Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 3, стр. 340-351

ВВЕДЕНИЕ

Хитозан – один из самых распространенных полисахаридов, представляющий собой линейный сополимер D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, соединенных между собой 1,4-β-гликозидными связями. За счет наличия свободной первичной аминогруппы он проявляет свойства поликатиона [1] и способен к взаимодействию с различными органическими и неорганическими соединениями. Благодаря этому хитозан находит широкое применение в различных областях деятельности человека: в создании гибридных гидрогелей и суперабсорбентов для сельского хозяйства и гигиенической промышленности [1–4], в биомедицинских целях для разработки систем доставки биологически активных веществ и новых форм лекарственных препаратов, в тканевой инженерии [5–8] и т.д.

Для расширения возможностей применения хитозана целесообразно проводить его химическую модификацию. Хорошо известно, что макромолекулы поли-β-гликозидов связаны большим количеством внутри- и межмолекулярных водородных связей, образующихся между гидроксильными и аминогруппами пиранозных колец [9]. Это сказывается на их способности растворяться в воде: хитозаны с M_r > 10 000 растворимы только в кислых средах с рН < 6.5 [10]. Введение же функциональных групп, блокирующих центры образования водородных связей, позволяет повысить рН-диапазон растворимости этого полимера. Кроме того, введение новых групп может увеличить конъюгирующую способность или биологическую активность. Например, введение в макромолекулы остатков янтарной кислоты усиливает антибактериальные свойства хитозана [11].

Перспективно использование хитозана и его производных в качестве матриц для адсорбционной иммобилизации ферментов. Создание иммобилизованных форм энзимов позволяет расширить оптимумы каталитической активности последних, а также защитить их от негативного воздействия окружающей среды [12–15]. Однако из-за ограниченной способности хитозана к растворению в водных средах процесс иммобилизации белков может протекать недостаточно полно ввиду стерической недоступности функциональных групп полисахаридных макромолекул, а также несовпадения значений рН растворов, требуемых для растворения полисахарида, с рН-оптимумами ферментов. Поэтому использование водорастворимых производных хитозана, сочетающих в себе нетоксичность и биосовместимость природного полимера с увеличенной способностью к растворению в воде, позволит создать более эффективные формы иммобилизованных ферментных препаратов.

Папаин – растительный фермент, получаемый из плодов папайи Carica papaya. Это глобулярный белок, состоящий из 212 а.о., с молекулярной массой 23 кДа. Папаин – цистеиновая протеаза, он стабилен в широком диапазоне условий, даже при высоких температурах, обладает терапевтическими свойствами, такими как антибактериальное, антиоксидантное и противоопухолевое действие. Кроме того, папаин может защищать клетки от повреждений, вызванных H₂O₂ [16].

Применение ферментов (в том числе, папаина) в свободной форме затруднено по ряду причин, к которым можно отнести трудоемкость их отделения от исходных реагентов и продуктов реакции после завершения процесса, неустойчивость (лабильность) энзимов к окружающим факторам, а также при различных внешних воздействиях, трудоемкость их очистки.

Иммобилизация ферментов на твердых носителях поможет преодолеть эти недостатки за счет повышения стабильности по сравнению со свободной формой энзима. Температура, pH и используемый растворитель – важные факторы, которые напрямую влияют на структуру фермента. Эти факторы следует оптимизировать в процессе иммобилизации. Иммобилизованный фермент имеет более жесткую молекулярную структуру, менее подвержен конформационным изменениям и иногда характеризуется более высокой доступностью активного центра для биокатализа. Кроме того, активность фермента может увеличиваться после иммобилизации за счет изменения конформации фермента [17].

Цель настоящей работы – синтез водорастворимых производных хитозана – N-малеоилхитозана и N-сукциноилхитозана – c различными молекулярными массами для дальнейшего использования в качестве матриц для адсорбционной иммобилизации папаина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярная масса полимера – одна из ключевых характеристик, определяющих его физико-химические и биологические свойства, такие как способность к растворению, токсичность, конъюгирующая способность и др. Например, в работе Kuznetsov et al. [18] показано, что снижение молекулярной массы полимеров, используемых в качестве экстрагентов аминокислот, приводит к повышению количественных характеристик экстракции ввиду увеличения стерической доступности функциональных групп, участвующих в процессе связывания целевых компонентов. В связи с этим первым этапом настоящего исследования было получение хитозанов с различными молекулярными массами. Наиболее доступный в лабораторных условиях способ влияния на величину молекулярной массы полисахаридов – кислотный гидролиз. В литературе имеются данные об использовании уксусной, азотной, серной и соляной кислот для гидролиза полисахаридных молекул [18–20]. Однако азотная кислота, как мощный окислитель, может вызвать ряд побочных процессов; серная кислота – двухосновная, поэтому ее использование может привести к сшивке макромолекул хитозана; процесс деструкции полисахаридов в слабой уксусной кислоте протекает с невысокой скоростью; в связи с чем для деструкции хитозана мы использовали соляную кислоту. Механизм возможных при деструкции полисахарида процессов представлен на рис. 1 [21, 22].

Для того чтобы подтвердить структуру образовавшегося в процессе деструкции вещества, нами был использован метод ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием. ИК-спектр коммерческого хитозана (рис. 2a, кривая 1) содержит полосы поглощения в области 1024–1058 см^–1, относящиеся к колебаниям группы С–О–С пиранозного цикла, ряд полос при 1256, 1374, 1420 и в области 1917–2848 см^–1, соответствующих деформационным колебаниям метильных и метиленовых групп циклического фрагмента полисахарида, при 1651 см^–1 – полоса амид I – валентные колебания группы С=О, при 1581 см^–1 – полоса амид II – колебания первичной аминогруппы [21]. Также в спектре присутствует широкая полоса поглощения при 3353 см^–1, относящаяся к колебаниям ОН-групп молекул воды, ассоциированных с макромолекулами полимера. В ИК-спектре хитозана, деструктированного кислотным гидролизом под действием раствора соляной кислоты, вышеперечисленные полосы также присутствуют (рис. 2a, кривая 2). Кроме того, в спектре деструктированного полимера появляется новая низкоинтенсивная полоса поглощения при 2876 см^–1 [22], относящаяся к валентным колебаниям гидрохлоридов первичных аминов.

Молекулярные массы деструктированного хитозана, рассчитанные по уравнению Марка–Куна–Хаувинка–Сакурады, с учетом величин констант K и α, взятых из литературных данных, составили 350 и 200 кДа. Известно [22], что растворимость хитозана в воде зависит от величины его молекулярной массы. Полученные кислотной деструкцией образцы не растворяются в воде, в связи с чем следующим этапом работы был синтез водорастворимых производных хитозана из полученных полимеров.

Для получения водорастворимых производных хитозана была осуществлена модификация полисахарида ангидридами янтарной и малеиновой кислот. Выбор ацилирующих агентов обусловлен тем, что янтарная кислота и ее производные играют важную роль в метаболизме клетки, а также они нетоксичны для организма человека и животных. Малеиновая кислота – аналог янтарной, однако содержит кратную связь между атомами С-2 и С-3, что оказывает влияние на химические свойства соединения. В связи с этим представляет интерес сравнение свойств хитозанов, модифицированных остатками этих кислот, как матриц для иммобилизации папаина. Схема реакции модификации хитозана представлена рис. 3.

Структуры полученных производных подтверждали с помощью ИК-спектроскопии. В ИК-спектре N-малеоилхитозана (рис. 2б, кривая 3) присутствуют характерные для хитозана полосы поглощения, описанные выше, а также появляется новая полоса поглощении при 1746 см^–1, соответствующая колебаниям группы карбонила карбоксильных групп, введенных в пиранозный цикл полисахарида. Наличие этой полосы в ИК-спектре, а также способность к растворению в воде подтверждают успешность синтеза производных хитозана.

В ИК-спектре N-сукциноилхитозана (рис. 2б, кривая 4) наблюдается значительное увеличение интенсивности и смещение полос поглощения, соответствующих колебаниям карбонильных (с 1651 до 1632 см^–1) и первичных аминогрупп (с 1581 до 1546 см^–1), а также появляется новая полоса поглощения при 2924 см^–1, относящаяся к колебаниям метиленовых групп остатков янтарной кислоты [23]. Спектральные данные подтверждают образование желаемого продукта реакции, а также присоединение заместителя через аминогруппу хитозана.

Использованные для синтеза реакции относятся к полимераналогичным превращениям, поэтому молекулярные массы синтезированных продуктов не определяли, принимая их равными массам используемых в синтезе полисахаридов.

Степени замещения синтезированных производных хитозана рассчитывали из данных кислотно-основного титрования [24]. Результаты определения приведены в табл. 1. Как видно из представленных данных, с увеличением молекулярной массы модифицированного хитозана уменьшается эффективность замещения, что обусловлено влиянием стерического фактора на доступность функциональных групп макромолекул полисахарида.

Для проектирования гетерогенного биокатализатора необходимо понимать механизм взаимодействия носителя с молекулами фермента. Мы изучили типы взаимодействий, энергии связывания, аминокислотный состав поверхностей папаина, которые в процессе адсорбции взаимодействуют с носителем (рис. 4–6). Из рисунков видно, что связи и взаимодействия с хитозаном и его производными образуются с участием активного центра фермента (Cys25 и His159), что, естественно, должно отразиться на активности иммобилизованных образцов. Аффинность связывания папаина с хитозаном составила –6.9, с N‑малеоилхитозаном –8.3, а с N-сукциноилхитозаном –7.6 ккал/моль (табл. 2), что указывает на более высокую степень сродства фермента к N-малеоилхитозану при иммобилизации. Анализ содержания белка в гетерогенных препаратах также показал, что наибольшее количество папаина (мг/г носителя) сорбируется на N-малеоилхитозане с молекулярной массой 350 кДа (рис. 7). Однако при этом фермент, вероятно, находится в каталитически невыгодной конформации, что отрицательно сказывается на его протеолитической активности. Общая активность папаина (ед./мл раствора) оказалась выше при его иммобилизации на хитозане с молекулярными массами 200 и 600 кДа (рис. 8). Наибольшую удельную активность показали образцы, адсорбированные на матрице хитозана и N-сукциноилхитозана с молекулярной массой 200 кДа (рис. 9). В целом же прослеживается следующая закономерность: чем больше образуется связей и взаимодействий с матрицей полимера, тем ниже удельная активность получаемого биокатализатора.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использован хитозан из креветочных панцирей со средней молекулярной массой 600 кДа и степенью деацетилирования 0.85 (ООО “Биопрогресс”, Россия). Для получения водорастворимых производных хитозана применяли янтарный и малеиновый ангидриды (оба >98%; Sigma, США). Все реактивы использовали без дополнительной очистки.

Для получения хитозанов с различными молекулярными массами проводили кислотный гидролиз исходного полисахарида. Навеску хитозана массой 1 г растворяли в 100 мл 2%-ного водного раствора уксусной кислоты, после чего переносили раствор в круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником, добавляли 50 мл 0.1 М водного раствора НСl и кипятили в течение 10 или 20 мин. Далее смесь охлаждали до комнатной температуры, раствор нейтрализовали водным раствором аммиака до слабощелочного значения рН. Полимер из реакционной массы выделяли осаждением в изопропиловый спирт, после чего промывали дистиллированной водой и этиловым спиртом и сушили в вакуумном сушильном шкафу до постоянной массы.

Молекулярные массы деструктированных хитозанов определяли общепринятым вискозиметрическим методом с помощью вискозиметра Уббелоде (Cannon Instrument Company, США) в смеси водных растворов 0.3 М уксусной кислоты и 0.2 М ацетата натрия при 25°С. Из данных вискозиметрии с помощью уравнения Марка–Куна–Хаувинка–Сакурады вычисляли значения молекулярных масс:

где [η] – характеристическая вязкость (дл/г), рассчитанная из данных вискозиметрии; М – средневязкостная молекулярная масса полимера; K и α – константы, равные 82 × 10^–5 дл/г и 0.76 соответственно [25].

N-сукциноилхитозан получали по следующей методике. Навеску хитозана массой 2 г растворяли в 200 мл 2%-ного водного раствора уксусной кислоты. Затем растворяли 0.4 г янтарного ангидрида в 25 мл ацетона и вносили по каплям в течение 30 мин в раствор хитозана. Полученную смесь выдерживали 2 ч на водяной бане при 50°С, далее смесь охлаждали до комнатной температуры. Полимер из реакционной массы выделяли осаждением в 4-метил-2-пентанон, после чего промывали этиловым спиртом, отфильтровывали и сушили в вакуумном сушильном шкафу до постоянной массы.

Для синтеза N-малеолилхитозана навеску хитозана массой 1.6 г растворяли в 100 мл 2%-ного водного раствора уксусной кислоты и перемешивали до полного растворения хитозана. Затем растворяли 3 г малеинового ангидрида в 50 мл этилового спирта и вносили в раствор хитозана. Смесь выдерживали 4 ч при комнатной температуре. Полимер из реакционной массы выделяли осаждением в 4-метил-2-пентанон, после чего промывали этиловым спиртом и сушили в вакуумном сушильном шкафу до постоянной массы.

Модификацию хитозанов подтверждали с помощью метода ИК-спектроскопии. ИК-спектры регистрировали в диапазоне частот 4000–400 см^–1 на спектрометре Bruker Vertex 70 с Фурье-преобразователем (Bruker Optics, Германия) методом нарушенного полного внутреннего отражения.

Степень замещения полученных полимеров определяли титриметрически согласно методике, представленной в работе Kasaai [26].

Иммобилизацию папаина на матрице хитозана и его производных осуществляли адсорбционным методом. К 1 г хитозана добавляли 20 мл раствора фермента (в концентрации 2 мг/мл в глициновом буфере, рН 9.0), инкубировали в течение 2 ч. После окончания инкубации образовавшийся осадок (в виде геля) промывали 50 мМ Tris-HCl-буфером (pH 7.5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ “Спектр”, Россия) при λ = 280 нм).

Содержание белка в иммобилизованных препаратах папаина определяли методом Лоури [27]. Определение протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [28]. К 50 мг образца добавляли 200 мкл Tris-HCl-буфера, pH 7.5, 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ Tris-HCl-буфере, pH 7.5) и инкубировали 2 ч при 37°C. Далее добавляли 800 мкл ТХУ (5%), инкубировали 10 мин при 4°C, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13 000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3%-ного NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1-см кювете на спектрофотометре СФ-2000. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл Tris-HCl-буфера. За единицу каталитической активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин.

Удельную протеолитическую активность папаина (ед./мг) рассчитывали по формуле:

где А – протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка; D – оптическая плотность при 410 нм; 1000 – пересчет в мкМ; 120 – время инкубации, мин; 200 – объем пробы, мкл; С – концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури.

Статистическую значимость различий величин контрольных и опытных показателей определяли по t-критерию Стьюдента (при p < 0.05), поскольку все показатели характеризовались нормальным распределением.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Были синтезированы производные N-сукциноилхитозана и N-малеоилхитозана с молекулярными массами 200, 350 и 600 кДа. Структура полученных производных подтверждена методом ИК-спектроскопии. Осуществлена адсорбционная иммобилизация папаина на хитозане и его производных. In silico изучены типы взаимодействий, энергии связывания, аминокислотный состав поверхностей папаина, которые в процессе адсорбции взаимодействуют с носителем. Выявлена следующая закономерность: чем больше образуется связей и взаимодействий с матрицей полимера, тем ниже удельная активность получаемого биокатализатора. Установлено, что оптимальное соотношение содержания белка (мг/г носителя), общей активности (ед./мл раствора) и удельной активности (ед./мг белка) наблюдается при иммобилизации папаина на матрице хитозана и N-сукциноилхитозана с молекулярной массой 200 кДа.

Полученные результаты могут быть полезны при разработке промышленных катализаторов и медицинских препаратов на основе иммобилизованного папаина.