Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 3, стр. 302-312

ВВЕДЕНИЕ

Грамотрицательные альфа-протеобактерии рода Azospirillum широко распространены в ассоциациях с дикими и культурными злаками в различных климатических зонах [1]. Впервые азоспириллы были описаны в 1925 г., но получили широкую известность только после повторного “открытия” в 1970-х гг. в Бразилии [2], которое стало краеугольным камнем в изучении феномена ассоциативности и дало толчок развитию этой отрасли науки. За 40 лет исследований растительно-микробных ассоциаций с участием азоспирилл представления об их рост-стимулирующем действии эволюционировали от аддитивной гипотезы, заключающейся в способности фиксировать азот и продуцировать фитогормоны, до гипотезы множественных механизмов, включающей также улучшение минерального питания, снижение биотических и абиотических стрессов, биоконтроль патогенов [1, 3]. На сегодняшний день род Azospirillum включает 22 вида [4], большинство из которых ризосферные, однако в последнее время все чаще сообщается о выделении новых видов из нехарактерных для азоспирилл экологических ниш, к примеру, сульфидных и термальных источников, отработанного дорожного покрытия, торфяных болот [5]. Высокий адаптационный потенциал этих бактерий объясняется избыточностью и пластичностью их генома и высокой долей генов, привнесенных путем горизонтального переноса [6].

Как наиболее изученные среди бактерий, стимулирующих рост и развитие растений, азоспириллы входят в состав биоудобрений и широко используются в ряде стран Южной Америки, приводя к значимому увеличению урожайности злаков – на 5–30% в 60–70% случаев полевых экспериментов [3, 7]. Для минимизации нежелательных эффектов при инокуляции азоспириллами необходимо учитывать ряд факторов, в их числе состояние аборигенной микрофлоры, уровень минерального питания почвы, вариабельность сортов растений и характеристик используемых штаммов-иннокулятов с точки зрения оказываемого на растения рост-стимулирующего эффекта [8]. Расширение фундаментальных знаний о молекулярных механизмах ассоциативного взаимодействия растений и азоспирилл, с учетом штаммовой вариабельности, необходимо для повышения эффективности их использования в сельском хозяйстве.

Известно, что начальные стадии формирования ассоциаций, такие как прикрепление клеток, адсорбция и образование биопленок на поверхности корней, реализуются с участием гликополимеров, формирующих поверхность бактериальных клеток, – капсульных полисахаридов и липополисахаридов (ЛПС) [9]. ЛПС – основной структурный компонент внешней мембраны грамотрицательных бактерий, также он обнаруживается в составе экстраклеточных полимерных субстанций. В среде культивирования азоспирилл ЛПС находится в виде липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК) [9] и может использоваться бактериями в качестве источника углерода в условиях голодания [10]. Показана способность ЛПС азоспирилл к индукции деформации корневых волосков [10], повышению пероксидазной активности и продукции пероксида водорода, увеличению длины и массы корней у проростков пшеницы [11], а также их положительное влияние на морфогенность каллусов и выход растений-эксплантов [12].

ЛПС – амфифильная макромолекула, состоящая из трех доменов, связанных друг с другом ковалентными связями: гидрофобного липида А и гидрофильного полисахарида, включающего коровый олигосахарид и О-специфический полисахарид (ОПС) (О-антиген). Разнообразие природы моносахаридов, входящих в состав ОПС, в сочетании с различными типами связей между ними, предоставляет практически безграничные возможности структурного многообразия этих биополимеров, обусловливая серологическую вариабельность штаммов одного вида. В последние годы установлено более 20 типов повторяющихся звеньев ОПС для представителей семи видов азоспирилл: A. brasilense, A. lipoferum [13], A. halopraeferens [14], A. dobereinerae [15], A. fermentarium [16], A. formosense [17] и A. rugosum [18]. Большая часть ОПС – разветвленные гетерополисахариды, за исключением A. baldaniorum Sp245 и серологически родственной ему группы штаммов, а также типовых штаммов A. doebereinerae и A. fermentarium. Регулярность строения ОПС ряда штаммов азоспирилл маскируется наличием нескольких типов повторяющихся звеньев, а также нерегулярным метилированием и ацетилированием моносахаридных остатков, что затрудняет применение данных о строении ОПС для построения хемотипических классификационных схем. В большинстве случаев типовые штаммы азоспирилл характеризуются наличием уникального по структре ОПС, за исключением штамма A. baldaniorum Sp245(T), для которого показано структурное родство ОПС с рядом штаммов A. lipoferum и A. brasilense [13], а также штамма A. rugosum DSM 19657(T), имеющего в составе ОПС два полисахарида, обнаруженных ранее у A. brasilense Jm125A2 [18].

Биосинтез О-антигенов подробно изучен на примере энтеробактерий, у которых гены синтеза нуклеотидных предшественников моносахаридов, гены гликозилтрансфераз и гены трансмембранного переноса и полимеризации О-единиц, ответственные за синтез ОПС, обычно сгруппированы вместе в кластер, расположенный на хромосоме [19]. Сборка и синтез ОПС осуществляется по трем известным путям: Wzx/Wzy-зависимому пути, посредством ABC-транспортера или синтазы [19]. Для азоспирилл до сих пор не сообщалось о структуре кластера генов, ответственного за биосинтез О-антигена.

Цель настоящей работы – получение сведений о строении О-антигенов типовых штаммов ранее не изученных видов A. zeae N7(T) [20], A. melinis TMCY 0552(T) [21] и A. palustre B2(T) [5] и анализ генов, вовлеченных в биосинтез их ОПС.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате скрининга серологической специфичности экстрактов ЛПС ранее не изученных видов азоспирилл из Коллекции микробных культур ИБФРМ РАН были отобраны штаммы A. zeae N7(T), A. melinis TMCY 0552(T) и A. palustre B2(T), демонстрировавшие иммунохимический перекрест с антисыворотками к ЛПБК штамма A. lipoferum Sp59b. Наличие в составе поверхностных гликополимеров указанных штаммов эпитопов, обусловливающих серологический перекрест со штаммом A. lipoferum Sp59b, позволило отнести их к серогруппе III, представители которой характеризуются присутствием фрагмента →3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-L-Rhap-(1→3 в составе ОПС [13].

Детальный иммунохимический анализ был проведен с использованием препаратов ЛПС, выделенных водно-фенольной экстракцией из сухой биомассы исследуемых бактерий. В тесте двойной радиальной иммунодиффузии было детектировано слияние полос преципитации антител к ЛПБК штамма A. lipoferum Sp59b с гомологичными и исследуемыми антигенами (рис. 1а) и отсутствие взаимодействия с ЛПС A. baldaniorum Sp245 и A. brasilense Sp7, A. brasilense Jm6B2, A. brasilense SR80. В ИФА наблюдались межштаммовые различия в интенсивности взаимодействия антиген–антитело, однако тенденция взаимодействия ЛПС изучаемых штаммов с антителами была сходна гомологичному антигену (рис. 1б).

Рис. 1.

(a) – Результат двойной радиальной иммунодиффузии препаратов липополисахаридов A. palustre B2 (1), A. melinis TMCY 0552 (2), A. zeae N7 (3) и A. lipoferum Sp59b (4) с антителами к липополисахарид-белковому комплексу A. lipoferum Sp59b (5); (б) – результат иммуноферментного анализа препаратов липополисахаридов исследуемых штаммов с антителами к липополисахарид-белковому комплексу A. lipoferum Sp59b.

Электрофоретический анализ выделенных препаратов ЛПС в SDS-ПААГ с последующим окрашиванием нитратом серебра демонстрировал превалирование ОПС-содержащих фракций, визуализирующихся в верхней части трека, а также наличие в нижней части трека высокоподвижных фракций, содержащих кор и липид А (рис. 2). В отличие от ЛПС гамма-протеобактерии Pseudomonas putida TSh-18, представлявшего собой смесь молекул в широком диапазоне молекулярной массы, отличающихся на одно повторяющееся звено, у ЛПС азоспирилл наблюдалось преобладание фракций ЛПС в диапазоне молекулярных масс 20–25 кДа. Высокомолекулярная природа ЛПС исследуемых штаммов свидетельствует о доминировании S-форм молекул, следовательно, идентичные или сходные антигенные детерминанты, обусловливающие перекрест со штаммом Sp59b, могут быть локализованы в составе их ОПС.

Рис. 2.

Электрофореграмма препаратов липополисахаридов в 13.5%-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия: A. palustre B2 (1), A. zeae N7 (2), A. melinis TMCY 0552 (3), P. putida TSh-18 (4).

Выполнен анализ состава и физико-химических свойств ЛПС и структуры ОПС исследуемых штаммов для выявления химической природы серологического перекреста. Анализ состава жирных кислот ЛПС методом ГЖХ после получения соответствующих метиловых эфиров выявил преобладание во всех препаратах 3-гидрокситетрадекановой и 3-гидроксигексадекановой кислот, суммарное содержание которых превышало 70% от суммы всех идентифицированных производных, а также присутствие гексадекановой, гексадеценовой и октадеценовой кислот. Учитывая консервативность строения липида А в пределах бактериального рода, профиль жирных кислот исследуемых штаммов согласовывался с данными, полученными ранее для ЛПС представителей других видов азоспирилл [15–18].

В силу амфифильной природы в водных растворах препараты ЛПС могут формировать надмолекулярные комплексы (мицеллы). Основная движущая сила самоагрегации ЛПС – гидрофобное взаимодействие между ацильными цепями липида А. Размер мицелл определяется строением липида А и ОПС и соотношением этих компонентов в препарате ЛПС [22], таким образом, при схожести строения отдельных структурных компонентов ЛПС могут существенно отличаться по функциональной активности, т.к. различным образом агрегируют в водных растворах. Измерение методом динамического рассеяния света размера и ζ-потенциала мицелл (табл. 1), образованных из молекул ЛПС A. zeae N7(T) и A. palustre B2(T), выявило, что оба препарата в концентрации 2 мг/мл при температуре 37°С в водной среде образовывали отрицательно заряженные мицеллы размером 27.5 и 41.0 нм соответственно. Интенсивность рассеяния света (I) раствора ЛПС A. palustre была в 1.5 раза выше таковой для ЛПС A. zeae. Поскольку электрофоретический анализ не выявил значительных отличий в степени полимеризации ОПС исследуемых штаммов, наблюдаемые отличия в размере мицелл их ЛПС могут быть обусловлены микрогетерогенностью строения липида А (соотношением форм с различной степенью ацилирования). Определение относительной численной концентрации (N_отн) и относительной массово-объемной концентрации (C_отн) по формулам, описанным нами ранее [23], показало, что в исследованных условиях количество мицелл, образованных ЛПС A. palustre B2(T), и количество ЛПС, участвующего в мицеллообразовании, существенно ниже, чем ЛПС A. zeae N7(T).

ОПС исследуемых штаммов были получены мягким кислотным гидролизом ЛПС с последующей гель-фильтрацией. Анализ моносахаридного состава методом ГЖХ ацетатов полиолов, полученных после полного кислотного гидролиза всех препаратов ОПС, позволил идентифицировать в их составе наличие Rha и Glc в соотношении ~3 : 1 (отклик детектора). В результате анализа ГЖХ ацетилированных (S)-2-октилгликозидов была установлена D-конфигурация Glc и L-конфигурация остатков Rha.

Структура ОПС изучаемых штаммов была установлена с применением 1D и 2D ¹H- и ¹³С-ЯМР-спектроскопии. Спектры ¹H- и ¹³C-ЯМР ОПС исследуемых штаммов были практически идентичны (рис. 3), что свидетельствовало о структурном сходстве О-антигенов.

Рис. 3.

¹H-ЯМР-спектры О-специфических полисахаридов A. palustre B2 (а) и A. zeae N7 (б).

¹H-ЯМР-спектр содержал пять сигналов в слабопольной области при δ 4.63–5.24, сигналы метильных групп рамнозы при δ 1.26–1.32, сигнал О-ацетильной группы при δ 2.21 и сигналы протонов моносахаридных циклов при δ 3.31–4.39. ¹³С-ЯМР-спектр содержал сигналы четырех аномеров при δ 99.8–105.3, сигналы метильных групп рамнозы при δ 17.8–18.0, сигнал О-ацетильной группы при δ 22.2 (СН₃), δ 175.5 (СО), сигнал СН₂ОН-группы при δ 62.2 и сигналы углерода моносахаридных циклов при δ 70.3–81.3. Отсутствие в спектре сигналов углерода моносахаридных циклов в области δ 83–88 свидетельствовало о пиранозной форме моносахаридных остатков [24].

Сигналы ¹H- и ¹³C-ЯМР-спектров были отнесены с применением 2D-спектров ЯМР (гомоядерные эксперименты ¹Н, ¹Н COSY, TOCSY, ROESY и гетероядерные эксперименты ¹Н, ¹³С HSQC и HMBC). Химические сдвиги сигналов моносахаридных остатков приведены в табл. 2. На основании внутризвеньевых корреляций Н, Н и Н, С и констант спин-спинового взаимодействия ³J_H,H были идентифицированы спин-спиновые системы четырех моносахаридов: A, B и С, имеющих манно-конфигурацию, и D, имеющего глюко-конфигурацию. Спектр TOCSY продемонстрировал наличие Н1/Н2 и Н2/Н3 – Н-6 кросс-пиков для остатков A–C и Н1/Н2 – H-6 кросс-пики для остатка D. Сигналы внутри каждой спин-спиновой системы были отнесены с помощью спектров СOSY.

Альфа-конфигурация остатков А–С и бета-конфигурация остатка D были установлены на основании характеристических химических сдвигов сигналов С-5 при сравнении с литературными данными [24, 25].

Позиции замещения моносахаридов были установлены на основании сдвига в слабое поле сигналов С2 и С3 остатка A, С-3 остатков B и С по сравнению с соответствующими незамещенными моносахаридами [24, 25]. Химические сдвиги C2–C6 остатка D были близки к таковым O-метил-β-Glcp [24] и указывали на то, что остаток D занимает терминальное положение в боковой цепи. Последовательность моносахаридов была установлена на основании спектров ROESY, которые демонстрировали межзвеньевые корреляции между аномерными протонами и протонами при трансгликозидных связях: А Н1/В Н3 при δ 5.11/3.74; B H1/C H3 при δ 5.03/4.04, C H1/А H2 при δ 5.24/4.39, D H1/A H3 при δ 4.63/4.03. В спектрах ¹Н- и ¹³С-HMBC наблюдались соответствующие корреляции между аномерными протонами и атомами углерода при гликозидной связи: А Н1/В С3 при δ 5.11/78.6; B H1/C С3 при δ 5.03/77.0, C H1/А С2 при δ 5.24/78.5, D H1/A С3 при δ 4.63/81.3.

На основании проведенных исследований была идентифицирована структура повторяющегося звена ОПС исследуемых микроорганизмов: три остатка рамнозы в основной цепи и остаток глюкозы в боковой цепи (рис. 4). На основании интегральной интенсивности сигналов аномерного протона остатка С с ацетильной и без ацетильной групп (δ_H 5.13 м.д. [26]) степень ацетилирования остатка С составила ~75%. Данная структура повторяющихся звеньев ОПС распространена среди азоспирилл серогруппы III, для которых продемонстрирована различная степень ацетилирования остатка Rha [13]. Наблюдаемое сходство строения О-антигенов различных видов бактерий может служить косвенным подтверждением широко распространенного горизонтального переноса генов.

Рис. 4.

Структура повторяющегося звена О-специфических полисахаридов типовых штаммов A. zeae N7, A. melinis TMCY 0552 и A. palustre B2.

Для установления родства генов, вовлеченных в биосинтез О-антигенов исследуемых штаммов, нами был проведен поиск генов биосинтеза L‑Rha, доступных в базе данных NCBI последовательностей полных геномов азоспирилл. В результате были выявлены участки геномов, условно обозначенные нами как генные кластеры или локусы, содержащие гены биосинтеза нуклеотид-активированных предшественников L-Rha, гликозилтрансферазы и гены ABC-транспортера, вовлеченные в процессинг О-антигена. Плазмидная локализация генов биосинтеза О-антигенов азоспирилл может свидетельствовать об их появлении в геноме в результате процесса горизонтального переноса, а также об их вовлечении в этот процесс, т.е. о переносе генов между штаммами внутри одного вида, разных видов, родов, семейств. Анализ ближайших гомологов белков биосинтеза О-антигенов продемонстрировал их присутствие в бактериях семейств Rhodospirillaceae, Rhodobacteraceae и Phyllobacteriaceae α-протеобактерий, а также порядка Nitrospirales (табл. 3). Следует отметить, что все эти бактерии – представители либо почвенной микрофлоры, либо морских экосистем.

Соответствующие локусы штаммов A. oryzae KACC 14407, A. lipoferum Sp59b и A. palustre B2, для двух из которых установлена идентичность повторяющихся звеньев гликанов поверхности (структура ОПС A. oryzae к настоящему моменту еще не установлена), демонстрировали значительное сходство организации между собой и существенно отличались от кластера штамма A. brasilense Sp7 (рис. 5). В пределах обнаруженных локусов штаммов A. oryzae KACC 14407, A. lipoferum Sp59b и A. palustre B2 анализируемые гены располагались последовательно на антисмысловой цепи ДНК. У штамма A. brasilense Sp7 гены биосинтеза L-Rha и процессинга ОПС (wzm и wzt) были существенно удалены друг от друга, между ними располагались гены нескольких предположительных гликозилтрансфераз и открытые рамки считывания с неустановленными функциями, при этом wzm и гены двух гликозилтрансфераз имели обратное направление считывания.

Рис. 5.

Схематичное расположение кластеров генов биосинтеза L-Rha. Заштрихованными стрелками обозначены гены синтеза L-Rha, серыми – аннотированные гликозилтрансферазы, темно-серыми – гены процессинга wzt и wzm, белыми – гены с неизвестными функциями.

Сравнительный анализ выявил высокую степень гомологии генов биосинтеза L-Rha rfbA–rfbD и процессинга wzm и wzt (93.5–96.6%) у штаммов A. oryzae KACC 14407, A. lipoferum Sp59b и A. palustre B2. По сравнению с ними, для типового штамма A. brasilense Sp7 степень гомологии функционально родственных генов биосинтеза L-Rha rmbA–rmbD и генов процессинга wzm и wzt составляла 69.7–77.8%.

Попарное выравнивание нуклеотидных последовательностей гликозилтрансфераз, входящих в генный кластер синтеза L-Rha, A. oryzae KACC 14407, A. lipoferum Sp59b и A. palustre B2, не показало значимого подобия с соответствующими генами A. brasilense Sp7, что связано с различным строением ОПС этих штаммов и, соответственно, различной специфичностью ферментов, участвующих в сборке О-звена. Поиск генов с максимальной степенью подобия для данных гликозилтрансфераз алгоритмом megaBLAST показал, что для A. oryzae KACC 14407 наибольшую степень гомологии имеет аналогично аннотированная последовательность A. thiophilum BV-S (CP012407.1) (идентичность 95.3%), в то время как для A. lipoferum Sp59b и A. palustre B2 наиболее близка по последовательности нуклеотидов гликозилтрансфераза Azospirillum sp. TSH100 (CP039640.1) (идентичность 96.3 и 96.2% соответственно).

Таким образом, на основании анализа структуры генных кластеров синтеза L-Rha у четырех штаммов азоспирилл можно сделать вывод об ортологичности соответствующих генов, причем штаммы A. oryzae KACC 14407, A. lipoferum Sp59b и A. palustre B2 обнаруживают незначительную вариабельность, в отличие от несколько более эволюционно отдаленного штамма A. brasilense Sp7, что может свидетельствовать о приобретении этих генов в процессе горизонтального переноса. Структура локуса A. oryzae KACC 14407 и его сходство с таковыми штаммов A. lipoferum Sp59b и A. palustre B2 позволяет предположить присутствие в составе ОПС A. oryzae идентичного полисахарида c тетрасахаридными звеньями, установленными в настоящей работе, однако для подтверждения данного предположения требуется проведение соответствующих иммунохимических тестов или анализа структуры ОПС химическими и физико-химическими методами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование бактерий. Штаммы A. melinis TMCY 0552 (IBPPM 547), A. zeae N7 (IBPPM 550) и A. palustre B2(T) (IBPPM 633) предоставлены Коллекцией ризосферных микроорганизмов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов, Россия). Культивирование бактерий проводили в жидкой малатно-солевой среде с витаминами [27] до окончания экспоненциальной фазы роста при температуре 30°С и перемешивании на вибростенде. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0.15 М растворе NaCl и смывали с поверхности капсульный материал механическим перемешиванием в течение 5 сут с ежедневной сменой отмывающего раствора.

Выделение ЛПС и ОПС. ЛПС выделяли из высушенных ацетоном бескапсульных клеток горячим 45%-ным водным раствором фенола без разделения слоев [28]. Примеси белков осаждали из раствора ЛПС добавлением 40%-ной CCl₃COOH до конечного значения рН 2.7. Растворы диализовали против дистиллированной воды, концентрировали на роторном испарителе Laborota 4000 (Heidolph, Германия) и лиофилизовали на лиофильной сушке Bench Top VirTis (США). Деградацию ЛПС проводили 2%-ной CН₃COOH при 100°С в течение 4 ч. Супернатант, содержащий ОПС, разделяли гель-хроматографией на колонке с Sephadex G-50 Fine (GE Healthcare, США) в 0.025 М пиридин-ацетатном буфере, контролируя элюцию с помощью дифференциального проточного рефрактометра (Knauer, Германия). Фракцию высокомолекулярного О-специфического полисахарида концентрировали и лиофилизировали.

Электрофорез препаратов ЛПС выполняли в 13.5%-ном SDS-ПААГ [29]. Визуализацию компонентов осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе азотнокислого серебра [30].

Динамическое рассеяние света растворами, приготовленными из лиофилизированных препаратов ЛПС в деионизованной воде (Milli-Q) в концентрации 2.0 мг/мл, измеряли с использованием установки Malvern Nano-ZS (Malvern, Великобритания) в пластиковых 4-сторонних кюветах (10 мм) (Sarstedt, Германия). Измерения проводили при 37°C и фиксированной фокусировке гелий-неонового лазера (λ = 633 нм в вакууме) в центре кюветы (4.65 мм) и постоянном диаметре диафрагмы (установленный аттенюатор: 7). Определяли интенсивность рассеяния света под углом 173° (выраженную в единицах скорости счета числа фотонов – kcps) и поправочную функцию флуктуаций интенсивности рассеяния во времени. По этим данным производили оценку наиболее вероятного модального гидродинамического диаметра (d_m) мицелл. Относительные значения числовой концентрации (N_отн) и массово-объемной концентрации диспергированных биополимерных веществ (C_отн) определяли по уравнению из работы Burygin et al. [23]. ζ-Потенциал мицелл ЛПС (2.0 мг/мл) измеряли при 37°C с помощью системы Malvern Nano-ZS (Malvern, Великобритания). Измерения проводили с настройками по умолчанию, рекомендованными производителем.

Иммунохимические исследования ЛПС проводили с использованием поликлональных антител кролика к ЛПБК A. lipoferum Sp59b методами двойной радиальной иммунодиффузии [31] и твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Преципитат в иммунодиффузии окрашивали кумасси голубым R‑250. Взаимодействие антигенов и антител в ИФА детектировали в полистироловых 96-луночных планшетах, используя козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, при добавлении перекиси водорода и о-фенилендиамина. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 нм на иммуноферментном анализаторе Tescan (Thermo Fisher Scientific, США).

Анализ моносахаридого состава и абсолютных конфигураций сахаров после гидролиза ОПС 2 M CF₃COOH (120°С, 2 ч) осуществляли методом ГЖХ ацетатов полиолов [32] и ацетилированных 2-(S)-октилгликозидов [33] на хроматографе Hewlett-Packard 7820А с капиллярной колонкой HP-5 (Hewlett-Packard, США). Градиент температуры от 160°C (1 мин) до 290°C, скорость нагрева 7°C/мин.

Состав жирных кислот. Состав жирных кислот ЛПС в виде метиловых эфиров жирных кислот определяли с помощью ГЖХ на хроматографе GС-2010 (Shimadzu, Япония), снабженном колонкой DB-5 (Agilent, США). Метилирование выполняли методом, описанным в работе Mayer et al. [34].

ЯМР-спектроскопия. Спектры ЯМР записывали на спектрометре DRX-600 (Bruker, Германия) в растворе 99.96%-ной D₂O при 30°С (внутренний стандарт – триметилсилилпропаноат-d₄, δ_C –1.6 и δ_H 0.0). Образцы предварительно лиофилизовали дважды из 99.9%-ной D₂O. Двумерные спектры записывали с использованием стандартного математического обеспечения компании Bruker (Германия); для сбора и обработки данных использовали программу TOPSPIN 2.1. В экспериментах TOCSY и NOESY время смешивания составляло 150 и 200 мс соответственно.

Анализ генов биосинтеза О-антигенов. Гены биосинтеза L-Rha были извлечены из полногеномных сиквенсов A. brasilense Sp7 (GenBank: AH013753.2), A. oryzae KACC 14407 (CP054615.1) и A. lipoferum Sp59b (VTTN01000010.1) и из доступных предварительных данных полногеномного сиквенса A. palustre B2 (GCF_002573965.1, сборка ASM257396v1). Предсказание функций идентифицированных последовательностей генов проводили путем выравнивания соответствующих и известных белковых последовательностей (полученных из GenBank), участвующих в биосинтезе O-антигенов других бактерий, с помощью инструмента BLASTn [35]. Трех- и четырехбуквенные обозначения генов A. brasilense Sp7 приведены в соответствии с аннотацией GenBank. Трехбуквенные (wzm и wzt) и четырехбуквенные обозначения (rfbA–rfbD) присвоены генам A. oryzae KACC 14407, A. lipoferum Sp59b и A. palustre B2 в соответствии с их аннотациями, а также результатами попарных выравниваний их нуклеотидных последовательностей. Изображение генных кластеров изучаемых штаммов азоспирилл было получено с помощью визуализатора Easyfig версии 2.2.5 [36]. Гомологию нуклеотидных последовательностей генов оценивали с помощью попарных выравниваний соответствующих последовательностей, выполненных с помощью программы BLASTn.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гликанам клеточной поверхности ризобактерий отводится важная роль на всех этапах существования популяции клеток, как при жизни в почве и ризосфере, так и при формировании симбиотических отношений с растениями. Липополисахариды – конструктивные компоненты клеточной стенки бактерий, которые могут экспортироваться в окружающую среду. Полисахариды, формируя внешний слой клеточной поверхности грамотрицательных бактерий, составляют основу для защиты клетки от неблагоприятного воздействия экстраклеточного окружения, а в случае симбиотических микроорганизмов они играют важную роль во взаимодействии с эукариотическими клетками организма-хозяина.

Прогресс в изучении структурных особенностей строения ЛПС (в том числе их ОПС) грамотрицательных бактерий во многом обусловлен их ролью в развитии патофизиологических процессов, сопровождающих бактериальные инфекции человека и животных. Эти молекулы вызывают иммунный ответ организма животных и человека и распознаются их антителами, что успешно применяется в клинике для идентификации и классификации патогенных бактерий. Коллекции О‑антиген-специфичных антисывороток используются для классификации грамотрицательных организмов в серологическом тестировании, что эффективно и для непатогенных микроорганизмов, к которым относятся и почвенные диазотрофы рода Azospirillum.

У E. coli нуклеотидные последовательности генных кластеров биосинтеза О-антигенов могут использоваться в качестве генетических маркеров для штаммовой идентификации этих бактерий [37]. Бактерии рода Azopirillum в этом отношении исследованы явно недостаточно. В настоящей работе представлены результаты анализа структур ОПС представителей трех ранее не изученных в этом отношении видов азоспирилл, а также выявления в их геномах генных кластеров, ответственных за биосинтез О-антигенов, с высоким уровнем идентичности. Использованный подход может быть весьма эффективным для дальнейшей молекулярной серодиагностики азоспирилл по генным кластерам их О-антигенов, учитывая тот факт, что для представителей этого рода весьма характерно явление молекулярной мимикрии [13]. При этом следует отметить, что идентичность структур О-антигенов не приводит к унификации свойств поверхности этих микроорганизмов, возможно, в силу многообразия экспонированных биомакромолекул либо в силу выявленных в ходе представленных исследований различий в мицеллообразовании амфифильных молекул ЛПС в водном растворе.