Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2021, T. 38, № 5, стр. 388-392

ВВЕДЕНИЕ

Аминергические GPCR-рецепторы составляют группу гептаспиральных трансмембранных рецепторов (G-protein coupled receptor, GPCR-рецептор), активируемых биогенными аминами, включая адреналин, гистамин, дофамин и серотонин. Из структурных соображений в подсемейство аминергических GPCR-рецепторов также включены мускариновые рецепторы ацетилхолина [1]. Аминергические GPCR-рецепторы широко представлены в клетках различных типов и регулируют самые разнообразные физиологические процессы от передачи нервного возбуждения и сокращения мышечных волокон до пролиферации и дифференцировки клеток. Участие этих рецепторов в физиологических процессах обусловлено их сопряжением с различными внутриклеточными сигнальными системами, в частности с кальциевой (Ca²⁺) [2–4]. Все больше фактов указывают на то, что агонист-индуцированная Ca²⁺-сигнализация регулируется в том числе при участии фосфатидилинозитол-3-киназ класса I (PI3-киназ) – ферментов, катализирующих образование фосфолипида фосфатидилинозитол-3,4,5-триcфосфата (PIP3), который, в свою очередь, координирует локализацию и активность многих сигнальных белков [5, 6]. В некоторых работах показано, что ингибиторы PI3-киназ связываются с рядом внутриклеточных белков, не относящихся к семейству PI3-киназ [7, 8]. Ранее нами было продемонстрировано, что ингибитор PI3-киназы LY294002 и его неактивный аналог LY303511 подавляют внутриклеточные Ca²⁺-сигналы, инициируемые такими аминергическими агонистами, как ацетилхолин, гистамин и серотонин. Полученные данные свидетельствовали о том, что LY294002 и LY303511 влияли на Са²⁺-сигнализацию, инициируемую данными агонистами, независимым от PI3-киназ образом, скорее всего воздействуя на аминергические рецепторы напрямую [9]. Оставалось неясным, являются ли соединения LY294002 и LY303511 уникальными в этом отношении, или другие ингибиторы PI3-киназы также могут оказывать антагонистическое действие на аминергические рецепторы. В данной работе исследовали эффекты ингибитора PI3-киназы PI828 на Ca²⁺-сигналы, вызываемые агонистами аминергических рецепторов, в клетках различных линий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование и трансфекция клеток. В работе использовали клетки почки эмбриона человека линии HEK 293, клетки глиомы мозга крысы линии С6 и клетки яичника китайского хомячка ранее полученной нами моноклональной линии CHO/5-HT2C, экспрессирующие рекомбинантный серотониновый рецептор 5-HT2C. Клетки используемых линий культивировали во влажной атмосфере c 5% CO₂ в воздухе при 37°C. Клетки линии НЕК 293 культивировали в среде DMEM (Gibco), содержащей 4.5 г/л глюкозы, 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), 100 мг/мл гентамицина (Sigma), 2 мМ глутамина (Sigma). Клетки линий С6 и CHO/5-HT2C культивировали в среде F12 (Gibco), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), 100 мг/мл гентамицина (Sigma), 2мМ глутамина (Sigma). Клетки всех используемых линий трансфицировали плазмидным вектором CMV-R-GECO1 (Addgene) с целью индукции экспрессии R-GECO1 – генетически кодируемого сенсора цитозольного Са²⁺. Для трансфекциии использовали набор для липофекции Lipofectamine 3000 (Invitrogen) по оптимизированному согласно рекомендациям производителя протоколу. Для физиологических экспериментов использовали клетки через 24–48 ч после трансфекции.

Мониторинг внутриклеточного Ca²⁺ в одиночных клетках. Клетки прикрепляли ко дну фотометрической камеры с помощью адгезивного материала Cell Tak (Corning) и выдерживали при комнатной температуре 30 мин. Внеклеточный раствор содержал (мМ): 130 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES, pH 7.4, 10 глюкозы. Фотометрические эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Zeiss), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20×/0.75 и цифровой EMCCD камерой LucaR (Andor Technology). Флуоресценцию клеток возбуждали на длине волны 572 ± 17.5 нм, эмиссию регистрировали в области 634 ± 34 нм, что соответствует спектральным характеристикам R-GECO1. Изменение концентрации Са²⁺ в цитоплазме оценивали по относительному изменению интенсивности флуоресценции R-GECO1 ΔF/F₀, где ΔF = F – F₀, F и F₀ – интенсивность эмиссии Са²⁺-индикатора в текущий момент времени и в начале регистрации, соответственно. Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли с использованием программы NIS Elements (Nikon). Полученные экспериментальные данные обрабатывали с помощью программы Sigma Plot 12.5 (Systat Software).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для анализа влияния PI828 на Ca²⁺-сигналы, инициированные ацетилхолином и гистамином, использовали клетки, эндогенно экспрессирующие мускариновые или гистаминовые GPCR-рецепторы, а именно, клетки почки эмбриона человека HEK293 и клетки глиомы мозга крысы С6 соответственно. Кратковременная стимуляция соответствующих клеток ацетилхолином (1 мкМ) или гистамином (2 мкМ) инициировала в них Ca²⁺-ответы, которые полностью подавлялись в присутствии PI828 в концентрации 10–30 мкМ (рис. 1а, 1б). Для исследования влияния PI828 на серотонин-индуцированную Са²⁺-сигнализацию использовали моноклональную линию клеток яичника китайского хомячка CHO/5-HT2C, полученную нами ранее путем трансфекциии клеток CHO плазмидным вектором, несущим кДНК серотонинового рецептора 5-HT2C. Как и в случае Са²⁺-ответов на ацетилхолин и гистамин (рис. 1а, 1б), PI828 в концентрации 3 мкМ обратимо блокировал Ca²⁺-ответы клеток CHO/5-HT2C на серотонин (1 нМ) (рис. 1в).

Рис. 1.

PI828 ингибирует Ca²⁺-ответы клеток различных линий на аминергические агонисты. а–в – Репрезентативные регистрации Ca²⁺-ответов одиночных клеток на агонисты аминергических рецепторов и ATP в контроле и в присутствии PI828. Здесь и далее моменты и продолжительность аппликаций веществ обозначены горизонтальными линиями выше экспериментальной кривой. Изменение внутриклеточного Ca²⁺ характеризовали относительной флуоресценцией R-GECO1 ΔF/F₀, где ΔF = F – F₀, F и F₀ – текущая интенсивность эмиссии индикатора и его эмиссия в начале регистрации соответственно. а – Ответы клетки HEK293 на ацетилхолин (АСh) (1 мкМ) и АТР (5 мкМ) (n = 147); б – ответы клетки С6 на гистамин (Hist) (2 мкМ) и АТР (5 мкМ) (n = 53); в – ответы клетки CHO/5-HT2C на серотонин (Ser) (1 нМ) и АТР (5 мкМ) (n = 108).

Формально, полученные результаты можно рассматривать как свидетельство участия PI3-киназы в генерации Ca²⁺-ответов на перечисленные агонисты аминергических рецепторов. Между тем ингибитор PI3-киназы другой химической природы вортманнин (wortmannin) (1–10 мкМ) не влиял на способность клеток генерировать Ca²⁺-ответы на те же агонисты (рис. 2). Поскольку вортманнин и PI828 вызывали различные физиологические эффекты, можно было думать, что эти соединения действовали на разные клеточные мишени. Иными словами, нечувствительность клеточных ответов к вортманнину указывала на то, что эффекты PI828, скорее всего, не были специфическими, т.е. не были опосредованы ингибированием PI3-киназы. В пользу такой точки зрения также свидетельствовал тот факт, что PI828 способен связываться не только с PI3-киназой, но и с рядом других внутриклеточных белков [7]. Кроме того, PI828 является структурным аналогом LY294002 – другого ингибитора PI3-киназы, который может влиять на Ca²⁺-сигнализацию независимым от PI3-киназы образом [9, 10]. Отметим в качестве дополнительного аргумента, что вортманнин ингибирует PI3-киназу необратимым образом [11], и поэтому способность PI828, апплицированного после вортманнина, ингибировать клеточные ответы (рис. 2) также не могла быть связана с его действием на PI3-киназу. Важно также отметить, что ингибирование Ca²⁺-ответов наблюдалось при аппликации PI828 одновременно с исследуемым агонистом (рис. 1, 2), хотя обычно ингибирование внутриклеточных мишеней в интактных клетках требует времени для проникновения ингибитора через плазматическую мембрану. При этом Са²⁺-ответы этих же клеток на агонист пуринергических рецепторов ATP (5 мкМ) не изменялись в присутствии PI828 даже в случае предынкубации с ним (рис. 1). Совокупность перечисленных особенностей феноменологии действия PI828 на Са²⁺-ответы, вызванные использованными в работе аминергическими агонистами, позволяет думать, что их подавление в данном случае вызвано не ингибированием PI3-киназы, а ранее не описанным экстраклеточным действием этого соединения.

Рис. 2.

Ca²⁺-ответы клеток различных линий на агонисты аминергических рецепторов в различных условиях. Репрезентативные регистрации Ca²⁺-ответов клетки HEK293 на 1 мкМ АСh (n = 54) (а), клетки глиомы С6 на 3 мкМ Hist (n = 27) (б) и клетки CHO/5-HT2C на 1 нМ Ser (n = 76) (в) в контроле и в присутствии вортманнина (Wortm) (10 мкМ) и PI828 (30 мкМ).

Таким образом, в данной работе нами показано, что ингибитор PI3-киназы PI828 блокирует мобилизацию внутриклеточного Ca²⁺, вызванную активацией мускариновых и гистаминовых рецепторов, и серотонинового рецептора 5-HT2C. Суммируя результаты, полученные при изучении Са²⁺-ответов клеток трех различных линий, можно утверждать, что эффект данного соединения не был связан с ингибированием PI3-киназы, а, скорее всего, был обусловлен его прямым действием на перечисленные аминергические GPCR-рецепторы, как и в случае соединений LY294002 и LY303511 [9]. Для подтверждения возможности связывания PI828 с различными аминергическими рецепторами в дальнейшем мы планируем использовать методы молекулярной динамики.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 19-75-10 068 в части получения клеточных линий с экспрессией генетически-кодируемых сенсоров и проекта № 20-74-00056 в части физиологических экспериментов.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.