Биоорганическая химия, 2023, T. 49, № 2, стр. 207-215

ВВЕДЕНИЕ

Глаукома – одна из наиболее тяжелых форм офтальмопатологии, характеризующаяся постоянным или периодическим повышением внутриглазного давления (ВГД), без должного лечения приводящая к слепоте и слабовидению. На данный момент ВГД – единственный контролируемый фактор прогрессирования глаукомы. В связи с этим актуальным остается поиск соединений, которые способны понижать внутриглазное давление, препятствуя развитию нейропатии зрительного нерва и сопряженных с этим явлением состояний [1]. В последнее время в литературе обсуждается появление новых мишеней для офтальмогипотензивных соединений, одна из которых – Na⁺/H⁺-обменник-1 (NHE-1) [2, 3].

NHE-1 контролирует внутриклеточный рН и активность гликолитических ферментов – гексокиназы, фосфофруктокиназы и пируваткиназы, а его экспрессия и активность повышаются, например, при сахарном диабете. NHE-1-зависимая регуляция гликолиза, в условиях ингибирования (хрусталик) или недостаточной активации (сетчатка) глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, лежит в основе отвода избыточного гликолитического потока в сторону нескольких путей, способствующих окислительному стрессу, причинному фактору диабетического катарактогенеза и ретинопатии. Доказано, что активация NHE-1 способствует формированию диабетической катаракты, а также окислительно-нитратному стрессу и апоптозу сетчатки [4].

Многочисленные доклинические испытания, проведенные на крысах, кроликах и обезьянах, а также клинические испытания на людях подтверждают снижение ВГД при применении ингибиторов Na⁺/H⁺-обменника (NHE) [5, 6]. Так, в исследовании блокирования Na⁺/H⁺- и Cl^–/HCO₃-обменников карипоридом, амилоридом и этил-изопропил-амилоридом было показано, что данные воздействия в культуре клеток бычьего пигментного и беспигментного эпителия цилиарного тела препятствуют поглощению этими клетками ионов Na⁺, необходимых для секреции внутриглазной жидкости. В ранее проведенных исследованиях на кафедре фармакологии и биоинформатики Волгоградского государственного медицинского университета [6, 7] были выявлены соединения, ингибирующие NHE.

NHE-1 экспрессируется и активен в цилиарном пигментированном эпителии цилиарного тела, где он вместе с антипортером Cl^–/HCO₃ AE2 способствует поглощению NaCl из стромы цилиарного отростка, что выступает решающим этапом для образования водянистой влаги. Кроме того, натрийуретические пептиды, которые локально синтезируются в цилиарном теле, ингибируют активность NHE-1, что, возможно, приводит к снижению ВГД. Кроме того, было показано, что активность NHE-1 регулируется соматостатином, который вырабатывается в этом эпителии и активирует PI3K/AKT и эндотелиальный NO-синтазный путь. В непигментированном эпителии базолатеральные NHEs (возможно, NHE-1 и NHE-4) ингибируются NO, который, вероятно, действует через cGMP и протеинкиназу G [8]. Взятые вместе, эти результаты указывают на возможную роль ингибирования NHE1 в снижении внутриглазного давления. Соответственно, ингибиторы NHE снижают ВГД и могут рассматриваться как потенциальные фармакологические агенты.

Цель настоящего исследования – получение новых гуанидиновых производных хиназолина и изучение их возможного влияния на Na⁺/H⁺-обменник и внутриглазное давление у крыс.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез гетероциклических производных хиназолинового ряда. Производные хиназолина представляют собой биоизостеры мелатонина, который, согласно многочисленным исследованиям [9], не только корректирует нарушенные циркадные ритмы, сон и настроение, но и выступает перспективным соединением для патогенетической терапии глаукомы [6].

N-Алкилирование исходных оснований бензиловым эфиром хлоруксусной кислоты и изопропиловым эфиром α-хлорпропионовой кислоты, а также аминирование промежуточных сложных эфиров хиназолинилкарбоновых кислот гуанидином и аминогуанидином осуществляли по разработанной ранее методике [10]. В результате было синтезировано девять новых пиримидиновых производных хиназолина (I–IX).

Фармакологические свойства синтезированных соединений. NHE-ингибирующая активность in vitro. При физиологическом значении pH NHE-1 имеет низкую активность. Во время возникновения внутриклеточного ацидоза происходит накопление внутриклеточных протонов, которые выводятся из клеток через сарколеммный NHE-1 в обмен на вход ионов Na⁺. Возрастание внутриклеточного содержания ионов Na⁺ активирует 3Na⁺/Ca²⁺-реверсивный обмен через сарколемму, инициируя вход ионов Са²⁺ в кардиомиоциты. Возникает “Са²⁺-перегрузка” [11, 12].

В контрольной серии экспериментов при добавлении к 200 мкл плазмы, богатой тромбоцитами (ПБогТ), раствора Кребса наблюдали увеличение светопропускания в среднем на 30–40% от исходного уровня калибровки. При добавлении к 200 мкл ПБогТ для снижения внутриклеточного рН 600 мкл пропионатного буфера (контрольная серия) происходила активация NHE-1, увеличивался приток Na⁺, связанный с выделением цитозольного H⁺, что приводило к отеку (сферуляции) тромбоцита в результате аккумуляции воды в цитоплазме. При этом наблюдали облегчение светопропускания до 60–70%.

В опытных исследованиях после предварительной инкубации ПБогТ с новыми соединениями или препаратом сравнения зонипоридом происходило снижение уровня светопропускания по отношению к контрольным исследованиям только с натрий-пропионатным буфером. Это свидетельствует о том, что исследуемые соединения ингибируют NHE-1 и уменьшают вероятность сферуляции тромбоцитов. Полученные результаты согласуются с литературными данными [11, 13, 14].

В исследовании in vitro все производные хиназолина в концентрации 1 нМ статистически значимо по отношению к контрольным исследованиям (р < 0.05) вызывали угнетение активности NHE-1. Соединения (II), (IV–VI) и (VIII) превосходили препарат сравнения зонипорид, однако статистически значимые различия с зонипоридом были только в отношении соединения (VIII) (табл. 1).

Офтальмогипотензивные свойства. Офтальмогипотензивную активность исследуемых соединений и препаратов сравнения изучали методом тонометрии на белых беспородных интактных крысах. Животные были разделены на опытные группы, которым в правый (тестовый) глаз инстиллировали (вводили в конъюктивальный мешок) исследуемые соединения, и группы препаратов сравнения, которым в тестовый глаз инстиллировали тимолол и зонипорид. Левый (контрольный, коллатеральный) глаз служил для оценки возможного резорбтивного действия исследуемых соединений. Так, тимолол при инстилляции снижал офтальмотонус через 30 мин на 24% и достигал максимального эффекта через 1 ч (рис. 1а), ВГД-снижающий эффект сохранялся в течение 3 ч, что соответствует литературным данным и подтверждается в терапии. Зонипорид проявлял ВГД-снижающую активность через 60 мин (–27.9%) и достигал максимального эффекта к третьему часу (–46.5%) (рис. 1б).

При изучении влияния ингибиторов NHE на ВГД было выявлено, что из девяти синтезированных пиримидиновых производных хиназолина в различной степени снижали ВГД только четыре соединения – производные (I), (II), (IV) и (VI), остальные пять соединений не проявляли активность.

Соединение (VI) снижало ВГД максимально на 15.8% по отношению к исходному значению ко второму часу исследования, без тенденции к дальнейшему снижению ВГД. У соединения (II) максимальный офтальмогипотензивный эффект был достигнут к первому часу, ВГД было снижено на 21.1%, с последующим уменьшением оказываемого эффекта. Высокую активность, превосходящую препарат сравнения тимолол, проявили соединения (IV) и (I), максимум ВГД-снижающего эффекта в обоих случаях достигался к началу второго часа исследования и составлял 41.0 и 26.3% соответственно. В ходе исследования зонипорида установлено, что ВГД к третьему часу снижается на 46.5%, превосходя препарат сравнения тимолол.

Влияние исследуемых соединений на ВГД коллатерального глаза исследовали с целью выявления системного действия при попадании в кровоток и в дальнейшем прогнозирования возможных побочных эффектов. Таким образом, наиболее активные соединения (IV), (I), (II) и (VI) не вызывают изменения ВГД коллатерального глаза, в отличие от препарата сравнения тимолола, а значит, не проявляют резорбтивный эффект.

Для наиболее активных соединений определяли продолжительность изучаемого эффекта. Так, соединение (IV) через 60 мин после инстилляции снижало ВГД относительно исходного уровня на 36%, через 120 мин – на 41%, но к 180 мин исследуемый показатель возвращался к исходному значению (рис. 2а). Соединение (I) через 60 мин после инстилляции снижало ВГД на 16% относительно исходного уровня, к 120 мин эффективность возрастала до 26%, а к 180 мин гипотензивный эффект не наблюдался (рис. 2б). При инстилляции соединения (II) максимальное снижение ВГД наступало через 60 мин (21%), в дальнейшем активность снижалась: через 2 ч – до 15%, а через 3 ч – до 10% (рис. 2в).

Влияние на коллатеральный глаз у исследуемых соединений (I), (II) и (IV) не было обнаружено и находилось в пределах уровня ошибки.

Зависимость проявляемых фармакологических эффектов от химической структуры исследуемых соединений. По результатам исследования был проведен анализ зависимости ВГД-снижающей активности от химической структуры изучаемых соединений. Все исследуемые производные хиназолина были разделены на две группы (табл. 1): группа 1 включает в себя ацетилгуанидиновые производные хиназолина, группа 2 – пропионилгуанидиновые производные хиназолина.

В группу 1 входят производные хиназолина, в которых гетероцикл соединен с линейным гуанидиновым фрагментом посредством ацетильного линкера. Соединение (I), проявляющее среднюю активность и снижающее ВГД на 26.32%, представляет собой базовую структуру для всех изучаемых в данном исследовании соединений. Замещение атома H на атом Br в положении С6 (IV) приводит к увеличению активности и наибольшему снижению ВГД (–41%), тогда как дальнейшее бромирование в положение С8 (VI), создающее дополнительные электронные и стерические эффекты, снижает изучаемую активность (до ‒15.79%). В то же время наличие одного, но более электроотрицательного атома Cl в положении С6 (VII) приводит к обратному эффекту – незначительному повышению ВГД на 5.26%. Такой же эффект обеспечивает и введение метильной группы в положения С2 (III) и С6 (IX) – ВГД возрастает на 6.45 и 8.57% соответственно. Модификация структуры (IX) и последующее введение атома Br в положение C6 (VIII) приводит к незначительному проявлению активности и снижению офтальмотонуса.

В группу 2 входят гуанидиновые производные хиназолина, у которых линкер представлен пропионильным фрагментом. Обнаружено, что включение в ацетильный линкер базового соединения (I) дополнительной метильной группы (II) почти не влияет на снижение ВГД (–21.1%). Однако дальнейшее бромирование в положение С6 (V), так же как и в случае С2-метилирования, приводит к инверсии эффекта, и это соединение, наоборот, повышает офтальмотонус на 2.94%.

По результатам NHE-ингибиторной активности также был проведен анализ, отображающий связь химических структур изучаемых соединений и проявления фармакологического эффекта. Так, среди производных 4-оксохиназолинацетилгуанидина соединение (I), выступающее базовой структурой для всех изучаемых в данном исследовании соединений, проявляло наименьшую NHE-ингибирующую активность (34.21%). Электроотрицательный атом хлора в положении С6 (VII) приводит к увеличению NHE-ингибирующего действия до 46.12%, а замена Cl^• на метильную группу (IX) повышает активность до 47.05%. Наличие метильного заместителя в положении С2 (III) повышает изучаемую активность до 48.31%. Если же ввести два атома Br в положения С6 и С8 (VI), NHE-ингибиторная активность повышается до 56.70%, сопоставимым эффектом (57.56%) обладает соединение (IV) только с одним атомом Br в положении C6, а замещение атома H^• на метильную группу в положении С2 (VIII) приводит к максимальному среди исследуемых соединений увеличению NHE-ингибирующей активности – до 74.50%.

Среди производных 4-оксохиназолинпропионилгуанидина соединение (II), не имеющее заместителей в хиназолиновом скаффолде, проявляет высокую NHE-ингибирующую активность (56.23%), но введение атома Br в положение С6 (V) повышает активность до 68.85%.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез гетероциклических производных хиназолинового ряда. Все реагенты получали от компаний Sigma-Aldrich (США), AcrosOrganics (Бельгия) и использовали без дополнительной очистки. ЯМР-спектры регистрировали на спектрометре Avance 400 (Bruker, Германия; 400 МГц для ¹H и 100 МГц для ¹³C) в DMSO-d₆ с тетраметилсиланом в качестве внутреннего стандарта. Температуру плавления определяли в стеклянных капиллярах на приборе Mel-Temp 3.0 (Laboratory Devices Inc., США).

Исходные основания – хиназолин-4(3Н)-он и 2-метилхиназолин-4(3Н)-он – коммерчески доступные соединения. 6-Бромхиназолин-4(3Н)-он, 2-метил-6-бромхиназолин-4(3Н)-он и 6,8-дибромхиназолин-4(3Н)-он получали в соответствии с опубликованными методиками [15, 16].

N-[2-[4-Оксохиназолин-3(4Н)-ил]ацетил]гуанидин (I). А. Бензиловый эфир [хиназолин-3(4Н)-ил]уксусной кислоты. Перемешивали 2.00 г (13.7 ммоль) хиназолин-4(3Н)-она и 4.00 г (28.9 ммоль) безводного карбоната калия в 40 мл безводного диметилформамида при 80–85°С в течение 15 мин, добавляли раствор 3.25 г (14.2 ммоль) бензилового эфира бромуксусной кислоты в 10 мл диметилформамида и перемешивали при той же температуре в течение 1 ч. Реакционную массу охлаждали, фильтровали, фильтрат упаривали на роторном испарителе при остаточном давлении 10 мм рт. ст. при температуре бани 90–95°С, остаток охлаждали, растирали с 25 мл воды, фильтровали, промывали на фильтре холодной водой (2 раза по 10 мл), сушили на воздухе в течение суток и кристаллизовали из 50 мл изопропилового спирта. Получили 3.30 г (82%) светло-желтого кристаллического вещества. Т. пл. 116–117°С.

Б. N-[2-[4-Оксохиназолин-3(4Н)-ил]ацетил]гуанидин (I). К кипящему раствору 2.00 г (6.80 ммоль) бензилового эфира [хиназолин-3(4Н)-ил]уксусной кислоты и 0.75 г (7.85 ммоль) гуанидина гидрохлорида в 50 мл безводного метилового спирта добавляли в один прием 0.50 г (8.04 ммоль) гранулированного калия гидроксида и кипятили в течение 30 мин. Горячий раствор фильтровали, отделяя образовавшийся осадок калия хлорида, фильтрат охлаждали и выдерживали в течение суток при комнатной температуре. Выделившийся осадок отфильтровывали, промывали холодным метиловым спиртом (2 раза по 10 мл), 10 мл диэтилового эфира, сушили на воздухе в течение суток при комнатной температуре. Получили 1.45 г (87%) белого кристаллического вещества. Т. пл. 240–242°С. Спектр ¹Н-ЯМР (δ, м.д.; J, Гц): 4.39 (с, 2H, CH₂), 7.50 (т, 1Н, J 8, Н⁶), 7.54 (уш. с, 4Н, NH), 7.65 (д, 1Н, J 8, Н⁸), 7.78 (т, 1Н, J 8, Н⁷), 8.12 (д, 1Н, J 8, Н⁵), 8.22 (с, 1Н, Н²). Спектр ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 49.50, 121.95, 126.32, 127.05, 127.27, 134.37, 148.31, 149.29, 158.95, 160.59, 171.65.

Остальные соединения получали аналогичным образом.

N-[2-[2-Метил-4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]ацетил]гуанидин (III). Белое кристаллическое вещество, выход 80%. Т. пл. 262–264°С. Спектр ¹Н‑ЯМР (δ, м.д.; J, Гц): 2.46 (с, 3Н, СН₃), 4.69 (с, 2Н, СН₂), 6.80 (уш. с, 4Н, NH), 7.45 (т, 1Н, J 8, Н⁶), 7.58 (д, 1Н, J 8, Н⁸), 7.76 (т, 1Н, J 8, Н⁷), 8.07 (д, 1Н, J 8, Н⁵). Спектр ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 26.23, 52.62, 123.22, 129.44, 129.58, 129.84, 137.58, 150.60, 159.02, 164.51, 165.83, 180.77.

N-[2-[6-Метил-4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]-ацетил]гуанидин (IX). Белое кристаллическое вещество, выход 81%. Т. пл. 267–270°С. Спектр ¹Н‑ЯМР (δ, м.д.; J, Гц): 2.44 (с, 3Н, СН₃), 4.35 (с, 2Н, СН₂), 7.55 (д, 1Н, J 8, Н⁸), 7.61 (д, 1Н, J 8, Н⁷), 7.62 (уш. с, 4Н, NH), 7.92 (с, 1Н, Н⁵), 8.16 (с, 1Н, Н²). Спектр ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 21.16, 49.40, 121.87, 125.64, 127.20, 135.49, 136.53, 146.49, 148.62, 159.14, 160.41, 171.48.

N-[2-[6-Хлор-4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]ацетил]гуанидин (VII). Белое кристаллическое вещество, выход 76%. Т. пл. 244–247°С. Спектр ¹Н‑ЯМР (δ, м.д.; J, Гц): 4.36 (с, 2Н, СН₂), 7.56 (уш. с, 4Н, NH), 7.67 (д, 1Н, J 8, Н⁸), 7.80 (д, 1Н, J 8, Н⁷), 8.04 (с, 1Н, Н⁵), 8.26 (с, 1Н, Н²). Спектр ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 52.61, 126.30, 128.33, 132.71, 134.29, 137.44, 150.23, 152.93, 162.16, 162.53, 174.33.

N-[2-[6-Бром-4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]ацетил]гуанидин (IV). Белое кристаллическое вещество, выход 89%. Т. пл. 242–244°С. Спектр ¹Н‑ЯМР (δ, м.д.; J, Гц): 4.37 (с, 2Н, СН₂), 7.47 (уш. с, 4Н, NH), 7.60 (д, 1Н, J 8, Н⁸), 7.90 (д, 1Н, J 8, Н⁷), 8.17 (с, 1Н, Н²), 8.28 (с, 1Н, Н⁵). Спектр ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 52.66, 122.47, 126.60, 131.44, 132.83, 140.17, 150.44, 152.98, 162.08, 162.41, 174.31.

N-[2-[2-Метил-6-бром-4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]ацетил]гуанидин (VIII). Белое кристаллическое вещество, выход 83%. Т. пл. 281–284°С. Спектр ¹Н-ЯМР (δ, м.д.; J, Гц): 2.46 (с, 3Н, СН₃), 4.47 (с, 2Н, СН₂), 7.51 (д, 1Н, J 8, Н⁸), 7.60 (уш. с, 4Н, NH), 7.88 (д, 1Н, J 8, Н⁷), 8.13 (с, 1Н, Н⁵). Спектр ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 23.24, 47.76, 118.44, 121.86, 128.56, 129.20, 137.14, 146.53, 156.98, 159.13, 160.22, 170.91.

N-[2-[6,8-Дибром-4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]ацетил]гуанидин (VI). Светло-желтое кристаллическое вещество, выход 81%. Т. пл. 313–316°С. Спектр ¹Н-ЯМР (δ, м.д.; J, Гц): 4.36 (с, 2Н, СН₂), 7.58 (уш. с, 4Н, NH), 8.18 (с, 1Н, Н⁷), 8.30 (с, 1Н, Н⁵), 8.38 (с, 1Н, Н²). Спектр ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 52,80, 122.24, 126.55, 127.46, 131.41, 142.56, 148.20, 153.87, 161.91, 162.21, 173.70.

N-[2-[4-Оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил]-гуанидин (II). Белое кристаллическое вещество, выход 78%. Т. пл. 268–270°С. Спектр ¹Н-ЯМР (δ, м.д.; J, Гц): 1.57 (д, 3Н, J 8, СН₃), 5.17 (кв, 1Н, J 8, СН), 7.50 (т, 1Н, J 8, Н⁶), 7.61 (уш. с, 4Н, NH), 7.66 (д, 1Н, J 8, Н⁸), 7.80 (т, 1Н, J 8, Н⁷), 8.13 (д, 1Н, J 8, Н⁵), 8.29 (с, 1Н, Н²). Спектр ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 21.30, 56.91, 124.82, 129.56, 129.94, 130.29, 137.36, 150.74, 151.00, 162.14, 163.36, 177.08.

N-[2-[6-Бром-4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил]гуанидин (V). Белое кристаллическое вещество, выход 84%. Т. пл. 264–267°С. Спектр ¹Н‑ЯМР (δ, м.д.; J, Гц): 1.56 (д, 3Н, J 8, СН₃), 5.13 (кв, 1Н, J 8, СН), 7.58 (уш. с, 4Н, NH), 7.60 (д, 1Н, J 8, Н⁸), 7.92 (д, 1Н, J 8, Н⁷), 8.20 (с, 1Н, Н⁵), 8.23 (с, 1Н, Н²). Спектр ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 21.24, 57.28, 122.33, 126.38, 131.65, 132.78, 140.23, 150.02, 151.40, 162.20, 162.28, 176.56.

Фармакологические свойства синтезированных соединений. NHE-ингибирующая активность in vitro. Влияние соединений на активность Na⁺/H⁺-обменника изоформы 1 (NHE-1) изучали in vitro по методу D. Rosskopfetal. (1991) [13] и K. Kusumoto (2002) [14] с модификациями [11] с использованием лазерного анализатора агрегации тромбоцитов АЛАТ-2 (ООО НПФ “БИОЛА”, Россия; программное обеспечение AGGR 2.00, Россия). Для эксперимента были выбраны тромбоциты кролика (исследования выполнены на пяти кроликах-самцах весом 3.0–4.0 кг (Филиал “Электрогорский” ФГБУН НЦБМТ ФМБА, ветеринарное свидетельство 250 № 36969458 от 08.09.2015), поскольку на них активно экспрессирует NHЕ-1. В основу метода положены изменения светопропускания при изменении формы тромбоцита в условиях, имитирующих ишемию. Светопропускание ПБогТ принимали за 0%, раствора Кребса – за 100%.

Из краевой вены уха кролика забирали кровь в пробирки с 3.8%-ным раствором цитрата натрия (в соотношении 1 : 10). Кровь центрифугировали в течение 12 мин (Multi Centrifuge CM 6M, Латвия) при 1000 об/мин. Забирали надосадочную жидкость – плазму, богатую тромбоцитами (ПБогТ).

Контрольные измерения изменений светопропускания проводили без соединений. В условиях отсутствия активности NHЕ-1 (рН 7.4) к 200 мкл ПБогТ добавляли 600 мкл раствора Кребса (в мМ: NaCl – 120, KCl – 4.8, KH₂PO₄ – 1.2, MgSO₄ – 2.5, NaHCO₃ – 25, CaCl₂ – 2.6, глюкоза – 5.4; pH 7.4, 37°С). Для активации NHЕ-1 снижали pH: к 200 мкл ПБогТ добавляли 600 мкл буферного раствора, содержащего натрия пропионат (в мМ: натрия пропионат – 135, HEPES – 20, СaCl₂ – 1, МgCl₂ – 1, глюкоза – 10; pH 6.7, 37°С).

В опытных измерениях изменений светопропускания в кювету к 200 мкл ПБогТ предварительно добавляли изучаемые соединения или препарат сравнения в концентрации 1 нМ и объеме 10 мкл, предварительно инкубировали 5 мин до добавления раствора пропионатного буфера. Все пробы инкубировали при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (800 об/мин, 37°С). В качестве препарата сравнения использовали селективный ингибитор NHE-1 зонипорид (Sigma, США).

Дельта % ингибирования рассчитывали по формуле:

где А – разница светопропускания между контрольными замерами с пропионатным буфером и раствором Кребса; Б – разница светопропускания между замерами с пропионатным буфером в условиях добавления соединений в пробу (опыт) и без них (контроль).

Статистические расчеты проводили в программе Microsoft Excel (Microsoft, США).

Офтальмогипотензивные свойства. Изучение влияние на внутриглазное давление проводили на беспородных интактных крысах обоих полов массой 220–400 г, возрастом 2 месяца (питомник “Рапполово”, Ленинградская область). Все животные были разделены на опытные группы и группы препаратов сравнения по шесть животных в каждой. В 9:00 утра у животных всех групп измеряли исходное ВГД в обоих глазах. Для определения ВГД использовали ветеринарный тонометр ICARE TonoVet (Финляндия) для ранней диагностики глаукомы в ветеринарии [6, 17]. После измерения животным опытных групп проводили инстилляцию 0.2%-ных водных растворов изучаемых соединений в объеме 50 мкл в правый глаз (тестовый). Животным групп препаратов сравнения в тестовый глаз инстиллировали тимолол (лекарственное средство, снижающее ВГД, применяемое в клинической практике; Тимолол-СОЛОфарм 0.5%, Гротекс, Россия) и 0.2%-ный раствор зонипорида (стандартный ингибитор NHE; Sigma, США). Левый глаз (контрольный, коллатеральный) служил для определения возможного резорбтивного эффекта. ВГД в тестовом и коллатеральном глазах измеряли через 30, 60, 120, 180 и 240 мин.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Office и Graph Pad Prizm (GraphPad Software, США).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтезировано девять новых пиримидиновых производных хиназолина, изучено их влияние на ингибирование Na⁺/H⁺-обменника и внутриглазное давление (ВГД) крыс в сравнении с зонипоридом (ингибитор NHE) и тимололом (препарат для снижения ВГД, используемый в клинической практике). Показано, что соединение (IV) – бромированное в положении С6 производное 4‑оксохиназолинацетилгуанидина – выступает ингибитором NHE-1 и обладает высокой офтальмогипотензивной активностью у крыс, превосходящей препарат сравнения тимолол, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения его возможных антиглаукомных свойств, а также детализации механизма действия в отношении внутриглазного давления.