Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 2, стр. 109-114

ВВЕДЕНИЕ

Клеточные функции регулируются внутриклеточным Са²⁺, уровень и динамика которого контролируются рядом внутриклеточных транспортных и сигнальных систем. Одним из важнейших является фосфоинозитидный путь, который сопрягает многие гептаспиральные (G-protein-coupled receptor, GPCR) и некоторые тирозинкиназные рецепторы с мобилизацией внутриклеточного Са²⁺ [1]. Это сопряжение протекает в несколько стадий, включая агонист-зависимую активацию фосфолипазы С (PLC), катализирующей гидролиз фосфолипида PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate), в результате чего продуцируются два вторичных медиатора: водорастворимый инозитолтрисфосфат (IP₃, inositol 1,4,5-trisphosphate) и липидный диацилглицерин (DAG, diacylglycerol). В свою очередь, IP₃ стимулирует IP₃-рецепторы, являющиеся внутриклеточными IP₃-активируемыми Са²⁺-каналами, функционирующими в эндоплазматическом ретикулуме и ответственными за высвобождение депонированного Са²⁺ [1, 2]. Этот первоначальный агонист-зависимый Са²⁺-сигнал может инициировать так называемый Са²⁺-индуцированный выброс Са²⁺ (Са²⁺-induced Са²⁺ release, CICR), который играет ключевую роль в превращении локальных Са²⁺-сигналов в глобальные, а также в распространении Са²⁺-волн в цитоплазме клеток [3–5]. Регенеративный процесс CICR происходит за счет того, что в определенной области концентраций внутриклеточный Са²⁺ стимулирует IP₃-рецепторы [2] и/или рианодиновые рецепторы, которые также являются внутриклеточными Са²⁺-каналами, обеспечивающими выброс Са²⁺ из Са²⁺-депо [6].

Существенный прогресс в исследовании внутриклеточных сигнальных процессов был достигнут в значительной степени благодаря ингибиторному анализу, который опирается на широкий спектр соединений, способных проникать в клетки и избирательно модулировать активность сигнальных белков. Например, рианодиновые рецепторы активируются кофеином, но ингибируются рианодином, что позволяет оценивать их вклад в генерацию внутриклеточных Са²⁺-сигналов [6, 7]. Фармакологический инструментарий для функциональных исследований IP₃-рецепторов менее эффективен. Среди применяемых агонистов заслуживает внимания лишь проникающий предшественник IP₃ (Bt3-Ins(145)P3/AM), хотя индуцируемый им подъем уровня внутриклеточного IP₃ и его динамика сильно зависят от скорости гидролиза эфирной группы внутриклеточными эстеразами и от интенсивности метаболизма IP₃ в данной клетке. Имеется несколько соединений, которые считаются антагонистами IP₃-рецепторов: гепарин, ксестоспонгины (xestospongin С, xestospongin D) и 2-APB (2-amino-ethoxydiphenyl borate) [8–10]. Их использование в качестве ингибиторов IP₃-зависимого выброса Са²⁺ связано с рядом проблем. Так, гепарин не проникает через мембрану, и его быстрая доставка в цитоплазму клетки может быть осуществлена либо с помощью инъекции, либо путем пермеабилизации (permeabilization) с использованием детергентов или токсинов, формирующих поры в плазматической мембране [11]. Существенный недостаток этого подхода состоит в том, что условия, при которых поры образуются преимущественно в плазматической мембране, но не во внутриклеточных органеллах, подобрать трудно.

Хотя в ранних работах утверждалось, что ксестоспонгины ингибируют IP₃-зависимый выброс Са²⁺ [9], в дальнейшем прямое ингибирование IP₃-рецепторов ксестоспонгинами было поставлено под сомнение (например, [12]). Более того, в недавней работе с использованием пермеабилизованных клеток было показано, что ксестоспонгины С и D не являются ингибиторами IP₃-рецепторов всех трех типов [11]. В пионерской работе Мариямы и соавторов [10] было показано, что 2-APB является проникающим через мембрану соединением, способным ингибировать IP₃-индуцируемый выброс Са²⁺. Оказалось, что в этих эффектах основной мишенью 2-APB являлся IP₃-рецептор типа 1 [11]. Между тем ряд работ указывает на то, что действие 2-APB на внутриклеточную Са²⁺-сигнализацию может быть опосредовано и иными механизмами. К ним относятся блокирование входа наружного Са²⁺ через потенциал-независимые Сa²⁺-проницаемые каналы, включая депо-управляемые каналы (SOC, store-operated channel) [13–15], ингибирование ретикулярной Са²⁺-ATP-азы SERCA [16] и активация Са²⁺-проницаемых каналов TRPV1, TRPV2 и TRPV3 [17].

Обычно анализ роли различных внутриклеточных сигнальных и транспортных систем в генерации Са²⁺-сигналов основан на мониторинге цитозольного Са²⁺ с использованием высокоаффинных флуоресцентных Са²⁺-зондов (Fura-2, Fluo-4) в сочетании с ингибиторным анализом. В силу недостаточной специфичности многих ингибиторов, отмеченной выше, трудно однозначно интерпретировать результаты ингибиторного анализа, основываясь лишь на одном измеряемом параметре – концентрации свободного Са²⁺ в цитозоле клетки. Это ставит задачу одновременного мониторинга Са²⁺ и в других компартментах, вовлеченных в Са²⁺-обмен, таких как эндоплазматический/саркоплазматический ретикулум, митохондрии и лизосомы. Наиболее эффективно эта задача решается с использованием генетически кодируемых Са²⁺-зондов на основе флуоресцентных белков, содержащих в своей последовательности сигнал локализации в том или ином компартменте [18]. В настоящей работе мы использовали генетически кодируемый низкоаффинный (K_d = 672 мкМ) Са²⁺-индикатор G-CEPIA1er [19] для мониторинга Са²⁺ в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) клеток HEK-293.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались клетки линии HEK-293, которые культивировались во влажной атмосфере с 5% СО₂ при 37°С в планшете с 12 лунками с 1 мл среды DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки в каждой. Клетки трансфицировались плазмидным вектором pCMV-G-CEPIA1er (Addgene). Для временной трансфекции в лунку добавляли 1 мкг pCMV-G-CEPIA1er и 2 мкл липофектамина 3000 (Thermo-Fisher). После инкубации клеток в течение 5–6 ч при 37°С трансфекционная среда замещалась на обычную культуральную среду. Регистрации проводились через 24–72 ч после трансфекции. Качество трансфекции оценивалось по интенсивности и распределению эмиссии флуоресцентного белка GFP, являющегося индикаторной частью сенсора G-CEPIA1er.

Для фотометрических экспериментов клетки инкубировали при комнатной температуре (23–25°C) в присутствии проникающего агента Fura-2 AM (4 мкМ) и детергента Pluronic (0.02%) (оба из Molecular Probes) в течение 20–30 мин, что обеспечивало загрузку клеток Са²⁺-зондом Fura-2. Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl – 140, KCl – 5, CaCl₂ – 2, MgSO₄ – 1, HEPES – 10, глюкоза – 10. В случае необходимости 2 мМ CaCl₂ заменялся на 1 мМ EGTA + 0.8 мМ CaCl₂, чтобы снизить концентрацию свободного Са²⁺ во внеклеточном растворе до 250 нМ. Фотометрические эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200 (Carl Zeiss), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20×/0.75 и цифровой EMCCD камерой iXon 888 (Andor Technology). Флуоресценцию Са²⁺-индикаторов возбуждали при длинах волн 340 ± 5 и 380 ± 5 нм в случае Fura-2 и 480 ± 5 нм в случае G-CEPIA1er. Эмиссию обоих зондов регистрировали в области 525 ± 20 нм. Изменение свободного Са²⁺ в цитозоле и в ЭР индивидуальных клеток оценивали по отношению F₃₄₀/F₃₈₀ и ΔF/F₀ соответственно, где F₃₄₀ и F₃₈₀ – интенсивности эмиссии Fura-2 при возбуждении при 340 и 380 нм соответственно, а ΔF = F₀ – F, где F и F₀ – текущая интенсивность эмиссии G-CEPIA1er и его эмиссия в начале регистрации, соответственно. Количественный фотометрический анализ изображений проводили с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Микрофотометрия клеток HEK-293, экспрессирующих Са²⁺-сенсор G-CEPIA1er и нагруженных Са²⁺-зондом Fura-2, позволила сопоставить динамику свободного Са²⁺ в цитозоле и ЭР индивидуальных клеток в различных условиях. Одна из типичных регистраций представлена на рис. 1. Поскольку в клетках HEK-293 функционируют GPCR-рецепторы нуклеотидов P2Y-типа, сопряженные с фосфоинозитидным каскадом, кратковременная аппликация 2–5 мкМ АТР инициировала импульс Са²⁺ в цитозоле клеток (рис. 1, верхняя кривая) и синхронное падение и восстановление уровня ретикулярного Са²⁺ (рис. 1, нижняя кривая). Такое согласованное поведение Са²⁺ в цитоплазме и ЭР было вполне ожидаемо, поскольку многие агонисты GPCR-рецепторов, включая АТР, стимулируют выброс Са²⁺, депонированного в ЭР [1].

Рис. 1.

Репрезентативная регистрация цитоплазматического и ретикулярного Са²⁺ в одиночной клетке линии HEK-293 (n = 51). Верхняя панель – мониторинг цитоплазматического Са²⁺ по флуоресценции Са²⁺-зонда Fura-2. Данные представлены как отношение F₃₄₀/F₃₈₀, где F₃₄₀ и F₃₈₀ – интенсивности эмиссии Fura-2 при возбуждении на 340 и 380 нм. Нижняя панель – одновременный мониторинг Са²⁺ в ЭР по флуоресценции Са²⁺-сенсора G-CEPIA1er. Данные представлены в виде ΔF/F₀, где ΔF = F₀ – F, F и F₀ – текущая интенсивность эмиссии G-CEPIA1er и эмиссия в начале регистрации, соответственно. Моменты аппликации 2 мкМ ATP, 2 мкМ тапсигаргина и 50 мкМ 2-APB обозначены на верхней панели линиями над экспериментальной кривой.

Выброс депонированного Са²⁺ приводит к истощению Са²⁺-депо, которое пополняется Са²⁺-ATP-азой SERCA (sarco-endoplasmic reticulum Ca²⁺ ATPase), перекачивающей Са²⁺ из цитоплазмы в ЭР, а также за счет входа наружного Са²⁺ через SOC-каналы (store-operated channels), активируемые при опустошении Са²⁺-депо [20, 21]. Сообразно с этой универсальной закономерностью, тапсигаргин (thapsigargin) (2 мкМ), эффективный игибитор ретикулярной Са²⁺-ATP-азы [20], вызывал постепенное падение Са²⁺ в ЭР (рис. 1, нижняя кривая) за счет утечки депонированного Са²⁺, которая обеспечивается специализированными ионными каналами [22] и, возможно, фоновой активностью IP₃-рецепторов. Опустошение Са²⁺-депо ожидаемо сопровождалось активацией SOC-каналов и увеличением входа наружного Са²⁺, что приводило к росту концентрации Са²⁺ в цитоплазме (рис. 1, верхняя кривая). Аппликация 2-APB (50 мкМ), блокирующего SOC-каналы, возвращала цитозольный Са²⁺ практически к уровню покоя, очевидно, за счет активности Са²⁺-насосов плазматической мембраны. Последующее удаление 2-APB приводило к деблокированию SOC-каналов, увеличению входа наружного Са²⁺ и, соответственно, росту цитозольного Са²⁺ (рис. 1, верхняя кривая). Следует отметить, что концентрация полуингибирования различных изоформ SERCA тапсигаргином лежит в области низких наномолярных концентраций [23]. Учитывая это обстоятельство, можно было ожидать, что тапсигаргин при внеклеточной концентрации 2 мкМ должен был полностью подавить активность ретикулярной Са²⁺-ATP-азы. Поэтому существенное уменьшение скорости падения депонированного Са²⁺, инициированное 2-APB на фоне тапсигаргина (рис. 1, нижняя кривая), можно было объяснить тем, что это соединение блокировало Са²⁺-каналы утечки и ингибировало фоновую активность IP₃-рецепторов.

Это предположение, однако, противоречило данным экспериментов, в которых анализировалось действие 2-APB (50 мкМ) на Са²⁺-ответы клеток, инициированные ATP (2 мкМ). Оказалось, что клетки, в которых ATP индуцировал импульсы цитозольного Са²⁺, обратимо теряли чувствительность к АТР в присутствии 2-APB (50 мкМ) (рис. 2, верхняя кривая). Этот эффект 2-APB обычно интерпретируется как свидетельство блокады IP₃-рецепторов. Между тем, мониторинг депонированного Са²⁺ указывал на то, что 2-APB также вызывал обратимое падение депонированного Са²⁺ (рис. 2, нижняя кривая). 2-APB опустошал Са²⁺-депо на 25–30%, если принять за ноль уровень Са²⁺, который достигался в ЭР после аппликации Са²⁺-ионофора иономицина (5 мкМ). Последний быстро проникал в клетку и опустошал ЭР, уровень Са²⁺ в котором был существенно выше, чем в цитоплазме (рис. 2, нижняя кривая). Поэтому подавление клеточных ответов на ATP в присутствии 2-APB не могло быть связано со слишком низким уровнем депонированного Са²⁺ и несомненно было обусловлено вызванным 2-APB блокированием IP₃-рецепторов. В то же время быстрое падение Са²⁺ в ЭР (рис. 2, нижняя кривая) свидетельствовало о том, что 2-APB активировал утечку Са²⁺, что трудно согласовать с действием, оказываемым этим ингибитором на фоне тапсигаргина (рис. 1, нижняя кривая).

Рис. 2.

2-APB стимулирует выброс депонированного Са²⁺ в клетках HEK-293. Верхняя панель – репрезентативная регистрация (44 клетки) цитоплазматического Са²⁺ при стимуляции клетки ATP (2 мкМ) и 2-APB (50 мкМ) при 2 мМ Са²⁺ в экстраклеточном растворе. Перед аппликацией иономицина наружный Са²⁺ снижался до 250 нМ. Нижняя панель – одновременный мониторинг Са²⁺ в ЭР.

Уровень Са²⁺ в ЭР определяется балансом между поступлением Са²⁺, обеспечиваемым Са²⁺ насосом SERCA, и выходом Са²⁺ в цитозоль через различные Са²⁺-проницаемые каналы, функционирующие в ЭР. Среди таковых IP₃- и рианодиновый рецепторы, которые обеспечивают быстрый выброс Са²⁺ и генерацию Са²⁺-сигналов [1, 3]. Другие Са²⁺-проницаемые каналы выполняют функцию регулируемой Ca²⁺-утечки [22]. Среди них следует отметить ретикулярные Са²⁺-каналы с функциональным названием CLAC (Ca²⁺ load-activated Ca²⁺ channel), которые формируются канальными субъединицами TMCO1 (transmembrane and coiled-coil domains 1). CLAC-каналы активируются за счет тетрамеризации субъединиц TMCO1, которая иницируется при высокой концентрации Са²⁺ в люмене ЭР. Это рассматривается как механизм, предотвращающий перегрузку Са²⁺-депо [24]. Если предположить, что 2-APB способен активировать CLAC-каналы, понижая аффинность TMCO1 к свободному Са²⁺ в люмене ЭР, то можно объяснить различие в эффектах 2-APB, наблюдавшееся нами в различных условиях (рис. 1 и 2). Действительно, при длительной аппликации тапсигаргина ЭР опустошался (рис. 1, нижняя кривая), и 2-APB был не способен стимулировать CLAC-каналы из-за низкой концентрации Са²⁺ в люмене ЭР. В условиях, при которых уровень Са²⁺ в ЭР был высок, 2-APB инициировал выброс ретикулярного Са²⁺, повышая активность CLAC-каналов (рис. 2, нижняя кривая). Этот эффект 2-APB был обратим за счет восполнения Са²⁺ в ЭР активной SERCA. Доказательство функциональности предполагаемого механизма требует отдельных экспериментов непосредственно с CLAC-каналами.

Работа поддержана Российским научным фондом (грант 18-14-00347).