонов углеводного цикла в соединениях (IIIα) и (IVα) совпадают с таковыми для аминоэтильного производного маннозы [12].

Для получения целевого дисахарида проводили удаление всех ацильных групп обработкой защищенного производного (IIIβ) 0.5 М раствором метилата натрия в метаноле с последующим введением Bd-группы обработкой α,α-диметокситолуолом в присутствии толуолсульфокислоты. Во избежание образования дибензилиденового производного реакцию проводили с небольшим избытком реагента, и даже в этом случае образуется бис-аддукт, и остается исходное соединение, что снижает выход целевого продукта (Vβ). Для селективной защиты гидроксила при С3 маннозного остатка была выбрана бензоильная группа (Bz) [13], которую вводили обработкой 4,6-О-бензилиденового производного (Vβ) бензоилхлоридом в хлористом метилене при –18°С в присутствии пиридина, и после хроматографической очистки получили гликозил-акцептор (VIβ) с выходом 54% (на три стадии). Положение бензоильной группы подтверждено химическим сдвигом сигнала протона при С3 (δ 5.30 м.д.), он находится в том же месте, что и в полном ацетате (IIIβ). О наличии свободной ОН-группы при С2 свидетельствует химический сдвиг сигнала протона при С2 в сильном поле (δ 4.41 м.д.), в то время как соответствующий сигнал в полном ацетате (IIIβ) составляет величину δ 5.49 м.д.

Соединение (VIβ) гликозилировали ацетобром-ксилозой (X) (полученной из соответствующего полного ацетата (IX) [14] действием бромистого водорода в уксусной кислоте) методом Кенигса–Кнорра в присутствии трифлата серебра (AgOTf) и тетраметилмочевины (ТММ) в сухом хлористом метилене [15]. После удаления бензилиденовой защитной группы, ацетилирования реакционной смеси и хроматографического выделения получили дисахарид (VIIβ) с выходом 57%. В спектре ¹Н-ЯМР ацетата (VIIβ) сигналы протонов при С1, С2 и С3 ксилозного остатка представлены в виде двух уширенных синглетов, в которых КССВ J_1,2 не определяется. Сильнопольное положение сигнала протона при С2 маннозы (δ 4.39 м.д.) свидетельствует о гликозилировании по этому положению. Конфигурацию остатка ксилозы в полученном дисахариде доказывали после его дезацетилирования и снятия N‑трифторацетильной защиты. В спектре ¹Н-ЯМР аминопропильного производного (VIIIβ) величины КССВ сигналов протонов при С1b (J_1,2 7.8 Гц) и при С1а (J_1,2 < 1 Гц) подтверждают β-конфигурацию обоих пиранозных циклов.

Для оценки вклада β-маннозного фрагмента в связывание дисахарида (VIIIβ) с белками по аналогичной схеме из α-маннозида (IIIα) был синтезирован дисахарид c α-маннозным остатком (VIIIα). В спектре ¹Н-ЯМР величины КССВ сигналов протонов при С1b (J_1,2 7.8 Гц) и при С1а (J_1,2 1.7 Гц), а также химический сдвиг протона при С3 маннозного остатка (δ 3.80 м.д., табл. 1) подтверждают β-конфигурацию терминального ксилозного звена и α-конфигурацию маннозного остатка в полученном дисахариде.

Для подтверждения специфичности связывания растительных белков с дисахаридом необходимо исключить взаимодействие с его моносахаридными фрагментами, для этого были получены маннозиды (описаны выше) и ксилозиды (описаны далее) в виде 3-аминопропилгликозидов. Гликозилированием 3-трифторацетамидопропанола ацетобромксилозой (X) в хлористом метилене в присутствии AgOTf и ТММ после хроматографического разделения получили гликозид (XIβ) с выходом 53% и его аномер (XIα) с выходом 10% (схема 2 ). После их дезацетилирования и снятия N-трифторацетильной защиты получили аминопропильные производные ксилозы (XIIβ) и (XIIα). Конфигурацию аномерного центра остатка ксилозы определяли с помощью характеристической величины КССВ (J_1,2)^{в спектрах 1Н-ЯМР: 7.8 Гц для β-аномера и 3.7 Гц для α-аномера. Кроме того, положения сигналов протонов пиранозного цикла для соединений (XIβ) и (XIIβ) практически совпадают с таковыми для аминоэтильного производного ксилозы [12].}

Схема 1 . Синтез дисахарида Xylβ1-2Manβ-Osp и его фрагмента Manβ-Osp. Реагенты и условия: a – 0.05 M MeONa/MeOH, 1 ч; b – PhCH(OMe)₂, TsOH, MeCN; c – СF₃C(O)NH(CH₂)₃OH, NIS, ТfOH, CH₂Cl₂, 20 мин; d – 80% водн. AcOH, 70°C, 2 ч, затем Ac₂O/Py; e – BzCl, Py, –18°C, CH₂Cl₂; f – Ac₃XylBr, AgOTf, TMM, MS-4Å, CH₂Cl₂, 20°C, 16 ч; g – 0.1 M MeONa/MeOH 1 ч; h – 0.1 M водн. NaOH, 16 ч.

Схема 2 . Синтез 3-аминопропильных ксилозидов. Реагенты и условия: а – AcBr, AcOH, MeOH, CH₂Cl₂; b – CF₃C(O)NH(CH₂)₃OH, AgOTf, ТММ, CH₂Cl₂, MS-4Å; c – 0.1 M MeONa/MeOH, 1 ч; d – 0.1 M водн. NaOH, 16 ч.

Анализ спектров ¹³С-ЯМР (DEPT) синтезированных соединений подтверждает структуру целевого дисахарида (VIIIβ): сигналы С1а (δ 100.3 м.д.) маннозного фрагмента и С1b (δ 104.1 м.д.) ксилозного фрагмента хорошо согласуются с данными для 3-аминопропилгликозидов моносахаридов (δ 100.0 м.д. – С1 в соединении (IVβ), 103.0 м.д. – С1 в соединении (XIIβ) соответственно). Для его аномера (VIIIα): сигналы С1а (δ 97.9 м.д.) маннозного фрагмента и С1b (δ 102.5 м.д.) ксилозного фрагмента хорошо согласуются с данными для 3-аминопропилгликозидов моносахаридов (δ 98.9 м.д. – С1 в соединении (IVα), 103.0 м.д. – С1 в соединении (XIIβ) соответственно). О наличии аминопропильного агликона во всех полученных соединениях свидетельствуют положения сигналов углеродов (δ 37.5–37.8 м.д. CH₂NH₂; 26.7–28.3 м.д. ОCH₂CH₂CH₂NH₂).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Очистку и высушивание растворителей проводили по стандартным методикам и хранили над молекулярными ситами. Оптическое вращение измеряли на цифровом поляриметре DIP-360 (Jasco, Япония) при 20°С. Спектры ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР (DEPT) регистрировали на спектрометре AVANCE (Bruker BioSpin GmbH, Германия) при 25°С с рабочими частотами 700 и 176 Гц соответственно, значения химических сдвигов (δ, м.д.) приведены с использованием D₂O (δ = 4.75) и CDCl₃ (δ = 7.27) в качестве внутренних стандартов, константы спин-спинового взаимодействия измерены в герцах. Отнесение сигналов в спектрах ¹Н-ЯМР проводили с помощью эксперимента 2D ¹Н-¹Н COSY. Масс-спектры регистрировали на MALDI-TOF-спектрометре Vision-2000 (Thermo Bioanalysis Corp., Великобритания), в качестве матрицы использовали дигидроксибензойную кислоту. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках Kieselgel-60 (Merck, Германия), вещества обнаруживали 5%-ным водным раствором ортофосфорной кислоты при 150°С (углеводы) или раствором нингидрина (5 г/л в смеси ацетон–уксусная кислота–вода, 95 : 1 : 4, амины). Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле Kieselgel 60 (0.004–0.063 мм; Merck, Германия). ТСХ свободных 3‑аминопропилгликозидов проводили в системе А (метанол–1 М водный раствор Py⋅AcОН, 5 : 1).

Ацетилирование (общая методика) осуществляли смесью пиридина (Py) и уксусного ангидрида (2 : 1) при 20°С в течение 12–24 ч, затем реагенты соупаривали с толуолом.

О-дезацетилирование (общая методика) проводили по Земплену в сухом метаноле, добавляя к раствору ацилпроизводного раствор 2 М метилата натрия в метаноле до рН 8–9. По окончании реакции ионы Na⁺ удаляли катионитом DOWEX 50Х-400-H⁺ (Acros, Бельгия), раствор упаривали.

О-дезацетилирование и удаление N-трифторацетильной защиты (общая методика) проводили добавлением 100 мкл 2 М раствора метилата натрия в метаноле к раствору 0.05 ммоль защищенного соединения в 2 мл сухого метанола; через 1 ч раствор упаривали и добавляли 2 мл воды, через 16 ч хроматографировали на колонке с катионитом DOWEX 50Х-400-H⁺ (элюция 1 М водным раствором аммиака), раствор упаривали и лиофилизовали.

Получение ацетобромксилозы (X). К раствору 67 мг (0.21 ммоль) полного ацетата D-ксилозы (IX) в 2 мл сухого дихлорметана и 0.5 мл уксусной кислоты добавляли 0.25 мл (3.4 ммоль) бромистого ацетила, охлаждали до 0°С и добавляли 0.13 мл (3.2 ммоль) метанола; реакционную смесь выдерживали 1 ч при комнатной температуре и выливали в лед; органический слой разбавляли хлороформом и промывали последовательно водой, насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой, фильтровали через слой ваты, упаривали, соупаривали с толуолом, сушили в вакууме и без дополнительной очистки в тот же день использовали в реакциях гликозилирования, считая выход бромида количественным.

Гликозилирование (общая методика) в присутствии AgOTf/TMM: смесь гликозилакцептора (0.1 ммоль), трифлата серебра (0.2 ммоль), ТММ (0.2 ммоль) и 300 мг свежепрокаленных молекулярных сит 4 Å в 5 мл сухого хлористого метилена при комнатной температуре перемешивали 30 мин в темноте, добавляли раствор гликозилбромида (0.2 ммоль) в 2 мл хлористого метилена и перемешивали при комнатной температуре в течение 15–20 ч. Затем реакционную смесь фильтровали, фильтрат концентрировали в вакууме и выделяли продукт реакции хроматографией на силикагеле.

(3-Трифторацетамидопропил)-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-маннопиранозид (IIIβ). О-дезацетилирование 330 мг (0.84 ммоль) полного ацетата (I) [10] проводили по Земплену, без хроматографической очистки сухой остаток растворяли в 10 мл сухого ацетонитрила, добавляли 320 мг (2.1 ммоль) α,α-диметокситолуола и каталитические количества толуолсульфокислоты, через 1 ч реакционную смесь нейтрализовали пиридином, упаривали, соупаривали с толуолом. После хроматографического выделения (элюция толуол, затем толуол : этилацетат, 20 : 1) получили 270 мг (81%) тиогликозида (II). Смесь 3-трифторацетамидопропанола (165 мкл, 1.35 ммоль), тиогликозида (II) (270 мг, 0.68 ммоль) и молекулярных сит 4 Å в 5 мл сухого хлористого метилена перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 225 мг (1 ммоль) NIS и TfOH (0.1 ммоль) в виде 0.1 М раствора в сухом хлористом метилене, перемешивали при комнатной температуре в течение 20–30 мин, фильтровали, фильтрат промывали последовательно 10%-ным раствором Na₂S₂O₃, водой, упаривали, соупаривали с толуолом. Без хроматографической очистки сухой остаток растворяли в 5 мл 80%-ной водной уксусной кислоты, выдержали 2 ч при 70°С, затем соупаривали с толуолом и проводили ацетилирование в 6 мл смеси пиридина и уксусного ангидрида (2 : 1). После хроматографического разделения реакционной смеси (элюция толуол–этилацетат, 1 : 1) получили 110 мг (33%) продукта (IIIβ) и 152 мг (46%) его аномера (IIIα).

(3-Аминопропил)-β-D-маннопиранозид (IVβ). Дез-О-ацетилированием и удалением N-трифторацетильной защиты из 50 мг (0.1 ммоль) моносахарида (IIIβ) получили 23 мг (98%) продукта (IVβ).

(3-Аминопропил)-α-D-маннопиранозид (IVα). Дез-О-ацетилированием и удалением N-трифторацетильной защиты из 50 мг (0.1 ммоль) моносахарида (IIIα) получили 21 мг (90%) продукта (IVα).

(3-Трифторацетамидопропил)-4,6-бензилиден-3-бензоил-β-D-маннопиранозид (VIβ). О-дезацетилирование 220 мг (0.44 ммоль) полного ацетата (IIIβ) проводили по Земплену, без хроматографической очистки сухой остаток растворяли в 12 мл сухого ацетонитрила, добавляли 80 мг (0.53 ммоль) α,α-диметокситолуола и каталитические количества толуолсульфокислоты, через 1 ч реакционную смесь нейтрализовали пиридином, упаривали, соупаривали с толуолом. Сухой остаток растворяли в 4 мл сухого дихлорметана, содержащего пиридин (0.8 мл), охлаждали до –18°С и добавляли 56 мкл (0.48 ммоль) бензоилхлорида. Через 1 ч реакционную смесь разбавляли дихлорметаном, промывали 1 М раствором HCl, затем водой. Органический слой фильтровали через слой ваты, соупаривали с толуолом, хроматографировали на силикагеле (элюция толуол–этилацетат, 2 : 1) и получили 125 мг (54%) продукта (VIβ).

(3-Трифторацетамидопропил)-2,3,4-три-О-ацетил-β-D-ксилозопиранозил-(1→2)-3-бензоил-4,6-ди-О-ацетил-β-D-маннопиранозид (VIIβ). Гликозилирование акцептора (VIβ) (125 мг, 0.24 ммоль) ацетобромксилозой (X), полученной из 151 мг (0.48 ммоль) полного ацетата (IX), проводили по общей методике, без хроматографической очистки сухой остаток растворяли в 5 мл 80%-ной водной уксусной кислоты, выдерживали 2 ч при 70°С, соупаривали с толуолом и ацетилировали 6 мл смеси пиридина и уксусного ангидрида (2 : 1). Хроматографией на силикагеле (элюция толуол–этилацетат, 3 : 2 → 1 : 1) получили 105 мг (57%) дисахарида (VIIβ).

(3-Трифторацетамидопропил)-2,3,4-три-О-ацетил-β-D-ксилозопиранозил-(1→2)-3-бензоил-4,6-ди-О-ацетил-α-D-маннопиранозид (VIIα). Как описано выше для синтеза (VIIIβ), из 200 мг соединения (IIIα) получили 60 мг продукта (VIIα).

(3-Аминопропил)-β-D-ксилозопиранозил-(1→2)-β-D-маннопиранозид (VIIIβ). Дез-О-ацетилированием и удалением N-трифторацетильной защиты из 45 мг (0.058 ммоль) дисахарида (VIIβ) получили 20.5 мг (98%) продукта (VIIIβ).

(3-Аминопропил)-β-D-ксилозопиранозил-(1→2)-α-D-маннопиранозид (VIIIα). Дез-О-ацетилированием и удалением N-трифторацетильной защиты из 50 мг (0.064 ммоль) дисахарида (VIIα) получили 22 мг (95%) продукта (VIIIα).

(3-Трифторацетамидопропил)-2,3,4-три-О-ацетил-β-D-ксилопиранозид (XIβ). Гликозилированием ацетобромксилозы (X), полученной из 318 мг (1 ммоль) полного ацетата (IX), 3-трифторацетамидопропанола (244 мкл, 2 ммоль) по общей методике после хроматографического разделения (элюция гексан–этилацетат, 1 : 1) получили 227 мг (53%) ксилопиранозида (XIβ) и 42 мг (10%) его аномера (XIα).

(3-Аминопропил)-β-D-ксилопиранозид (XIIβ). Дез-О-ацетилированием и удалением N-трифтор-ацетильной защиты из 155 мг (0.36 ммоль) полного ацетата (XIβ) получили 72 мг (97%) моносахарида (XIIβ).

(3-Аминопропил)-α-D-ксилопиранозид (XIIα). Дез-О-ацетилированием и удалением N-трифтор-ацетильной защиты из 42 мг (0.1 ммоль) полного ацетата (XIα) получили 18 мг (90%) моносахарида (XIIα).

Физико-химические характеристики (данные ¹Н- и ¹³С-ЯМР, масс-спектров, оптическое вращение) синтезированных соединений приведены в дополнительных материалах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Был синтезирован характерный для растительных гликопротеиновых цепей дисахаридный фрагмент Xylβ1-2Manβ-O(CH₂)₃NH₂ (VIIIβ), а также некоторые его аналоги и частичные структуры, также необходимые для характеризации белков, узнающих целевой дисахарид, а именно Xylβ1-2Manα-O(CH₂)₃NH₂ (VIIIα), Xylβ-O(CH₂)₃NH₂ (XIIβ), Xylα-O(CH₂)₃NH₂ (XIIα), Manα-O(CH₂)₃NH₂ (IVα) и Manβ-O(CH₂)₃NH₂ (IVβ). Строение всех полученных соединений подтверждено данными ¹Н- и ¹³С‑ЯМР-спектроскопии (700 МГц) c использованием эксперимента COSY и данными масс-спектрометрии.

Полученные соединения вместе с другими (ранее синтезированными) гликанами и фрагментами полисахаридов вошли в состав гликанового эррея, с помощью которого в настоящее время изучается специфичность выделенных ранее индивидуальных лектинов, а также проводится поиск ксилоза-узнающих белков в составе растительных экстрактов.