Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 4, стр. 296-300

ВВЕДЕНИЕ

Разнообразные сигнальные молекулы, секретируемые клетками и распознаваемые поверхностными рецепторами, вовлечены в межклеточные коммуникации и аутокринную регуляцию клеточных функций. Среди них пурины (ATP, ADP, β-NAD, ADPR, cADPR, аденозин) и пиримидины (UTP, UDP) секретируются клетками или продуцируются внеклеточно эктонуклеотидазами фактически во всех тканях [1–3]. Ранее нами было показано, что мезенхимные стромальные клетки (МСК), выделенные из жировой ткани человека и поддерживаемые в первичной культуре, способны распознавать широкий спектр первичных медиаторов, включая норадреналин, ГАМК, ацетилхолин, серотонин и ряд других агонистов гептаспиральных рецепторов (G-protein coupled receptor, GPCR) [4]. Не вызывает сомнения то, что МСК из различных источников представляют собой клеточную популяцию, гетерогенную функционально и на молекулярном уровне [5, 6]. Так, первичная культура МСК из жировой ткани человека содержит субпопуляции клеток, которые специфически чувствительны к какому-либо агонисту, способному стимулировать мобилизацию цитозольного Са²⁺ [4]. Наиболее многочисленной оказалась субпопуляция МСК, чувствительных к АТР и другим нуклеотидам [4, 7]. Интересной особенностью Са²⁺-ответов МСК на агонисты была их генерация по принципу “все или ничего”. Иными словами, в малых дозах агонист не вызывал изменения Са²⁺ в цитоплазме МСК, но при превышении пороговой концентрации инициировал глобальный Са²⁺-сигнал, величина и кинетика которого слабо зависела от интенсивности стимуляции [4, 7]. Этот феномен находит рациональное объяснение, если предположить, что трансдукция Са²⁺-мобилизующих агонистов в МСК протекает в две стадии [8]. Агонист первоначально вызывает локальный и градуальный Са²⁺-сигнал, активируя GPCR-рецептор, сопряженный G-белком с фосфолипазой С, и инициируя продукцию IP₃ с последующим выбросом депонированного Са²⁺ через рецепторы IP₃. При достижении порогового уровня локальный Са²⁺-сигнал инициирует лавинообразный выброс Са²⁺ по механизму CICR (Са²⁺-induced Са²⁺ release), который играет ключевую роль в превращении локальных Са²⁺-сигналов в глобальные, а также в распространении Са²⁺-волн в цитоплазме клеток [9, 10]. В основе феномена CICR лежит положительная обратная связь по Са²⁺, которой охватывается высвобождение Са²⁺ из Са²⁺-депо через IP₃- и рианодиновые рецепторы, активность которых стимулируется цитоплазматическим Са²⁺ в определенном диапазоне концентраций [11, 12].

Одним из существенных аспектов изучения этой двухстадийной системы трансдукции агонистов в МСК является вопрос о том, каким образом регулируется порог инициации CICR и амплитуда результирующего глобального Са²⁺-сигнала. Мы анализировали эту проблему на примере пуринергической системы МСК и, в частности, обнаружили, что cGMP-зависимое фосфорилирование может играть существенную роль в регуляции чувствительности МСК к агонистам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали МСК человека, предоставленные Покровским банком стволовых клеток (С.-Петербург). Паспортизированные образцы первичных культур МСК получены из жировой ткани здоровых доноров при наличии информированного согласия в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения РФ от 11 августа 2017 г. № 517н и рекомендациями Хельсинкской декларации (Хельсинкская декларация WMA об этике. Принципы медицинских исследований с участием людей, с поправками, внесенными 64-й Генеральной Ассамблеей WMA, Форталеза, Бразилия, октябрь 2013 г.).

МСК культивировали в 12-луночном планшете (Corning, США) в среде Advance Stem (HyClone, США) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. При достижении 80% монослоя клетки пассировали. Клетки обрабатывали раствором Версена (Sigma, США) и HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone), а затем рассаживали в соотношении 1 : 4. В экспериментах использовали МСК второго–четвертого пассажей. Перед экспериментом клетки двукратно промывали раствором Версена (Sigma), инкубировали в растворе трипсина (Sigma), ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали в пробирку, затем концентрировали на дне пробирки центрифугированием. Клетки прикрепляли с помощью адгезивного материала Cell Taк на дно фотометрической камеры, представляющей собой покровное стекло Menzel-Glaser с пластиковыми бортиками, и затем загружали флуоресцентным Са²⁺-зондом Fluo-4. Для этого клетки инкубировали при комнатной температуре (23–25°С) в присутствии проникающего аналога Fluo-4AM (4 мкМ) и детергента Pluronic (0.02%) (оба Molecular Probes, США) в течение 20 мин. Затем клетки отмывали раствором, содержащим (мМ): NaCl – 110, KCl – 5.5, CaCl₂ – 2, MgSO₄ – 0.8, NaH₂PO₄ · · H₂O – 1, HEPES – 10, глюкоза – 10, в котором их выдерживали при 4°С в течение 40 мин.

Фотометрические эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Carl Zeiss, Германия), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20×/0.75 и цифровой EMCCD камерой Luca-R (Andor Technology, США). Помимо осветителя проходящего света, микроскоп был оборудован оптоволоконным осветителем для освещения через объектив с использованием осветителя на сверхъярких диодах (340–535 нм) [13]. Флуоресценцию Fluo-4 возбуждали при длине волны 480 ± 5 нм, эмиссию зонда регистрировали в области 525 ± 20 нм. Последовательные флуоресцентные изображения клеток регистрировали 1 раз в секунду. Изменение свободного Са²⁺ в цитозоле клеток оценивали по отношению ΔF/F₀, где ΔF = F₀ – F, F и F₀ – текущая интенсивность эмиссии Fluo-4 и его эмиссия в начале регистрации соответственно. Количественный фотометрический анализ изображений проводили с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC, США). Использованные в экспериментах соли, HEPES, глюкозу и ATP приобретали у Sigma-Aldrich (США); IBMX, H89 и KT-5823 получены от Tocris (Великобритания).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Чувствительность МСК к АТР оценивали по Са²⁺-сигналам, инициируемым данным нуклеотидом в цитоплазме клеток. В общей сложности в популяции МСК, исследованной в работе, 78 клеток (31%) идентифицированы как пуринергические, исходя из того, что в них наблюдалась мобилизация Са²⁺ в ответ на аппликацию АТР (0.5–5 мкМ) (рис. 1а). Хотя чувствительность МСК к АТР несколько варьировала от клетки к клетке, в большинстве из них (~90%) 1.5 мкМ АТР вызывал массированную мобилизацию внутриклеточного Са²⁺ (рис. 1а, 1б). При этом Са²⁺-ответы на кратковременную аппликацию АТР в дозах 1.5–5 мкМ были сходны кинетически и по амплитуде (рис. 1а).

Рис. 1.

Ответы МСК на АТР в различных условиях. а – Репрезентативная синхронная регистрация Са²⁺-ответов двух клеток на АТР, апплицируемого при варьируемых концентрациях в контроле и в присутствии 50 мкМ IBMX. Здесь и ниже моменты аппликации обозначены горизонтальными отрезками выше экспериментальной кривой. б – Распределение клеток в популяции пуринергических МСК (n = 54), отвечающих на АТР в указанной концентрации в контроле и присутствии 50 мкМ IBMX. в – репрезентативная регистрация ответов клетки на 1.5 мкМ АТР в контроле и в присутствии ингибиторов. г – синхронная регистрация Са²⁺-ответов трех клеток на 1.5 мкМ АТР в контроле и в присутствии 1 мкМ KT-5823. д, е – Влияние ингибирования PKG на характерное время задержки τ_d (верхняя панель) ответов МСК на 1.5 мкМ АТР. д – Усредненные задержки, полученные для KT-5823-чувствительных МСК (n = 9) в контроле и в присутствии 1 мкМ KT-5823. Символ * означает статистически значимое различие (t-критерий Стьюдента, р < 0.05). е – Усредненные задержки, полученные для KT-5823-нечувствительных МСК (n = 4) в контроле и в присутствии 1 мкМ KT-5823. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Помимо основного активатора IP_3, активность рецепторов IP₃ регулируется Са²⁺, АТР, Са²⁺-связывающими белками (CaBP1, CaM) и фосфорилированием при участии ряда протеинкиназ (PKA, PKC, PKG, Akt, mTOR) [14, 15]. Участие в том или ином физиологическом процессе протеинкиназ, регулируемых сAMP (cAMP-dependent protein kinase, РКА) и сGMP (cGMP-dependent protein kinase, PKG), можно установить достаточно легко, поскольку к настоящему моменту разработан обширный фармакологический инструментарий для манипуляции активностью циклаз, фосфодиэстераз (PDE) и собственно PKA и PKG. В ряде экспериментов мы использовали IBMX – неспецифический ингибитор PDE, ожидаемым клеточным эффектом которого должно быть увеличение внутриклеточных концентраций как cAMP, так и cGMP. Оказалось, что при концентрации 50 мкМ, близкой по порядку величины к IC₅₀, для блокирования различных изоформ PDE (www.tocris.com), IBMX оказывал значимое влияние на чувствительность МСК к АТР, увеличивая пороговую концентрацию и несколько меняя зависимость амплитуды Са²⁺-ответов от концентрации АТР (рис. 1а). Так, среди пуринергических МСК (n = 54), которые стимулировались АТР в концентрации 0.5–5 мкМ, 3 и 16 клеток ответили на агонист, использованный в дозах 0.5 и 1 мкМ соответственно (рис. 1б). В присутствии 50 мкМ IBMX АТР инициировал Са²⁺-сигналы в МСК, только начиная с дозы 1.5 мкМ (рис. 1б). При этом в контроле за редким исключением (рис. 1а, верхняя панель) амплитуды Са²⁺-ответов были примерно одинаковы при всех дозах АТР, т.е. следовали принципу “все или ничего”. В присутствии IBMX наблюдалась более градуальная зависимость доза-ответ (рис. 1а).

Учитывая, что наиболее универсальный путь регуляции клеточных функций циклическими нуклеотидами – это сАМР/cGMP–зависимое фосфорилирование различных белков, мы анализировали эффекты специфичных ингибиторов PKA и PKG, а именно H89 и KT-5823 соответственно. В общей сложности проанализировано 13 клеток, которые генерировали Са²⁺-ответы на 1.5 мкМ АТР, и во всех случаях 50 мкМ IBMX обратимо ингибировал клеточные ответы (рис. 1в). На фоне IBMX добавление во внеклеточный раствор H89 (2–4 мкМ) не восстанавливало чувствительность клеток к 1.5 мкМ АТР (рис. 1в). Между тем, если МСК инкубировали в присутствии комбинации ингибиторов IBMX (50 мкМ) + H89 (4 мкМ) + KT-5823 (1 мкМ), то они cохраняли способность генерировать нормальные по форме и кинетике Са²⁺-сигналы в ответ на 1.5 мкМ АТР (рис. 1в). Это свидетельствовало о том, что ингибиторный эффект IBMX обусловлен увеличением уровня циклических нуклеотидов в цитоплазме МСК и, как следствие, увеличением активности PKA и PKG. Последняя, видимо, играла ключевую роль в эффектах этого ингибитора PDE.

В ряде экспериментов мы анализировали функциональные последствия ингибирования PKG с использованием пуринергических МСК. Следует отметить, что МСК генерируют Са²⁺-ответы на агонисты с заметной задержкой в пределах 15–100 с обратно пропорциональной зависимостью от концентрации лиганда [8]. Среди исследованных в данной серии пуринергических МСК (n = 17) 13 были достаточно чувствительны, так что 1.5 мкМ АТР инициировал высокоамплитудные Са²⁺ -ответы с характерной задержкой (рис. 1г, клетки 1 и 2). При аппликации 1 мкМ KT-5823 в 9 из 13 МСК наблюдалось существенно уменьшение характерного времени задержки τ_d, которое определялось как время достижения полуответа от момента аппликации стимула (рис. 1г, клетка 1). Для таких KT-5823-чувствительных клеток τ_d в среднем составляло 72 ± 14 с в контроле и снижалось до 45 ± 10 с под действием ингибитора PKG (рис. 1д). В четырех клетках 1 мкМ KT-5823 не оказывал существенного влияния на задержку (рис. 1г, клетка 2; рис. 1е). В таких клетках характерное время задержки в контроле составило 38 ± 13 с, т.е. было статистически неотличимо от 45 ± 11 с, полученных для KT-5823-чувствительных клеток в присутствии ингибитора (рис. 1д). Этот факт указывал на возможность того, что в KT-5823-нечувствительных МСК уровень cGMP в покое был низок, следствием чего была низкая активность PKG. В этом случае ингибирование PKG не должно было приводить и не приводило к значимым изменениям параметров ответов на АТР. Следует также отметить, что четыре клетки не отвечали на 1.5 мкМ АТР в контроле, но их чувствительность к нуклеотиду обратимо восстанавливалась после прединкубации в среде, содержащей 1 мкМ KT-5823 (рис. 1г, клетка 3). В своей совокупности полученные данные (рис. 1в–1е) свидетельствуют о том, что трансдукция АТР в МСК модулируется cGMP-зависимым фосфорилированием.

В заключение отметим, что в МСК из жировой ткани человека генерация Са²⁺-ответов на агонисты основана практически исключительно на высвобождении депонированного Са²⁺ через рецепторы IP₃ [8]. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что PKG может фосфорилировать рецепторы IP₃ типа 1 (IP3R1) [16, 17] и типа 3 [18]. При этом cGMP-зависимое фосфорилирование IP3R1 сопровождается уменьшением IP3-зависмого выброса депонированного Са²⁺ [17]. В гладкомышечных клетках IP3R1 и PKG найдены в комплексе с белком IRAG (IP₃R-associated cGMP kinase substrate), cGMP-зависимое фосфорилирование которого ассоциировано с подавлением IP3-зависмого выброса депонированного Са²⁺ [20]. Таким образом, описанная в цитированных работах PKG-зависимая регуляция IP3-зависмого выброса Са²⁺ сводится к его подавлению. Если в МСК PKG-регулируемый IP3R1 играет доминантную роль в генерации первоначального локального агонист-зависимого Са²⁺-сигнала, то можно ожидать, что его скорость должна увеличиваться при ингибировании PKG. Как результат, в присутствии KT-5823 этот локальный Ca²⁺-сигнал должен раньше достигать порога, при котором запускается CICR, формирующий глобальный Са²⁺-сигнал, детектируемый в эксперименте (рис. 1). Это эквивалентно наблюдаемому уменьшению задержки (рис. 1г, клетка 1). Адекватность этой модели требует дальнейшей верификации.

Работа поддержана Российским научным фондом (грант 18-14-00347).