Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 6, стр. 400-408

ВВЕДЕНИЕ

Тромбин – важнейшая сериновая протеаза системы гемостаза, локальное повышение концентрации которой в нервной ткани наблюдается при тромбозах различной этиологии вследствие повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [1, 2]. Эта протеаза не только участвует в тромбообразовании, но и вовлечена в регуляцию ряда сопровождающих нарушения мозгового кровообращения физиологических процессов таких, как воспалительные реакции, изменение сосудистой проницаемости и гибель нейронов [1–3]. Эффекты тромбина реализуются через рецепторы, активируемые протеазами (ПАР), прежде всего, ПАР1 [3–6]. При этом ПАР, будучи рецепторами, сопряженными с G-белками (GPCRs), являются объектом регуляции многофункциональных адаптерных белков – β-аррестинов [3, 5–8].

Тромбин активирует ПАР1 посредством расщепления его N-конца в специфическом сайте (Арг⁴¹-Сер⁴²), что приводит к формированию “привязанного” лиганда, взаимодействующего со второй внеклеточной петлей рецептора, с последующим запуском G_q- или G_12/13-белокзависимых каскадов. В результате этого наблюдается опосредованное RhoA нарушение барьерных свойств эндотелия, экспонирование адгезивных молекул на поверхности эндотелиоцитов, усиление пролиферативной и секреторной активности глиальных клеток, гибель нейронов [3–8]. В этом случае β-аррестины, связываясь с ПАР1, чьи специфические сайты внутриклеточных петель фосфорилированы киназами GPCRs (GRKs), препятствуют дальнейшей активации G-белков, инициируя десенситизацию и интернализацию рецептора (рис. 1а) [5, 6].

Рис. 1.

Различные внутриклеточные сигнальные пути тромбина, запускаемые при активации ПАР1, и участие в них β‑аррестинов. а – Классический сигнальный путь, запускаемый тромбином через G-белки ([3] с изменениями); б – сигнальный путь, запускаемый тромбином опосредованно через активированный протеин С (АПС) ([3] с изменениями); в – непосредственная активация β-аррестиновой сигнализации тромбином ([7] с изменениями) (GRKs – киназы рецепторов, сопряженных с G-белками, ПКС – протеинкиназа С, ТМ – тромбомодулин, ПС – протеин С, ЭРПС – эндотелиальный рецептор протеина С, КАВ1 – кавеолин типа 1, Dvl-2 – регуляторный фосфопротеин Dishevelled-2, RhoA и Rac1 – GTP-азы).

Помимо этого, тромбин обладает и цитопротекторными свойствами, которые не зависят от G-белков и связаны, прежде всего, со способностью протеазы расщеплять протеин С (ПС) с образованием его активированной формы – АПС. АПС, в свою очередь, в отличие от тромбина протеолитически расщепляет ПАР1 между Арг⁴⁶ и Асн⁴⁷, что приводит к связыванию с рецептором β-аррестинов, рекрутирующих ряд эффекторных белков. В результате наблюдается стабилизация эндотелиальных барьеров с вовлечением Rac1, антиапоптотическое действие, подавление нейровоспаления и т.д. В этом случае для АПС-зависимой активации ПАР1 необходима колокализация рецептора с эндотелиальным рецептором ПС и тромбомодулином в кавеоле (рис. 1б) [3, 8]. Кроме того, на основе результатов экспериментов, проведенных на культуре эндотелиоцитов, выдвинута гипотеза о том, что и сам тромбин, непосредственно активируя ПАР1, расположенный в кавеоле, может запускать схожие цитопротекторные сигнальные пути с вовлечением β-аррестинов (рис. 1в) [7].

Следовательно, возможно инициирование разнонаправленных внутриклеточных сигналов посредством активации ПАР1 как через G-белки, так и через β-аррестины. Подобный сигнальный дуализм, названный “смещенным агонизмом”, определяется характером “молекулярного ансамбля”, в котором пребывает рецептор, и паттерном его фосфорилирования GRKs [9–12]. Считается, что большинство GPCRs регулируются двумя представителями семейства β-аррестинов – β-аррестином-1 и -2 [11].

Вместе с тем роль β-аррестина-2 в развитии тромбин-индуцированных повреждений нервной ткани не выяснена. В связи с этим актуально исследование данного вопроса как в условиях in vitro с использованием первичных культур астроцитов – важнейшего компонента нервной ткани [13], так и in vivo в модели фотоиндуцированной ишемии головного мозга.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В экспериментах использовали линию мышей с нокаутом гена β-аррестина-2 (группа β-аррестин-2^–/–) [14], любезно предоставленных Р.Р. Гайнетдиновым. В качестве контрольной группы использовали животных генетически родственной линии С57BL/6 с полноценной экспрессией данного белка (дикий тип). Все эксперименты выполнены согласно Директиве 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза.

Генотипирование животных. Нокаут гена β-аррестина-2 подтверждали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Геномную ДНК выделяли из лизатов фрагментов хвоста мышей обеих групп с использованием набора Extract DNA (Евроген, Россия). ПЦР проводили с использованием Taq-полимераз, стандартного набора реагентов (Thermo Scientific, США) и соответствующих праймеров. Далее продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия, в качестве маркеров использовали DNA ladder NL002 (Евроген, Россия), визуализацию проводили с помощью УФ-света в трансиллюминаторе.

У животных дикого типа в ходе ПЦР амплифицировался фрагмент, ограниченный двумя праймерами (прямым: 5'-GATCAAAGCCCTCGATGATC-3' и обратным: 5'-ACAGGGTCCACTTTGTCCA-3'), фланкирующими потенциальное место вставки генетической конструкции. Модификация целевого гена у животных с нокаутом, осуществленная методом гомологичной рекомбинации [14], привела к появлению в гене β-аррестина-2 последовательности донорской ДНК с фрагментом, комплементарным прямому праймеру 5'-GCTAAAGCGCATGCTCCAGA-3'. Таким образом, у мышей дикого типа и животных с нокаутом были амплифицированы фрагменты ДНК, ограниченные одним обратным и отличающимися прямыми праймерами, что привело к различиям в размерах ПЦР-продуктов. Фрагмент длиной 350 п.н. указывал на присутствие аллеля гена с нокаутом, фрагмент длиной 300 п.н. – на аллель дикого типа. В эксперимент отбирали животных, гомозиготных по аллелю гена с нокаутом.

Проведение вестерн-блотинга. Культуры астроцитов, полученных от мышей с нокаутом целевого гена и животных дикого типа, лизировали в буфере RIPA с добавлением ингибиторов протеаз (Sigma Aldrich, США). Вестерн-блотинг проводили по ранее описанной методике [15] (в одну лунку геля наносили 20 мкг белка). В качестве первичных антител использовали неконъюгированные антитела против β-аррестина-2 (1 : 1000; Abcam, Великобритания) и β-актина (1 : 1000; Abcam), в качестве вторичных – антитела против IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (1 : 3000; Santa Cruz Biotechnology, США). Присутствие целевых белков регистрировали посредством хемилюминесценции с помощью набора ECL (Thermo Scientific, США).

Культивирование астроцитов. В экспериментах in vitro использовали первичные культуры астроцитов, полученные из мозга новорожденных мышей возрастом от 0 до 3 дней по ранее описанному протоколу [15]. Далее клетки инкубировали в среде DMEM/F12 (Gibco, США), содержащей пируват, глутамин, пенициллин/стрептомицин и 10% эмбриональную телячью сыворотку (Invitrogen, США), в течение 10–12 дней при 37°С и 5% CO₂ в культуральных флаконах. За 4 дня до экспериментов астроциты пересевали на 48-луночные планшеты с плотностью 5 × 10⁴ клеток/лунка. Однородность культуры составляла более 90%, что подтверждено окрашиванием антителами к глиальному фибриллярному кислому белку (Abcam, Великобритания) – маркеру астроцитов. За 24 ч до эксперимента клетки переводили в среду с пониженной концентрацией сыворотки (до 2%), далее астроциты опытной группы подвергали воздействию тромбина в концентрациях 10, 50 и 100 нМ в течение 48 ч.

Оценка выживаемости клеток. Выживаемость клеток оценивали с помощью реагента WST-1 (Sigma Aldrich, США) – тетразолиевой соли, которая восстанавливается дегидрогеназами живых клеток до формазана, значительно поглощающего свет в видимой части спектра [15]. К культуре клеток добавляли WST-1 в соотношении 10 : 1 и инкубировали в течение 1 ч. Затем среду переносили в 96-луночный планшет, в котором производили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм. Результаты нормировали на соответствующие контрольные значения, принятые за 100%.

Фотоиндуцированная ишемия. В экспериментах использовали самцов мышей массой 25–28 г и возрастом 4–5 мес. Животных содержали в стандартных условиях (22°С, световой день – 12 ч) без ограничения доступа к воде и корму.

Ишемию индуцировали посредством фототромбоза [16] сенсомоторной области коры левого полушария (лазерный луч фокусировали на 2.2 мм латеральнее точки bregma [17]). Для анестезии использовали смесь коммерческих препаратов “Золетил100” (Virbac Sante Animale, Франция) и “Ксила” (Interchemie werken “De Adelaar” B.V., Нидерланды) в дозах 35 и 3.5 мг/кг (в/б) соответственно. В качестве фотосенсибилизатора использовали бенгальский розовый (Sigma Aldrich, США) в дозе 10 мг/кг, вводимый в/в посредством вживленного в яремную вену животного катетера. Тромбоз индуцировали с помощью лазерной установки (λ = 532 нм, диаметр светового пучка – 3 мм, Viacho, Китай) путем освещения поверхности черепа (освещенность – 50 лк) в течение 5 мин.

Оценка неврологического статуса. Сенсомоторный дефицит определяли с помощью теста “Решетка” [18]. До и через 24 ч после индукции фототромбоза животное помещали на поверхность решетки и с помощью видеорегистратора в течение 5 мин фиксировали число случаев свободного проскальзывания передней и задней контралатеральных поврежденному полушарию конечностей в ячейки (моторные ошибки). Для учета общей двигательной активности животного этот показатель для каждой из анализируемых конечностей нормировали на 100 шагов, сделанных задней ипсилатеральной лапой.

МРТ-метод. Прижизненную визуализацию ишемического очага выполняли методом магнитно-резонансной томографии (МРТ) с использованием 7 Tл научно-исследовательского томографа BioSpec 70/30 USR (Bruker, Германия) путем получения Т₂-взвешенных изображений.

Метод окрашивания хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия (ТТС). Оценку объема поражения головного мозга через 24 ч после вызванной ишемии проводили с помощью окрашивания секций мозга толщиной 1 мм 1% раствором ТТС (Sigma Aldrich, США) на фосфатно-солевом буфере по стандартной методике [19]. Площади ишемического очага, а также площади каждого полушария для дальнейшего вычисления объема поражения [20] измеряли с помощью программы ImageJ (NIH, США).

Статистическая обработка. Данные анализировали с помощью программы GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., США). Результаты представляли как среднее арифметическое ± стандартная ошибка, различия считали статистически значимыми при р < 0.05. Количество культур астроцитов для каждого воздействия составило не менее семи, число животных в экспериментах in vivo – восемь особей в группе. Используемые статистические критерии указаны отдельно под соответствующими рисунками. Нормальное распределение данных подтверждено критерием Шапиро–Уилка.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В настоящем исследовании для изучения роли белка β‑аррестина-2 в развитии цитотоксического действия тромбина мы использовали линию мышей с нокаутом гена β-аррестина-2. Согласно данным, полученным в ходе генотипирования животных методом ПЦР, у всех мышей группы β-аррестин-2^–/– имелся нокаут обоих аллелей целевого гена в отличие от животных дикого типа (рис. 2а). Результаты вестерн-блотинга полностью подтвердили отсутствие экспрессии β-аррестина-2 у животных с нокаутом (рис. 2б).

Рис. 2.

Подтверждение нокаута гена β-аррестина-2. а – Результаты ПЦР-анализа; б – результаты вестерн-блотинга.

Влияние нокаута гена β-аррестина-2 на выживаемость астроцитов в условиях действия тромбина. Для оценки влияния тромбина на выживаемость одного из основных компонентов глии – астроцитов в условиях in vitro мы выбрали подход, предполагающий использование первичных культур клеток мозга. Проведенные эксперименты показали, что тромбин во всех использованных концентрациях (10, 50 и 100 нМ) не влиял на относительное количество живых астроцитов животных дикого типа через 48 ч после добавления протеазы (рис. 3).

Рис. 3.

Влияние тромбина на выживаемость астроцитов, полученных от мышей дикого типа и с нокаутом гена β-аррестина-2 (двухфакторный дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони на множественное сравнение; * – р < 0.05, *** – р < 0.001 по сравнению с соответствующей контрольной группой).

В то же время мы выявили дозозависимый токсический эффект тромбина на астроциты, полученные из мозга мышей с нокаутом гена β-аррестина-2: протеаза вызывала значимое снижение относительного содержания живых клеток в культуре (рис. 3). Так, выживаемость астроцитов животных данной группы при действии на них тромбина в концентрации 10 нМ составила 86.1 ± ± 1.2% от контрольного значения, в концентрации 50 нМ – 77.2 ± 5.8%, а в концентрации 100 нМ – 76.7 ± 3.8%. Таким образом, нами показано, что токсическое действие тромбина зависит от наличия β-аррестина-2 в культивируемых астроцитах мыши.

Влияние нокаута гена β-аррестина-2 на выраженность вызванного фототромбозом поражения у мышей. Появление тромбина в ткани мозга in vivo может наблюдаться при повреждении сосудистой стенки, что сопровождается не только формированием тромба, но и повышением проницаемости ГЭБ [1, 2]. Эти события в полной мере наблюдаются в ходе поражения мозга в результате ишемического инсульта. По этой причине в следующей серии экспериментов для выяснения роли β-аррестина-2 в реализации повреждений нервной ткани, сопряженных с повышенными концентрациями тромбина, мы использовали модель фокальной фотоиндуцированной ишемии [16].

Последствия фототромбоза регистрировали через 24 ч после его индукции, так как известно, что к этому моменту очаг поражения достигает максимальных размеров на фоне существенного повреждения сосудистой стенки [21], значительно повышается проницаемость ГЭБ [22], активируются глиальные клетки [23], а также возрастает концентрация ряда провоспалительных цитокинов в нервной ткани [24]. Следовательно, именно в указанный период времени реализуется широкий спектр негативных эффектов ишемии, в развитие которых существенный вклад вносит тромбин [1, 2].

С помощью метода МРТ показано, что выбранная концентрация фотосенсибилизатора и координаты индукции очага ишемии позволяют локализовать повреждение исключительно в коре больших полушарий, преимущественно в ее сенсомоторной области передних и задних конечностей (рис. 4а).

Рис. 4.

Индуцированное фототромбозом повреждение головного мозга. а – Очаг поражения на МРТ-изображении (срез на уровне точки bregma: 1 – первичная моторная кора, 2 и 3 – соматосенсорная кора задних и передних конечностей соответственно [17]); б – объем поражения головного мозга у мышей дикого типа и с нокаутом по гену β-аррестина-2 через 24 ч после фототромбоза (t-тест для несвязанных выборок); в – изменение площади поражения мозга относительно точки bregma (тест Манна–Уитни для сравнения площади повреждения между двумя группами на каждом расстоянии); г – серия репрезентативных фотографий секций мозга, окрашенных ТТС (треугольником отмечен очаг поражения).

Средний объем поражения, измеренный методом ТТС-окрашивания через 24 ч после индукции ишемии, т.е. в острый период реализации ее негативных последствий, в группе β-аррестин-2^–/– составил 7.9 ± 0.9 мм³. Данный показатель статистически значимо не отличался от такового, подсчитанного у животных дикого типа и составившего 8.6 ± 0.7 мм³ (рис. 4б). В конфигурации очага поражения также не выявлено никаких изменений: средняя площадь повреждения была максимальной в области точки bregma и снижалась сходным образом в ростральном и каудальном направлениях у животных обеих групп (рис. 4в).

Повреждение мозга в результате ишемии характеризуется изменениями на уровне не только нервной ткани, но и всего организма, что приводит к появлению сенсомоторного дефицита у животных [18]. Так, с помощью сенсомоторного теста “Решетка” нами выявлен статистически значимый моторный дефицит и передних, и задних контралатеральных поврежденному полушарию конечностей. Данное нарушение развивалось в обеих экспериментальных группах через 24 ч после индукции ишемии (рис. 5а, 5б).

Рис. 5.

Результаты сенсомоторного теста “Решетка” до и через 24 ч после индукции фототромбоза у животных дикого типа и с нокаутом гена β-аррестина-2: а – Передняя контралатеральная конечность; б – задняя контралатеральная конечность (двухфакторный дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони на множественное сравнение; * – р < 0.05 по сравнению со значениями до тромбоза).

У животных дикого типа количество моторных ошибок на 100 шагов для передней и задней контралатеральных конечностей до фототромбоза составило 2.1 ± 0.6 и 0.5 ± 0.4 соответственно, после фототромбоза – 24.4 ± 4.9 и 7.2 ± 1.6. В группе β-аррестин-2^–/– аналогичные показатели составляли 1.9 ± 0.7 и 1.7 ± 0.8 до индукции ишемии и 24.2 ± 4.7 и 8.7 ± 2.9 – после. Однако не отмечено статистически значимых различий в проявлении сенсомоторного дефицита между двумя группами животных. Из представленных данных следует, что в экспериментах in vivo не выявлено значимого влияния нокаута гена β-аррестина-2 на выраженность вызванных фототромбозом нарушений у мышей.

ОБСУЖДЕНИЕ

Сериновая протеаза тромбин – полифункциональный белок, участвующий не только в свертывании крови, но и в регуляции широкого спектра функций клеток. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о зависимости эффектов тромбина как от его концентрации, так и от длительности воздействия и состояния клеток [1–3, 7, 8, 15]. Показано, что тромбин в высокой концентрации (нМ) повышает пролиферацию культивируемых астроцитов, активирует индуцибельную NO-синтазу, усиливает секрецию провоспалительных цитокинов и вызывает клеточную гибель [1, 15]. В то же время в низкой концентрации (пМ) тромбин способствует усилению синтеза белков теплового шока и запускает цитопротекторные каскады, активируя ПАР1 [1], экспонированный, как и другие типы ПАР, на мембранах астроцитов [25].

Ранее с использованием культур астроцитов крысы показано дозозависимое усиление клеточной пролиферации через 3 и 24 ч после добавления в культуральную среду тромбина [15, 25]. Однако в настоящем исследовании он не вызывал изменения относительного числа живых астроцитов мышей дикого типа даже в максимальной из использованных концентраций (100 нМ) через 48 ч после воздействия. Возможно, запуск пролиферации может быть краткосрочным ответом на тромбин, тогда как в дальнейшем запускается процесс клеточной гибели за счет индуцированной протеазой провоспалительной активации клеток. Это приводит к компенсации краткосрочного ответа и, как следствие, к отсутствию изменений количества клеток через 48 ч.

Статистически значимое снижение выживаемости астроцитов, полученных от животных группы β-аррестин-2^–/–, может свидетельствовать о нарушении процесса десенситизации и интернализации ПАР1 из-за отсутствия β-аррестина-2. Следовательно, в результате невозможности ограничения ПАР1-опосредованного сигнала усиливается развитие токсического действия тромбина.

Помимо этого, тромбин в комплексе с тромбомодулином может способствовать генерации АПС. В наших экспериментах нельзя исключить возможность нивелирования токсичности тромбина в культуре астроцитов животных дикого типа за счет АПС, который реализует свои защитные эффекты по механизму, зависимому от β-аррестина-2 [3, 8]. В то же время реализацию цитопротекторных эффектов АПС в культуре астроцитов мышей с нокаутом целевого гена затрудняет отсутствие β-аррестина-2, что способствует усилению некомпенсированной токсичности тромбина.

Развитие ишемии головного мозга приводит к росту концентрации тромбина в нервной ткани за счет запуска системы гемостаза на фоне сниженных барьерных свойств ГЭБ [1, 26, 27]. Ранее было показано, что ингибиторы тромбина улучшают исход фотоиндуцированной ишемии [27], что подтверждает важную роль данной сериновой протеазы в повреждении мозга при тромбообразовании.

Настоящее исследование не выявило вклада адаптерного белка β-аррестина-2 в развитие нарушений, индуцированных фототромбозом: не обнаружено различий между двумя группами животных ни на уровне сенсомоторных реакций, ни в объеме ишемического поражения мозга. Данный факт может быть связан с вовлечением в ответ на ишемическое повреждение не только астроцитов, но и других компонентов нейроваскулярной единицы, где, возможно, ключевое значение имеет β-аррестин-1.

Более того, in vivo возможна реализация всех эффектов тромбина: и провоспалительных посредством активации G-белков, и защитных, связанных с активацией системы АПС. Также возможен показанный на культуре эндотелиоцитов непосредственный запуск протеазой β-аррестиновых сигнальных путей. В связи с этим направленность действия тромбина в высоких концентрациях на уровне всего организма будет определяться соотношением его отдельных эффектов, а также особенностями β-аррестиновой сигнализации в каждом из типов клеток мозга.

Таким образом, в настоящей работе впервые показана необходимость β‑аррестина-2 для выживания культивируемых астроцитов мыши при токсическом действии тромбина. В то же время требуются дальнейшие исследования, проводимые на уровне ЦНС в целом, для уточнения ключевых мишеней данной протеазы в каждом из клеточных компонентов нервной ткани и роли β-аррестиновой сигнализации.

Коллектив авторов выражает благодарность Д.А. Горбачеву (Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) и В.С. Вьюшкову (МГУ имени М.В. Ломоносова) за помощь в генотипировании животных и интерпретации полученных данных.

Работа поддержана грантом РФФИ № 18-34-00977.