1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 48, № 5, 2022

Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 5, стр. 611-615

Синтез и оптические свойства конформационно зафиксированного диарилметенового аналога хромофора белка GFP

Н. С. Балеева 1, 2, *, А. Ю. Смирнов 1, 2, М. С. Баранов 1, 2

1 ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН
117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Россия

2 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова
117997 Москва, ул. Островитянова, 1, Россия

* E-mail: nsbaleeva@gmail.com

Поступила в редакцию 15.02.2022
После доработки 20.02.2022
Принята к публикации 23.02.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Синтезировано новое конформационно зафиксированное производное хромофора белка GFP – (Z)-5-((2-(дифторборил)-4-(диметиламино)фенил)(4-(диметиламино)фенил)метилен)-2-пропил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он. Установлено, что присутствие незафиксированного арильного заместителя в структуре приводит к снижению яркости флуоресценции и не влияет на положения максимумов поглощения и испускания. Перспективным направлением дальнейших исследований представляется замена этого заместителя на различные электронно-акцепторные группы, такие как нитрильная или CF3-группа, способные к более эффективному сопряжению с π-системой молекулы.

Ключевые слова: имидазолоны, хромофоры, флуоресценция

ВВЕДЕНИЕ

Исследования последних десятилетий показывают, что флуоресцентные метки имеют высокую практическую значимость для визуализации и изучения биологических процессов [1]. К синтетическим флуорофорам относятся разные бензилиден-имидазолоны – производные хромофора флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent Protein) [2]. Этот класс веществ представлен большим количеством соединений, имеющих разное химическое строение и, как следствие, характеризующихся разными свойствами. В литературе описан ряд хорошо проработанных методов химического синтеза этих соединений [3].

Важные свойства флуорофоров – способность поглощать и испускать свет в дальнекрасной области спектра и высокий квантовый выход флуоресценции. Хорошо известно, что хромофор GFP и прочие бензилиден-имидазолоны слабо флуоресцируют из-за подвижности бензилиденового фрагмента молекулы [4]. Однако было показано, что этот фрагмент можно жестко зафиксировать, например, с помощью дифторборильного мостика (например, соединение (Ia) на рис. 1) или других методов фиксации. Такие модификации позволили многократно увеличить квантовый выход флуоресценции [5–7]. “Красные” бензилиден-имидазолоны можно получить путем увеличения сопряженной π-системы (введение стирольных или арилацетиленовых заместителей) [8–11] или расширением ароматической системы за счет аннелирования бензилиденового фрагмента [12–14].

Рис. 1.

Ранее синтезированные дифторборильные производные (I), (II) и их оптические свойства в ацетонитриле.

Ранее нами была синтезирована пара аннелированных производных (рис. 1, соединения (Ib) и (Ic)) [12, 15]. Было установлено, что увеличение ароматической системы привело к батохромному сдвигу максимумов абсорбции на 54–65 нм и эмиссии на 50–77 нм относительно немодифицированного производного (Ia). Однако также оказалось, что флуоресценция сохраняется лишь для соединения (Ic), в то время как квантовый выход флуоресценции производного (Ib) не превышает 0.2% (рис. 1). Мы установили, что данное поведение вызвано наличием ковалентной связи между двумя фенильными заместителями в производном (Ib), благодаря которой происходит возникновение дополнительной свободной молекулярной орбитали, флуоресценция из которой невозможна. Вероятно, что удаление этой связи может решить данную проблему и привести к усилению флуоресценции.

Цель настоящей работы – синтез соответствующего диарилметилен-имидазолона, в котором арильные заместители не связаны между собой ковалентной связью, и изучение оптических свойств этого соединения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве модельного нами было выбрано соединение (II) (рис. 1) [16]. Это соединение и его ближайшие аналоги выступают субстратами для флуороген-активирующих белков на основе липокалина и могут применяться в генетически кодируемом мечении [17, 18].

Бензилиден-имидазолон (V) был синтезирован с помощью реакции конденсации кетона (III) и насыщенного имидазолона (IV) в пиридине (схема 1 ). Конформационно зафиксированное производное (VI) было получено при воздействии трибромида бора на бензилиден-имидазолон (V) в дихлорэтане в присутствии молекулярных сит (схема 1 ).

Таблица 1.

Оптические свойства соединений (VI) и (II) в разных растворителях

Растворитель Соединение Максимум поглощения, нм Максимум эмиссии, нм
Этанол (VI) 449 528
(II) 496 555
Ацетонитрил (VI) 478 558
(II) 485 552
Этилацетат (VI) 477 541
(II) 484 538
Диоксан (VI) 484 540
(II) 489 532

Примечание: данные для соединения (II) взяты из статьи Baranov et al. [16].

Схема 1 . Схема синтеза соединений (V) и (VI).

Рис. 2.

(а) – Нормализованные спектры абсорбции и эмиссии соединения (VI) в разных растворителях; (б) – нормализованные спектры абсорбции и эмиссии соединений (VI) и (II) в ацетонитриле.

Изучение оптических свойств показало, что новое производное (VI), как и модельное соединение (II), поглощает свет в области 450–480 нм и флуоресцирует в области 530–555 нм (рис. 2, табл. 1). Вероятно, что отсутствие существенной разницы вызвано неполным сопряжением второго арильного заместителя с π-системой молекулы.

Подвижность второго арильного заместителя в структуре соединения (VI) оказала также негативное влияние и на интенсивность флуоресценции. Было установлено, что квантовый выход флуоресценции этого вещества в ацетонитриле не превышает 0.5%, в то время как квантовый выход соединения (II) составляет 48% (рис. 1).

Полученные результаты говорят о том, что перспективным направлением для дальнейших исследований может быть введение иных групп, более способных к эффективному сопряжению с π-системой молекулы, например, введение не второго арильного заместителя, как в случае соединения (VI), а различных электронно-акцепторных групп, таких как нитрильная или CF3-группа.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Оборудование. Спектры ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) регистрировали на спектрометре Avance III NMR (700 МГц; Bruker, США) при 303 K в DMSO-d6 (внутренний стандарт – Me4Si), спектры поглощения – на спектрофотометре Cary 100 Bio (Varian, США), спектры флуоресценции – на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, США). Температуры плавления определяли на приборе SMP 30 (Stuart Scientific, Великобритания) и не исправляли. Масс-спектры высокого разрешения регистрировали на приборе micrOTOF II (Bruker, Германия), ионизация электрораспылением.

Синтез 5-(бис(4-(диметиламино)фенил)метилен)-2-пропил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-она (V). В колбу Шленка помещали 4,4'-бис(диметиламино)бензофенон (2.5 г, 9 ммоль), 2-пропил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (2.3 г, 18 ммоль) и молекулярные сита (1.2 г, 3 Å). Колбу вакуумировали, заполняли аргоном и добавляли 10 мл пиридина. Полученную смесь перемешивали при 120°С в течение 50 ч. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали. Полученный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (элюент – хлороформ и этанол, 50 : 1).

Оранжевый порошок (409 мг, 15%); т. пл. 206–209°C. 1H-ЯМР: 10.85 (с, 1H), 7.31 (д, J2 9.0, 2H), 7.03 (д, J2 8.8, 2H), 6.68 – 6.63 (м, 4H), 2.97 (с, 6H), 2.96 (с, 6H), 2.37 (т, J2 7.5, 2H), 1.64 (секст, J2 7.4, 2H), 0.94 (т, J2 7.4, 3H). 13C-ЯМР: 169.8, 159.3, 150.5, 150.4, 145.1, 134.0, 133.5, 132.4, 127.2, 125.2, 110.8, 110.6, 39.8, 39.7, 31.2, 19.2, 13.6. HRMS (ESI), m/z: найдено М 391.2466; рассчитано для C24H31N4O+, [M + H]+ 391.2492.

Синтез (Z)-5-((2-(дифторборил)-4-(диметиламино)фенил)(4-(диметиламино)фенил)метилен)-2-пропил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-она (VI). Продукт первой стадии (V) (0.2 г, 0.5 ммоль) смешивали с молекулярными ситами (2 г, 3 Å и 2 г, 4 Å) и трибромидом бора (5 ммоль) в 50 мл дихлорэтана. Полученную смесь кипятили в атмосфере аргона в течение 6 ч. Затем смесь охлаждали и отфильтровывали. Молекулярные сита промывали холодным этанолом (2 × 10 мл) и хлороформом (50 мл). К полученному раствору добавляли раствор HF (40%, 5 мл) и перемешивали 30 мин. Смесь разбавляли EtOAc (100 мл), промывали насыщенным раствором K2CO3 (2 × 50 мл), водой (2 × 50 мл) и насыщенным раствором NaCl (2 × 50 мл). Органические вытяжки высушивали над безводным Na2SO4 и упаривали. Полученный продукт очищали методом флеш-хроматографии (элюент – хлороформ и этанол, 20 : 1).

Красный порошок (22 мг, 10%); т. пл. ~250°C с разложением. 1H-ЯМР: 12.58 (с, 1H), 7.09 (д, J2 8.6, 2H), 6.94–6.90 (м, 2H), 6.78 (д, J2 8.6, 2H), 6.59 (дд, J2 9.1, 2.9, 1H), 3.03 (с, 6H), 3.00–2.93 (м, 8H), 1.78 (секст, J2 7.5, 2H), 0.98 (т, J2 7.3, 3H). 13C-ЯМР: 163.0, 162.7, 151.7, 150.2, 145.6, 132.2, 130.3, 123.7, 120.6, 119.0, 113.7, 111.3, 110.8, 110.8, 39.9, 39.8, 28.5, 19.9, 13.5. HRMS (ESI), m/z: найдено М 439.2480; рассчитано для C24H30BF2N4O+, [M + H]+ 439.2475.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе синтезировано новое производное хромофора белка GFP – (Z)-5-((2-(дифторборил)-4-(диметиламино)фенил)(4-(диметиламино)фенил)метилен)-3-метил-2-пропил-3,5-дигидро-4H-имидзол-4-он. Изучены оптические свойства этого соединения и установлено, что отсутствие жесткой фиксации второго арильного заместителя и вызванное этим неполное сопряжение с π-системой молекулы приводит к резкому снижению интенсивности флуоресценции нового соединения. Вероятно, что эффективной модификацией, направленной на увеличение квантового выхода флуоресценции подобных соединений, будет замена незафиксированного арильного заместителя на различные электронно-акцепторные группы, такие как нитрильная или CF3-группа, способные к более эффективному сопряжению с π-системой молекулы.

Список литературы

  1. Sahoo H. // RSC Adv. 2012. V. 2. P. 7017–7029. https://doi.org/10.1039/C2RA20389H

  2. Walker C.L., Lukyanov K.A., Yampolsky I.V., Mishin A.S., Bommarius A.S., Duraj-Thatte A.M., Azizi B., Tolbert L.M., Solntsev K.M. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2015. V. 27. P. 64–74. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2015.06.002

  3. Baleeva N.S., Baranov M.S. // Chem. Heterocycl. Compd. 2016. V. 52. P. 444–446. https://doi.org/10.1007/s10593-016-1909-4

  4. Svendsen A., Kiefer H.V., Pedersen H.B., Bochenkova A.V., Andersen L.H. // J. Am. Chem. Soc. 2017. V. 139. P. 8766–8771. https://doi.org/10.1021/jacs.7b04987

  5. Baranov M.S., Lukyanov K.A., Borissova A.O., Shamir J., Kosenkov D., Slipchenko L.V., Tolbert L.M., Yampolsky I.V., Solntsev K.M. // J. Am. Chem. Soc. 2012. V. 134. P. 6025–6032. https://doi.org/10.1021/ja3010144

  6. Zaitseva SO., Farkhutdinova D.A., Baleeva N.S., Smirnov A.Y., Zagudaylova M.B., Shakhov A.M., Astafiev A.A., Baranov M.S., Bochenkova A.V. // RSC Adv. 2019. V. 9. P. 38730–38734. https://doi.org/10.1039/c9ra08808c

  7. Baldridge A., Solntsev K.M., Song C., Tanioka N., Kowalik J., Hardcastle K., Tolbert L.M. // Chem. Commun. 2010. V. 46. P. 5686–5688. https://doi.org/10.1039/B927313A

  8. Shen B., Qian Yi. // Dyes Pigm. 2019. V. 166. P. 350–356. https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2019.03.034

  9. Baleeva N.S., Myannik K.A., Yampolsky I.V., Baranov M.S. // Eur. J. Org. Chem. 2015. V. 26. P. 5716–5721. https://doi.org/10.1002/ejoc.201500721

  10. Feng G., Luo C., Yi H., Yuan L., Lin B., Luo X., Hu X., Wang H., Lei C., Nie Z., Yao S. // Nucl. Acids Res. 2017. V. 45 P. 10380–10392. https://doi.org/10.1093/nar/gkx803

  11. Балеева Н.С., Баранов М.С. // Биоорг. химия. 2017. Т. 43. С. 581–584. [Baleeva N.S., Baranov M.S. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2017. V. 43. P. 612–615.] https://doi.org/10.1134/S106816201705003X

  12. Baleeva N.S., Khavroshechkina A.V., Zaitseva E.R., Myasnyanko I.N., Zagudaylova M.B., Baranov M.S. // Tetrahedron Lett. 2019. V. 60. P. 150963. https://doi.org/10.1016/j.tetlet.2019.150963

  13. Huang G., Zhang G., Wu Y., Liao Q., Fu H., Zhang D. // Asian J. Org. Chem. 2012. V. 1. P. 352–358. https://doi.org/10.1002/ajoc.201200086

  14. Muselli M., Baudequin C., Perrio C., Hoarau C., Bischoff L. // Chem. Eur. J. 2016. V. 22. P. 5520–5524. https://doi.org/10.1002/chem.201600602

  15. Sinenko G.D., Farkhutdinova D.A., Myasnyanko I.N., Baleeva N.S., Baranov M.S., Bochenkova A.V. // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. P. 13645. https://doi.org/10.3390/ijms222413645

  16. Baranov M.S., Solntsev K.M., Baleeva N.S., Mishin A.S., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A., Yampolsky I.V. // Chem. Eur. J. 2014. V. 20. P. 13234–13241. https://doi.org/10.1002/chem.201403678

  17. Bozhanova N.G., Baranov M.S., Baleeva N.S., Gavrikov A.S., Mishin A.S. // Int. J. Mol. Sci. 2018. V. 19. P. 3778. https://doi.org/10.3390/ijms19123778

  18. Muslinkina L., Gavrikov A.S., Bozhanova N.G., Mishin A.S., Baranov M.S., Meiler J., Pletneva N.V., Pletnev V.Z., Pletnev S. // ACS Chem. Biol. 2020. V. 15. P. 2456–2465. https://doi.org/10.1021/acschembio.0c00440

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал