Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 5, стр. 561-568

ВВЕДЕНИЕ

Создание лекарственных средств на основе биоактивных пептидов значительно ускорилось в последние годы благодаря исследованиям генома, расширившим выбор клеточных мишеней, и успехам комбинаторной химии и твердофазного синтеза пептидов с помощью Fmoc-методологии. В частности, большое внимание уделяется использованию галанина и лигандов его рецепторов для разработки препаратов, корректирующих нарушения метаболизма при ожирении, диабете и нейродегенеративных заболеваниях мозга [1]. Нейропептид галанин, состоящий из 29 а.о. у большинства видов животных и 30 а.о. у человека, широко распространен в центральной и периферической нервной системе, а также в других тканях и органах. В периферических органах, включая сердце, галанин действует не только через нейрональные механизмы, но и активируя трансмембранные рецепторы GalR1–3. За связывание с рецепторами отвечает N-концевой фрагмент пептида, первые 15 а.о. которого консервативно сохраняются у большинства видов млекопитающих. С-концевой фрагмент (17–29) варьирует у животных и человека и имеет слабую аффинность по отношению к рецепторам [2].

Влияние рецепторов галанина на регуляцию метаболизма и функции сердца при экспериментальной патологии изучено недостаточно полно. Однако исследования последних лет показали, что экзогенные N-концевые фрагменты галанина (2–11) и (2–15), обладающие высоким сродством к рецептору GalR2, оказывают защитное действие на кардиомиоциты при ишемическом и реперфузионном (И/Р) повреждении. Это защитное действие приводит к снижению образования супероксидных радикалов в митохондриях и запуску сигнальных каскадов, уменьшающих гибель клеток от апоптоза и некроза и улучшающих энергетическое состояние миокарда (возможные механизмы обсуждены в работах Timotin et al. [3] и Pisarenko et al. [4]). Впоследствии был синтезирован ряд оригинальных модифицированных аналогов фрагментов галанина (2–11) и (2–15) с сохранением фармакофорных остатков, ответственных за связывание с рецептором GalR2. Изучение этих пептидов на моделях И/Р повреждения сердца и доксорубицин-индуцируемой кардиомиопатии продемонстрировало их способность снижать гибель клеток, улучшать метаболическое и антиоксидантное состояние миокарда и уменьшать повреждения мембран кардиомиоцитов [5–7].

Наиболее эффективным оказалось соединение, представляющее собой химерный агонист G – последовательность галанина (2–13), дополненная природным дипептидом карнозином (βAla-His), H‑Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-βAla-His-OH [6]. Существенно, что действие полноразмерного галанина, связывающегося со всеми тремя подтипами рецепторов GalR1–3, эффективно воспроизводилось модифицированным N-концевым фрагментом галанина G или его природным аналогом (2–15), обладающими высокой аффинностью к рецептору GalR2 [7]. Эти данные предполагают участие рецептора GalR2 в кардиопротекторном действии этих лигандов. В то же время рецептор-зависимые механизмы действия N-концевых фрагментов галанина при экспериментальной патологии сердца остаются невыясненными.

Цель данной работы состояла в выяснении роли активации рецепторов GalR2 в уменьшении повреждения сердца, происходящего под действием пептида G, при ишемии и реперфузии in vivo. Для этого мы использовали новый химерный пептидный антагонист рецепторов галанина GalR2 М871.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез пептидов G и М871. Пептиды G и M871 получали автоматическим твердофазным синтезом с применением Fmoc-методологии. Синтез пептида G (H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-βAla-His-OH) был описан нами ранее [5, 6]. При получении пептида М871 (H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Glu-His-Pro-Pro-Pro-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-NH₂) [8] в сочетании с N^α-Fmoc-защитной группой для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот были использованы кислотолабильные защитные группы: Boc – для индольного кольца Trp, Bu^t – для гидроксильных функций Thr, Ser, Tyr и γ-карбоксильной функции Glu, Trt – для карбоксамидной функции Asn и имидазольного кольца His. Для создания амидных связей применяли метод с использованием урониевых солей (TBTU/NMM). По окончании синтеза пептид удаляли с полимерного носителя с одновременным деблокированием функциональных групп аминокислот действием TFA со скэвенджерами. После очистки методом ВЭЖХ пептид М871 имел корректную молекулярную массу (рис. 1). Характеристики пептидов G и M871 представлены в табл. 1.

Рис. 1.

Химическая структура, аналитическая ВЭЖХ и масс-спектр MALDI-TOF пептида М871.

Влияние пептидов G и М871 на размеры инфаркта миокарда и повреждение мембран кардиомиоцитов. Влияние блокады рецепторов GalR2 с помощью высокоаффинного антагониста M871 на кардиопротекторное действие химерного агониста рецепторов галанина G было изучено на модели региональной ишемии и реперфузии сердца крысы in vivo. Данная модель была использована нами ранее для оценки действия полноразмерного галанина и его N-концевых фрагментов [3, 4, 6].

Антагонист М871 связывается с рецепторами галанина GalR2 с более чем 30-кратной селективностью по сравнению с GalR1, оказывая мощное антагонистическое действие на рецептор GalR2. В дополнение пептид такой последовательности блокирует агонистические свойства галанина в экспериментах in vitro на клеточной линии, полученной из яичников китайского хомячка (CHO). Аффинность M871 в отношении подтипа рецепторов GalR3 не изучена. Однако известно, что GalR3 в основном экспрессируется в периферической нервной системе, а GalR2 – в центральных и периферических органах и тканях [9, 10]. Такие различия в распределении рецепторов обосновывают возможность использования пептида M871 в исследованиях на сердце.

В исходном состоянии среднее систолическое артериальное давление (СAД) было практически одинаковым во всех экспериментальных группах (см. “Эксп. часть”) и составляло 85 ± 2 мм рт. ст., частота сердечных сокращений (ЧСС) – 330 ± 5 мин^–1. Внутривенное введение физиологического раствора в контроле или растворителя (0.5%-ного DMSO в физиологическом растворе, который применяли для растворения антагониста M871) в период региональной ишемии не приводило к изменению СAД и ЧСС при реперфузии. Введение пептида G в дозе 1.0 мг/кг веса вызывало незначительное снижение САД и ЧСС на первых минутах реперфузии, которое сменялось практически полным восстановлением этих параметров к окончанию реперфузии. Введение антагониста M871 в дозе 3, 6 или 8 мг/кг за 5 мин до окончания реперфузии не оказывало достоверного влияния на СAД и ЧСС в ходе эксперимента.

Гистохимический анализ срезов левого желудочка (ЛЖ) после реперфузии не выявил достоверных различий в размерах зоны риска (ЗР/ЛЖ) между контрольной группой, группой растворителя (0.5%-ный DMSO) и группами пептида М871, использовавшегося в дозе 3, 6 и 8 мг/кг (табл. 2). Это означает, что И/Р повреждение было смоделировано одинаково у животных всех групп. В контроле величина инфаркта миокарда (ИМ), выраженная отношением ИМ/ЗР, составила (45.8 ± 2.0)%. Внутривенное введение 0.5%-ного DMSO после периода региональной ишемии не оказывало достоверного влияния на этот показатель. В соответствии с ранее полученными результатами [6], размер ИМ достоверно снижался на 38% (по сравнению с контрольной группой, р < 0.001) под действием агониста рецептора GalR2 – пептида G. Введение изученных доз антагониста M871 (3, 6 и 8 мг/кг) за 5 мин до начала реперфузии не влияло на ИМ по сравнению c контрольной группой.

Развитие ИМ в контрольной группе сопровождалось увеличением активности маркера некроза креатинкиназы МВ (КК-МВ) в плазме крови в конце реперфузии на порядок по сравнению с исходным состоянием (табл. 2). Введение 0.5%-ного DMSO не влияло на активность КК-МВ по сравнению c контролем. Под действием пептида G активность КК-МВ к окончанию реперфузии снижалась на 40% по сравнению с контролем (р = = 0.019). При введении антагониста M871 в дозе 3, 6 или 8 мг/кг этот показатель не отличался от значения в контроле и был достоверно выше, чем после введения пептида G. Полученные данные показывают, что блокада рецепторов GalR2 возрастающими дозами антагониста М871 перед началом реперфузии не увеличивала некротическое повреждение реперфузированного сердца. Это подтверждается величинами ИМ и активности маркера некроза КК-МВ, достоверно не отличающимися от этих показателей у животных контрольной группы.

На следующем этапе было изучено влияние совместного действия антагониста М871 и агониста G на показатели повреждения реперфузированного сердца. В этих опытах блокаду рецепторов GalR2 различными дозами антагониста M871 осуществляли за 5 мин до окончания окклюзии левой коронарной нисходящей артерии перед введением оптимальной дозы агониста G (1 мг/кг) в начале реперфузии. Результаты этих экспериментов суммированы на рис. 2. Предварительное введение возрастающих доз антагониста М871 перед введением агониста G приводило к постепенному увеличению размеров ИМ (рис. 2а). Начиная с дозы антагониста М871 6 мг/кг, различия в ИМ/ЗР между группами совместного введения пептидов (М871-6 + G и М871-8 + G) и группой введения агониста G становились достоверными (р < 0.001), а величина ИМ у животных этих групп не отличалась от контрольной группы. Увеличение ИМ при совместном введении пептидов M871 и G сопровождалось возрастанием активности КК-МВ в плазме крови крыс (рис. 2б). В группах животных, которые получали оба пептида М871-6 + G и М871-8 + G, активность КК-МВ в плазме достоверно не отличалась от значения этого показателя в контрольной группе, а в группе, подвергнутой воздействию пептидов М871-8 + G, была достоверно выше (р = 0.007), чем в группе агониста G.

Рис. 2.

Влияние блокады рецепторов GalR2 антагонистом М871 на снижение повреждения сердца при ишемии и реперфузии, вызванное введением фармакологического агониста рецепторов галанина G. (а) – Дозозависимое влияние антагониста M871 на изменение размеров инфаркта миокарда (ИМ/ЗР, %), вызванное введением агониста G в начале реперфузии. 0 – введение пептида G в дозе 1 мг/кг без предварительного введения пептида M871; 3, 6 и 8 – введение антагониста M871 в дозе 3, 6 или 8 мг/кг с последующим введением пептида G (1 мг/кг). Данные представлены как M ± m для серий из пяти опытов. Отмечены достоверные отличия (р < 0.05) по сравнению с контролем (*) и пептидом G (^#). Черным цветом показан размер инфаркта миокарда в контроле; (б) – дозозависимое влияние антагониста M871 на изменение активности КК-МВ в плазме крови крыс в конце реперфузии, вызванное введением агониста G. G – введение агониста G в дозе 1 мг/кг без предварительного введения M871; М871-3 (М871-6, М871-8) + G – введение антагониста M871 в дозе 3, 6 или 8 мг/кг с последующим введением пептида G (1 мг/кг); К – контроль. Данные представлены как M ± m для серий из пяти опытов. Отмечены достоверные отличия (р < 0.05) по сравнению с контролем (*) и пептидом G (^#).

Приведенные результаты показывают, что использованные дозы пептида М871 не оказывали дополнительного повреждающего действия на сердце при реперфузии. Однако введение пептида М871 перед использованием фармакологического агониста G заметно снижало или полностью отменяло, как в случае высоких доз 6 и 8 мг/кг, кардиопротекторное действие последнего. Это свидетельствует об участии рецепторов GalR2 в механизмах защитного действия химерного лиганда G на ишемизированный миокард.

Роль активации рецепторов GalR2 в кардиопротекторном действии пептида G. Для изучения механизмов действия фармакологического агониста рецепторов галанина пептида G на сердце крыс in vivo был впервые использован химерный пептидный антагонист рецепторов GalR2 М871. Дозозависимое влияние антагониста М871 при использовании оптимальной дозы агониста G оценивали по изменениям размеров ИМ и активности маркера некроза МВ-КК в плазме крови крыс при региональной ишемии миокарда и реперфузии. Ранее на этой модели была показана возможность эффективного снижения некротического повреждения миокардиальной ткани и улучшения метаболизма реперфузированного сердца под действием природных и модифицированных N-концевых фрагментов галанина, обладающих высокой аффинностью к рецепторам GalR2, при их внутривенном введении в начальной стадии реперфузии [6]. Однако действие этих агонистов не было изучено в условиях предварительной блокады рецепторов GalR2. Результаты данной работы показывают, что фармакологическое посткондиционирование пептидом G обладает выраженным GalR2-зависимым терапевтическим потенциалом, способным уменьшать размеры пораженного участка миокарда при остром ИМ.

Активация пептидами галанина различных путей передачи сигнала при связывании с рецептором GalR2 обсуждена нами в работе Писаренко с соавт. [11]. Сопряжение GalR2 c G-белками различных типов (Gi/o, Gq/11 и G12/13) [12] стимулирует захват и окисление глюкозы кардиомиоцитами [13, 14], ингибирует проапоптозные белки BAD/BAX и снижает активности каспазы-3 и каспазы-9 [1, 15], блокирует открытие митохондриальных пор временной проницаемости (mPTP) и, таким образом, способствует выживанию и подвижности клеток [16]. Наряду с этим пептидные агонисты галанина способны усиливать механизмы антиоксидантной защиты при И/Р повреждении сердца. На это указывают снижение продукции АФК, уменьшение образования продуктов перекисного окисления липидов и увеличение активности супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в реперфузированном миокарде [7]. Эти эффекты могут быть вызваны как усилением экспрессии генов, кодирующих антиоксидантные ферменты [17], так и прямым перехватом АФК и ингибированием перекисного окисления липидов [18]. Результат посткондиционирования сердца пептидом G – повышение эффективности метаболических путей образования АТP, поддержка ионного гомеостаза и улучшение антиоксидантного состояния кардиомиоцитов при реперфузии. Важно, что действие полноразмерного галанина, связывающегося со всеми подтипами рецепторов GalR1–3, воспроизводится его N-концевыми фрагментами, обладающими аффинностью к рецептору GalR2. Это относится как к природным фрагментам (2–11) и (2–15), так и к их модифицированным аналогам, среди которых высокую эффективность на всех использованных моделях обнаруживал синтетический химерный агонист G. Эти данные указывают на принципиальную роль активации рецепторов GalR2 в кардиопротекторном действии пептидных агонистов рецепторов галанина, которая была подтверждена при совместном использовании антагониста М871 и фармакологического лиганда G.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез пептидов G и M871. В работе использованы производные L-аминокислот (Novabiochem, Германия); TBTU, TIS, NMM (Fluka, Швейцария). Для синтеза применяли DMF, дихлорметан и TFA (Panreac, Испания). Препаративную ВЭЖХ проводили на хроматографе WellChrom (Knauer, Германия), аналитическую ВЭЖХ – на приборе Smartline (Knauer, Германия). Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил (Panreac, Испания). Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонке Kromasil 100-5 C18 (4.6 × 250 мм), размер частиц сорбента 5 мкм; элюенты: буфер А – 0.05 М КН₂РО₄ (pH 3.0), буфер Б – 70%-ный ацетонитрил в буфере А, элюция со скоростью 1 мл/мин градиентом концентрации буфера Б в буфере А от 20 до 80% за 30 мин, детекция при 220 нм. Препаративную ВЭЖХ проводили на колонке Eurosphere 100-10 C18 (20 × 250 мм), размер частиц сорбента 10 мкм. На первом этапе очистки пептида М871 в качестве элюентов использовали буфер А (0.05 М КН₂РО₄, pH 3.0) и буфер Б (70%-ный ацетонитрил). Элюцию проводили от 90% буфера А градиентом буфера Б (0.5%/мин) со скоростью 10 мл/мин. После этого фракции, содержащие целевой продукт, собирали, ацетонитрил упаривали, остаток обессоливали на той же колонке с использованием в качестве буфера А 0.01%-ной TFA в тех же условиях. Детекцию пептидов осуществляли при 220 нм.

Синтез пептида G (H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-βAla-His-OH) описан ранее [5, 6].

Автоматический твердофазный синтез пептида М871 (H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Glu-His-Pro-Pro-Pro-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-NH₂) проводили на синтезаторе Tribute-UV (Protein Technologies, Inc., США) в масштабе 0.125 ммоль в соответствии с программой однократной конденсации Fmoc-аминокислот, включавшей функцию спектрофотометрического контроля полноты отщепления Fmoc-защитных групп. Пептидную цепь наращивали с С-конца по одной аминокислоте на полимере Ринка, представляющем собой сополимер стирола с 1% дивинилбензола с 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)-феноксиметильной якорной группой (Novabiochem, Германия) с содержанием аминогрупп 0.33 ммоль/г. Цикл твердофазного синтеза включал следующие стадии: 1) деблокирование α‑аминогрупп 25%-ным 4-МеPip/DMF (2 × 2 мин); 2) 4 промывки DMF; 3) конденсация 0.4 М раствора 4-кратного избытка ацилирующего агента (0.5 ммоль Fmoc-аминокислоты + 0.5 ммоль TBTU + 1.0 ммоль NMM) в DMF в течение 1 ч; 4) 4 промывки DMF. Пептид отщепляли от полимерного носителя действием смеси TFA–вода–триизопропилсилан–дитиотреитол (85 : 5 : 5 : 5) в течение 1.5 ч. Полимер отфильтровывали, промывали на фильтре деблокирующей смесью, фильтрат упаривали, продукт осаждали сухим диэтиловым эфиром. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром, DCM, эфиром и высушивали. Получено 95 мг (33.2%) пептида М871, характеристики приведены в табл. 1.

Влияние пептидов M871 и G на размеры инфаркта миокарда и повреждение мембран кардиомиоцитов. Опыты проведены на самцах крыс Wistar (300–350 г, возраст 10 недель). Животные получены из филиала “Столбовая” ФГБУН “Научный центр биомедицинских технологий” ФМБА России. В каждой экспериментальной группе было по пять животных.

Препарирование наркотизированных 20%-ным уретаном (1.2 г/кг веса, внутрибрюшинно) животных в условиях торакотомии осуществляли при искусственной вентиляции легких комнатным воздухом, как указано в работе Palkeeva et al. [6]. Регистрацию среднего артериального давления (САД) и частоты сокращений сердца (ЧСС) осуществляли на полиграфе Biograph-4 (Cанкт-Петербургский государственный университет аэрокосмического приборостроения, Россия). Запись данных на компьютер в режиме оnline проводили с помощью аналого-цифрового преобразователя USB 6210 (National Instruments, США) и программы в системе LabVIEW 7 (National Instruments, США). После 30-мин стабилизации гемодинамических показателей (исходное состояние) выполняли 40-мин окклюзию левой коронарной нисходящей артерии, продолжительность последующей реперфузии составляла 60 мин. Для определения активности маркера некроза креатинкиназы-МВ (КК-МВ) проводили отбор крови в гепаринизированные пробирки из венозного катетера в исходном состоянии и после 60-мин реперфузии. Проведены следующие серии опытов: Контроль – указанный выше протокол с внутривенным введением 0.5 мл физиологического раствора одновременно с началом реперфузии; G – тот же протокол с внутривенным введением оптимальной дозы химерного агониста пептида G (1.0 мг/кг болюсом [6]) в начале реперфузии; M871 – внутривенное введение антагониста GalR2 M871 болюсом в дозах 3, 6 или 8 мг/кг за 5 мин до начала реперфузии; M871 + G2 – внутривенное введение пептида M871 в дозах 3, 6 или 8 мг/кг за 5 мин до начала реперфузии c последующим внутривенным введением пептида G (1.0 мг/кг) одновременно с началом реперфузии; DMSO – внутривенное введение растворителя M871 (0.5%-ного раствора DMSO в физиологическом растворе) за 5 мин до начала реперфузии. Пептиды растворяли в DMSO, а затем до необходимой концентрации в физиологическом растворе непосредственно перед введением.

В конце опыта для гистохимической оценки размеров зоны риска (ЗР) и интактной области сердца использовали 2%-ный раствор Эванса и инкубацию срезов левого желудочка (ЛЖ) сердца в 1%-ном растворе 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида в 0.1 М калий фосфатном буфере (рН 7.4 при 37°С), как указано в работе Palkeeva et al. [6]. Площади инфаркта миокарда (ИМ) и ЗР в окрашенных срезах ЛЖ определяли методом компьютерной планиметрии, используя программу ImageJ (NIH, США). В каждой группе рассчитывали отношения зона риска/вес левого желудочка (ЗР/ЛЖ) и инфаркт миокарда/зона риска (ИМ/ЗР), в процентах. Активность КК-МВ в плазме крови определяли на спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu, Япония) при λ = 340 нм, используя наборы фирмы BioSystems (Испания).

Статистический анализ данных. Использован пакет программ SigmaPlot 11.2 (SysStat, США). Значения представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения (M ± m). При сравнении нескольких групп с контролем использовали t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми отличия считали при р < 0.05.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние десятилетия усилия многих лабораторий сосредоточены на исследовании молекулярных механизмов регуляции функций жизненно важных органов человека с помощью природных и синтетических пептидов. Результаты настоящей работы расширяют представление о галанинергической системе как перспективной мишени для фармакологического воздействия при функциональных и метаболических нарушениях сердца. Нами впервые использован высокоселективный антагонист рецептора галанина GalR2 M871 для изучения действия фармакологического пептидного агониста G – модифицированного N-концевого фрагмента галанина (2–15) – при региональной ишемии и реперфузии сердца крыс in vivo. С его помощью показано, что блокада рецепторов GalR2 перед возобновлением коронарного кровотока отменяет полезные эффекты агониста G, увеличивая величину ИМ и повреждение мембран кардиомиоцитов в реперфузированном сердце. Эти данные указывают на физиологическое значение активации рецептора GalR2 в защите сердца от И/Р стресса и демонстрируют перспективность молекулярного конструирования агонистов рецептора GalR2 для разработки лекарственных пептидных препаратов для терапии сердечно-сосудистых заболеваний.