Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2020, T. 37, № 2, стр. 103-109

ВВЕДЕНИЕ

Онкологические заболевания представляют одну из основных проблем современной медицины, в решении которой важное значение имеет поиск новых подходов к терапии опухолей. С этой целью необходимо изучение комбинированного действия уже известных препаратов и поиск новых, более эффективных, что позволит повысить выживаемость больных и замедлить развитие злокачественных опухолей. Мелатонин (МЕЛ, N-ацетил-5-метокситриптамин) – гормон, секретируемый шишковидной железой и другими тканями, обладает сходством с производными биогенного амина серотонина, синтезируемого из триптофана [1, 2]. Изучение МЕЛ и его влияния на организм человека показало, что МЕЛ обладает онкостатическими, антиоксидантными и иммунорегуляторными свойствами, поэтому он может рассматриваться как противоопухолевый агент. МЕЛ применяют в комбинированной терапии опухолей. Аномальные уровни МЕЛ у онкологических больных указывают на его участие в онкогенезе [3, 4]. Сообщается о значительных противоопухолевых эффектах МЕЛ в различных типах опухолевых клеток [5].

Цитарабин (ЦИТ) – противоопухолевый препарат на основе пиримидинового нуклеозида и арабинозы, широко используется в терапии лейкозов. ЦИТ применяется преимущественно при остром промиелоцитарном лейкозе (ОПЛ), неходжкинской лимфоме (НХЛ) и хроническом миелоцитарном лейкозе [6, 7]. ЦИТ можно использовать самостоятельно или в сочетании с другими противоопухолевыми агентами, такими как даунорубицин, доксорубицин, тиогуанин или винкристин.

ЦИТ действует на быстро делящиеся клетки и ингибирует синтез ДНК в S-фазе клеточного цикла, а также препятствует переходу клеток из G1-фазы в S-фазу. Точный механизм действия цитарабинтрифосфата не выяснен, но он, по-видимому, ингибирует ДНК-полимеразу, конкурируя с дезоксицитидинтрифосфатом [8]. Помимо противоопухолевой активности ЦИТ обладает и токсическим побочным действием.

Формирование неспецифичекой поры (mitochondrial permeability transition pore, мPTP) и увеличение проницаемости внутренней мембраны митохондрий происходит в процессе ответа на окислительный стресс и перегрузку митохондриального матрикса кальцием. Регуляторами/модуляторами мPTP являются потенциал-зависимый анионный канал (VDAC), транслоказа адениновых нуклеотидов, белок-транслокатор (translocator protein, TSPO) и другие белки. VDAC представляет собой белок 32 кДа, у человека представленный тремя изоформами (VDAC1, VDAC2, VDAC3). Наиболее распространена изоформа VDAC1 [9]. Взаимодействие VDAC с про- и антиапоптотическими белками наружной митохондриальной мембраны могут как способствовать гибели клеток, так и предотвращать ее. Таким образом, митохондриальный VDAC может быть перспективной терапевтической мишенью при различных типах опухолей. TSPO является не только партнером, но и модулятором VDAC [10]. Кроме того, некоторые исследователи считают, что TSPO играет ключевую роль в росте опухолевых клеток [11–13]. Показано также, что экспрессия TSPO увеличивается в опухолях разного типа, включая опухоли головного мозга и глиому. Установлено, что TSPO участвует в клеточной пролиферации и регуляции апоптоза в некоторых типах опухолевых клеток [13–15]. TSPO, локализованный рядом с VDAC, образует прочный комплекс с данным белком, регулируя тем самым проницаемость VDAC и функции митохондрий [16]. Ранее мы показали, что МЕЛ (1 мкМ) совместно с транс-ретиноевой кислотой (ATRA, 10 нМ) увеличивает ее цитотоксичность в отношении клеток HL-60 и подавляет экспрессию антиапоптотического белка Bcl-2, а также VDAC1 и TSPO [17].

В настоящей работе мы исследовали совместное действие МЕЛ (1 мМ) и ЦИТ в низкой концентрации (2 нМ) на пролиферативную активность клеток ОПЛ, используя в качестве модели клетки HL-60, и анализировали изменение уровня таких митохондриальных белков, как Bcl-2, VDAC1 и TSPO.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток. Клетки ОПЛ человека HL-60 (CCL-240) получены из ATCC (Manassas, VA, США). Клетки выращивали в среде RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 20% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Grand Island, NY, США) и 40 мкг/мл сульфата гентамицина (Sigma-Aldrich, США) при 37°C, 95% влажности и 5% CO₂. Удвоение культуры клеток наблюдали приблизительно через 24 ч.

Анализ жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью ресазурина. Клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью 5 × 10³ клеток на лунку. Через 24 ч клетки обрабатывали МЕЛ и ЦИТ в указанных дозах. Через 24 ч после обработки в каждую лунку добавляли ресазурин (Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 100 мкг/мл, клетки инкубировали в течение 4 ч при 37°C. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов Infinite F200 (Tecan, Grodig, Австрия) при длине волны возбуждения 535 нм и длине волны излучения 595 нм. Данные представлены как процент от контроля (необработанные образцы клеток).

Определение митотического индекса. Митотическую активность определяли следующим образом: клетки, инкубированные в течение 96 ч в различных условиях, центрифугировали (250 g, 10 мин), ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и фиксировали 70% этанолом (30 мин, при комнатной температуре). Затем фиксированные клетки окрашивали бисбензимидом H33342 (Sigma-Aldrich, США) и рассчитывали число митотических клеток, используя флуоресцентный микроскоп DM 6000 (Leica, Германия). Митотический индекс (MI) определяли по формуле MI = = (P + M + A + T)/N, где P + M + A + T – сумма всех клеток в фазах: профазы, метафазы, анафазы и телофазы соответственно, и N – общее количество клеток.

Анализ роста клеток. Рост клеток оценивали путем подсчета клеток в разные моменты времени после обработки. Клетки собирали центрифугированием в течение 10 мин при 250 g и промывали PBS. Затем клетки окрашивали 0.4% трипановым синим (Sigma-Aldrich, США) для оценки количества и жизнеспособности клеток. В каждом эксперименте подсчитывали по три образца на группу. Эксперименты выполняли не менее чем в трех повторах.

Электрофорез и Вестерн-блот-анализ. Клетки HL-60 (2 × 10⁵ клеток/мл), обработанные МЕЛ и/или ЦИТ, собирали, дважды промывали охлажденным PBS и лизировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 мМ EDTA, 1 мМ Na₃VO₄ и 1 мМ NaF) с добавлением ингибиторов протеиназы/фосфатазы. Экстракты инкубировали на льду в течение 30 мин и затем центрифугировали при 13 000 g в течение 20 мин при 4°С. Супернатанты собирали и количественно определяли концентрацию белка с использованием метода Брэдфорда. Затем супернатанты солюбилизировали с помощью буфера для образцов 4× Laemmli (Bio-Rad, США). Для определения уровня митохондриальных белков образцы нагревали до 95°С в течение 5 мин и наносили на гель. Образцы белка разделяли с помощью 12.5% денатурирующего гель-электрофореза (SDS-PAGE) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану при 300 мА в течение 1 ч. Мембрану блокировали в растворе Roti-block (ROTH, Германия) в течение 1 ч при комнатной температуре, затем инкубировали с первичными антителами при 4°С в течение ночи, а затем с вторичными антителами, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). Поликлональные антитела к TSPO и VDAC1 получены от Abcam (Великобритания), моноклональные антитела к Bcl-2 были из Santa Cruz, США. Антитела к α-тубулину (Cell Signaling, Danvers, MA, США) использовали в качестве контроля белковой нагрузки. Пероксидазную активность определяли хемилюминесцентными реагентами (Bio-Rad, США). Количественный анализ интенсивности белковых полос проводили с помощью денситометриии (программа Image Lab, Bio Rad, США).

Статистический анализ. Все данные представлены как среднее значение ±SD. Статистическая значимость подтверждена t-тестом Стьюдента с использованием программного обеспечения Sigma plot (Systat Software Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ЦИТ как сам по себе, так и в сочетании с другими противоопухолевыми препаратами широко используется в терапии лейкозов и солидных опухолей [18]. Комбинации препаратов, обладающие синергическим эффектом, обычно улучшают результаты терапии [19]. Понимание механизма действия и метаболизма ЦИТ позволило преодолеть его низкую биодоступность и повысить стабильность, однако негативные эффекты препарата ЦИТ и его токсичность по-прежнему представляют проблему для его применения. Известно, что МЕЛ оказывает благоприятное воздействие, снижает рост и прогрессию клеток рака печени и поджелудочной железы [20, 21]. В настоящей работе изучено совместное действие МЕЛ и ЦИТ в концентрации, ниже используемой в медицинской практике, на пролиферативную активность клеток HL-60 и изменение экспрессии митохондриальных белков, таких как Bcl-2, VDAC1 и TSPO. Сначала было проанализировано действие различных концентраций МЕЛ и ЦИТ на клетки линии HL-60. ОПЛ клетки обрабатывали МЕЛ в течение 96 ч в различных концентрациях (10^–3, 3.3 × 10^–4, 1.1 × 10^–4, 4 × 10^–5, 10^–5, 4.1 × 10^–6, 1.4 × × 10^–5, 5 × 10^–6, 2 × 10^–6 М) и ЦИТ (4.4 × 10^–6, 1.5 × 10^–6, 0.5 × 10^–6, 5.4 × 10^–10, 1.8 × 10^–10, 6 × 10^–10, 2 × 10^–10, 7 × 10^–11 M). Нами была выбрана максимальная нетоксичная концентрация ЦИТ – 2 нМ и рабочая концентрация МЕЛ, равная 1 мМ.

Рис. 1.

Химическая структура мелатонина (МЕЛ, а) и цитарабина (ЦИТ, б). в, г – Концентрационная зависимость цитотоксических эффектов МЕЛ (в) и ЦИТ (г). Клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью 5 × 10³ клеток на лунку и обрабатывали МЕЛ и ЦИТ в указанных концентрациях в течение 96 ч. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), вычисленного по результатам 10 отдельных экспериментов.

Затем мы оценили пролиферативную активность клеток HL-60, обработанных ЦИТ и МЕЛ в течение 96 ч (рис. 2). Рисунок 2а показывает прирост клеток в различных условиях относительно контроля. Видно, что количество клеток, обработанных МЕЛ и ЦИТ, снижалось на 50 и 20%, соответственно, по сравнению с контролем (100%). Таким образом, МЕЛ (1 мМ) и ЦИТ в низкой концентрации (2 нМ) оказывают цитостатическое действие на клетки ОПЛ и не влияют на их жизнеспособность. Совместное действие МЕЛ и ЦИТ привело к снижению количества клеток на 70% по сравнению с контролем. При совместном применении МЕЛ значительно усиливал действие ЦИТ.

Рис. 2.

Совместное влияние МЕЛ и ЦИТ на пролиферацию клеток HL-60. Клетки высевали на чашку с плотностью 200 × 10³ клеток и обрабатывали МЕЛ и ЦИТ. Контроль (колонка 1), ЦИТ (колонка 2), МЕЛ (колонка 3), ЦИТ и МЕЛ (колонка 4). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), вычисленного по результатам 10 отдельных экспериментов. *р < 0.05 – достоверное отличие от контрольной величины. ^#р < 0.05 – достоверное отличие от величины, полученной при обработке только МЕЛ.

Мерой статуса пролиферации клеточной популяции является митотический индекс (МИ), который определяется как отношение количества клеток в фазе митоза к общему количеству клеток. Нами проанализирован МИ клеток в различных условиях. На рис. 2б показано, как влияют МЕЛ и ЦИТ на митотическую активность клеток HL-60. Таким образом, показано, что действие МЕЛ и ЦИТ способствует снижению МИ на ~50 и 25% соответственно. При совместном действии этих веществ МИ снижался на 64% по сравнению с контролем (необработанные клетки) и на 50% по сравнению с МИ при действии только ЦИТ. Эти результаты показывают, что МЕЛ может усиливать противоопухолевое действие ЦИТ в клетках HL-60.

Ранее Кинтана и его соавт. сообщали, что МЕЛ модулирует индукцию апоптоза в клетках лейкоза человека (U937), подвергнутых воздействию гипертермии [22]. Нами определено изменение уровня белка Bcl-2 в наших экспериментальных условиях. На верхней панели рис. 3 приведены Вестерн-блоты Bcl-2 в лизированных клетках ОПЛ (HL-60), обработанных МЕЛ, ЦИТ и МЕЛ + ЦИТ. Количественное изменение уровня белка Bcl-2 показано на рис. 3 (нижняя панель). Количественное соотношение белковых полос оценивали после нормирования белка по α-тубулину. Уровень белка Bcl-2 в клетках HL-60 в присутствии ЦИТ был в 2 раза выше, чем в контрольных условиях. МЕЛ способствовал снижению уровня Bcl-2 на ~45%. Аналогичный результат получен при действии МЕЛ + ЦИТ (снижение Bcl-2 на ~40%). Интересно, что совместное действие МЕЛ и ЦИТ способствовало снижению повышенного уровня Bcl-2, которое наблюдалось в присутствии только ЦИТ. Возможно, снижение уровня Bcl-2 под действием МЕЛ + ЦИТ снижает клеточный ответ на ЦИТ, активируя тем самым запуск сигнального каскада апоптоза.

Рис. 3.

Комбинированное действие МЕЛ и ЦИТ на уровень белка Bcl-2 в клетках HL-60. Клетки высевали на чашки с плотностью 5 × 10⁵ и обрабатывали МЕЛ (столбец 2), ЦИТ (столбец 3), совместное действие МЕЛ и ЦИТ (столбец 4), контрольные необработанные клетки (столбец 1). Иммунодетекцию α-тубулина использовали в качестве контроля нагрузки. Верхняя часть – иммуноокрашивание Bcl-2 и α-тубулина. Нижняя часть – диаграмма количественного определения иммуноокрашивания с использованием компьютерной денситометрии. Гистограммы представляют уровни белков в относительных единицах. Уровень белка в клеточном лизате без каких-либо добавок принят за единицу и служит контролем. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), вычисленного по результатам 5 отдельных экспериментов, * р < 0.05.

Молекулярные взаимодействия VDAC с про- и антиапоптотическими белками наружной митохондриальной мембраны являются многогранными, и они могут как способствовать, так и предотвращать гибель клеток. Митохондриальный VDAC – основной компонент, который можно рассматривать как перспективную мишень для противоопухолевой терапии. Поскольку сообщается, что VDAC инициирует апоптотические сигнальные каскады [23], и VDAC1 используется как противоопухолевая мишень [24], мы определяли содержание VDAC1 в наших экспериментальных условиях (рис. 4а). В клетках, обработанных ЦИТ, уровень VDAC1 повышался на ~70%. Анализ результатов действия МЕЛ и МЕЛ + ЦИТ показал снижение уровня VDAC1 на ~30 и ~35%, соответственно, что указывает на изменения в регуляции метаболических и энергетических функций митохондрий и дальнейшей выживаемости опухолевых клеток. Как сказано ранее, VDAC в митохондриях может образовывать прочный комплекс с TSPO. Таким образом, TSPO может влиять на проницаемость образованных VDAC каналов и модулировать функции митохондрий. Также известно, что экспрессия TSPO возрастает в различных опухолях, включая опухоли головного мозга и глиому [25–27]. Учитывая сказанное, мы оценили изменение уровня TSPO в наших экспериментальных условиях. На рис. 4б показано, что в присутствии ЦИТ уровень и TSPO, и VDAC1 повышался на ~70%. МЕЛ, напротив, снижал уровень исследуемых белков на ~20%. В случае применения МЕЛ + ЦИТ МЕЛ компенсировал повышение уровня TSPO, вызванное ЦИТ. Следовательно, можно предположить, что МЕЛ способствует снижению экспрессии TSPO в условиях совместного действия с ЦИТ и может вызывать снижение онкогенности.

Рис. 4.

Комбинированное влияние МЕЛ и ЦИТ на уровень TSPO и VDAC1 в клетках HL-60. Клетки высевали на чашки с плотностью 5 × 10⁵ и обрабатывали МЕЛ (столбец 2), ЦИТ (столбец 3), совместное действие МЕЛ и ЦИТ (столбец 4), контрольные необработанные клетки (столбец 1). Иммунодетекция α-тубулина использована в качестве контроля нагрузки. а – Иммуноокрашивание (верхняя часть) и количественное определение (нижняя часть) уровня белка VDAC1. б – TSPO. На гистограммах представлены уровни соответствующих белков в относительных единицах. Уровень белка в клеточном лизате без каких-либо добавок принят за единицу и служит контролем. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), вычисленного по результатам 5 отдельных экспериментов, * р < 0.05.

Таким образом, МЕЛ увеличивал цитостатическое действие ЦИТ в клетках HL-60 и подавлял экспрессию антиапоптотического белка Bcl-2. Применение МЕЛ способствует усилению действия низкой концентрации ЦИТ, приводя к значительным изменениям пролиферативной и митотической активности клеток HL-60, модели ОПЛ. Экспрессия VDAC1 и TSPO в этих условиях снижалась. В целом, наши результаты показывают, что МЕЛ способен усиливать действие других химиотерапевтических агентов и может использоваться в новых стратегиях терапии рака.

Работа поддержана грантом РФФИ № 17-04-00747.