Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2021, T. 38, № 5, стр. 363-373

ВВЕДЕНИЕ

Танициты, локализующиеся в области дна третьего желудочка, представляют собой особую популяцию глиальных клеток. Тела этих клеток формируют выстилку инфундибулярного углубления, а базальные отростки проникают в нервную ткань и оканчиваются на кровеносных сосудах, оплетая их своими расширенными терминалями. Отростки таницитов оплетают, в том числе, фенестрированные капилляры портальной системы гипофиза, которая локализуется в срединном возвышении. Таким образом, эти клетки задействованы в формировании ликворо-энцефалического и гематоликворного барьеров. Ранее была показана их роль в регуляции работы подлежащих ядер гипоталамуса – вентромедиального и аркуатного ядер, отвечающих за энергетический баланс организма. Кроме того, будучи производными клеток радиальной глии, танициты сохраняют не только их морфологию и ряд цитохимических характеристик, но также и способность к пролиферации и дифференцировке в нейроны и глию. Выделяют 4 типа таницитов (α1-, α2-, β1- и β2-танициты), различающихся локализацией в пределах инфундибулярного углубления, а также структурными, цитохимическими и функциональными характеристиками [1, 2]. Тем не менее, несмотря на пристальный интерес исследователей к таницитам, такая важная клеточная характеристика, как структурно-функциональная организация ядра в этих клетках, до настоящего момента остается не изученной. При исследовании организации клеточного ядра особое внимание уделяют распределению гетерохроматиновых скоплений и морфологии ядрышка, поскольку эти субъядерные структуры отражают метаболический статус клетки и чувствительны к дегенеративным изменениям.

Одним из важных маркеров, отражающих функциональное состояние клетки, является ядрышко. Поскольку основная функция этой структуры – это участие в биогенезе рибосом, то уровень белкового синтеза в клетке коррелирует с организацией ядрышка. Кроме того, было установлено, что белки ядрышка вовлечены в контроль клеточного цикла, апоптоза и старения, а дислокация этих белков из ядрышка (так называемый “нуклеолярный стресс”) может опосредовать развитие нейродегенеравтивных процессов [3–5]. Другой характеристикой, отражающей клеточную активность, является наличие гетерохроматиновых агрегатов. Гистон H4, триметилированный по лизину 20 (H4K20me3), формирует конститутивный гетерохроматин и участвует в репрессии генов в промоторных участках [6, 7]. Также H4K20me3 важен в подавлении транскрипции повторяющейся ДНК и транспозонов [8]. Было показано, что подавление экспрессии этого гистона приводит к развитию злокачественных образований [9]. Изучение возможных изменений в организации ядрышка и гетерохроматиновых агрегатов в ходе постнатального онтогенеза и при старении, поможет получить новые сведения о функциональном состоянии таницитов в ходе нормального развития.

Цель данного исследования состояла в изучении структурно-функциональной организации ядрышка и конститутивного гетерохроматина в различных типах таницитов в ходе постнатального развития и при старении.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужили фрагменты промежуточного мозга крыс-самцов линии Вистар пяти возрастных групп: 7, 14, 30 сутки постнатального развития (n = 3 для каждого срока), взрослые животные (4–5 мес.) (n = 6), старые животные (20–24 мес.) (n = 3). При содержании и умерщвлении животных соблюдали международные правила Хельсинской декларации о гуманном обращении с животными и “Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных” (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Головной мозг был фиксирован в цинк-этанол-формальдегиде [10], обезвожен и залит в парафин обычным способом. Изготавливались фронтальные срезы толщиной 5 мкм на уровне от –3.24 до –4.44 мм по отношению к брегме [11]. После стандартной процедуры депарафинирования срезы подвергали тепловому демаскированию в модифицированном цитратном буфере S1700, pH 6.1 (Dako, Дания) в течение 23 мин в пароварке. Затем были поставлены двойные иммуногистохимические реакции с использованием мышиных моноклональных антител к виментину (клон V-9, Dako) в разведении 1 : 100, кроличьих поликлональных антител к нуклеолину/белку C23 (Abcam, Великобритания) в разведении 1:200, мышиных моноклональных антител к нуклеофосмину/белку B23 (клон FC82291, Sigma-Aldrich, США) в разведении 1 : 100 и поликлональных кроличьих антител к гистону H4K20me3 (Abcam) в разведении 1 : 500. В качестве вторичных реагентов были использованы моновалентный Fab-фрагмент антикроличьего иммуноглобулина осла, конъюгированного с флуорохромом Rhodamine Red-X (RRX) в разведении 1 : 50 (Jackson ImmunoReaserch, США) и моновалентный Fab-фрагмент антимышиного иммуноглобулина осла, меченые биотином в разведении 1 : 100 (Jackson ImmunoReaserch). Затем срезы обрабатывали конъюгатом стрептавидина с флуорохромом Cy2 (Jackson ImmunoResearch) в разведении 1 : 200. Препараты заключали в водорастворимую среду Fluorescence Mounting Medium (Dako). Анализ полученных препаратов проводили при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM 710 (Zeiss, Германия). Обработку полученных изображений и трехмерную реконструкцию объектов проводили с помощью компьютерных программ LSM Image Browser и ZEISS ZEN lite (Zeiss). Определение диаметра ядрышек и их количества осуществляли в программах ZEISS Zen lite и Fiji [12] при исследовании не менее 10 случайно выбранных клеток каждого типа таницитов для каждого срока. В тех случаях, когда ядрышек в ядре было больше одного, средний диаметр ядрышек рассчитывали для наибольшего ядрышка. Данные представлены в виде средней ± стандартная ошибка средней. Для количества ядрышек помимо абсолютных значений также рассчитывали медиану (M_e). При проведении статистического анализа использовали программу Graph Pad Prism 8. Применяли непараметрический критерий Краскела–Уоллиса с дальнейшим сравнением групп с помощью апостериорного критерия Данна. Значимым считали различия групп при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При проведении двойной иммуногистохимической реакции на виментин (маркер таницитов и эпендимоцитов) и нуклеолин (маркер ядрышка) можно наблюдать, что в дорсальной области дна третьего желудочка выстилка образована кубовидными клетками – эпендимоцитами, которые затем замещаются отросчатыми клетками – таницитами (рис. 1).

Рис. 1.

Дно третьего желудочка головного мозга крысы. Взрослое животное. Двойная иммуногистохимическая реакция на виментин (зеленый) и нуклеолин (красный). Одиночный оптический срез. Масштабный отрезок равен 200 мкм. Увеличенные фрагменты: 1 – α1-танициты; 2 – α2-танициты; 3 – β1-танициты; 4 – β2-танициты. Проекция 16 (1 фрагмент), 26 (2 фрагмент), 21 (3 фрагмент) и 36 (4 фрагмент) оптических стеков. Объектив C-Apochromat 63x/1.20 W Korr M27. Водная иммерсия. Масштабный отрезок равен 5 мкм (1 фрагмент), 10 мкм (2 и 3 фрагменты) и 20 мкм (4 фрагмент). Звездочка – полость третьего желудочка.

Наиболее дорсально среди таницитов расположены α1-танициты, отростки которых направлены в вентромедиальное ядро гипоталамуса (рис. 1, увеличенный фрагмент 1). У молодых и взрослых животных для этих клеток характерно присутствие от 1 до 4 ядрышек. В основном наблюдалось 1–3 ядрышка (97% случаев), и лишь в единичных клетках встречалось 4 ядрышка (3% случаев). У старых животных, как правило, число ядрышек составляло 1–2, редко 3. Более вентрально относительно α1-таницитов располагаются α2-танициты. Отростки этих клеток направлены в аркуатное ядро (рис. 1, увеличенный фрагмент 2). У 7- и 14-дневных крысят число ядрышек составляло 1–3, в то время как начиная с первого месяца постнатального развития для этих клеток характерно присутствие 1–2 ядрышек, у старых животных в подавляющем большинстве случаев наблюдалось 1 ядрышко. Латеральные области срединного возвышения выстилают β1-танициты, которые образуют многорядную структуру. Центральную область срединного возвышения занимают β2-танициты. Именно β-танициты контактируют с капиллярами фенестрированного типа. Для этих типов таницитов характерно наличие 1–2 ядрышек (рис. 1, увеличенные фрагменты 3 и 4 соответственно). Стоит отметить, что ядрышки таницитов в подавляющем большинстве случаев локализуются на периферии ядра, часто контактируя с ядерной оболочкой.

При измерении диаметра наибольшего из ядрышек было установлено, что диаметр ядрышек изменяется с возрастом (табл. 1, рис. 2). Для всех типов таницитов характерно увеличение размеров этой субъядерной структуры в раннем постнатальном развитии (статистически достоверно для 7 и 14 суток постанатального развития при сравнении с одномесячными животными для β1-таницитов и со взрослыми и старыми животными для всех типов таницитов). Максимальный размер ядрышка наблюдается у взрослых животных, в то время как при старении средний диаметр наибольшего ядрышка уменьшается. Кроме того, наблюдается вариабельность в диаметре ядрышка среди различных типов таинцитов в пределах одной возрастной группы. Так, у 30-дневных крысят диаметр ядрышек α1- и α2-таницитов статистически различался при сравнении с диаметром ядрышек β1-таницитов (p < 0.0001 для обоих типов таницитов), а также различались размеры ядрышек β1 и β2 таницитов (p = 0.0006). У взрослых и старых крыс разница наблюдалась между размерами ядрышек α1-таницитов с другими типами таницитов (α2, β1 и β2) (p < 0.0001 для всех групп сравнения, за исключением α1 и α2 у старых животных, здесь p = 0.0003). У 14-дневных крысят различались ядрышки α1 и β1 таницитов (p = 0.0071). У 7-дневных крысят статистически значимой разницы между размерами ядрышек не наблюдалось. Данные по количеству ядрышек и их размеру на разных этапах постнатального онтогенеза представлены в таблице 1.

Рис. 2.

Возрастная динамика в размерах ядрышка различных субпопуляций таницитов. Черная линия показывает статистически значимую разницу между разными типами таницитов в пределах одного возраста. Цветные линии показывают статистически значимую разницу в диаметре ядрышек в каждой из популяций таницитов (в соответствии с легендой) между разными возрастными группами. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001.

Для более подробного изучения структурно-функциональной организации ядрышка была поставлена двойная иммуногистохимическая реакция к аргентофильным белкам ядрышка – нуклеолину (белок C23) и нуклеофосмину (белок B23), которые опосредуют гистохимическую окраску ядрышка методом серебрения (метод Ag-NOR). Было установлено, что характер распределения этих двух белков в ядре отличается. Нуклеолин, как правило, распределен в форме тора, или двояковогнутого диска (рис. 4а), в то время как центральная часть ядрышка либо не окрашивается, либо окрашивается, но очень слабо, а также присутствует в виде отдельных скоплений в нуклеоплазме всех типов таницитов. В то время как нуклеофосмин локализуется только в ядрышках таницитов. Кроме того, характер распределения нуклеофосмина в этих субъядерных структурах сильно отличается от ядрышка к ядрышку. Как правило, белок B23 распределен в виде кольца по периферии ядрышка (рис. 3а). Реже этот белок может локализоваться в пределах ядрышка в виде двояковогнутого диска (рис. 3б), подковы (рис. 3в), отдельных глобул внутри ядрышка (рис 3г), а также распределяться в виде структуры округлой формы с поверхностной бороздой (рис. 3д, 3е). При старении характер распределения не меняется, однако центральная часть ядрышка, где нуклеолин и нуклеофосмин практически не присутствует, становится более выраженной (рис. 4а).

Рис. 3.

Характер распределения нуклеофосмина (белка B23) в ядрышках таницитов. Конфокальная лазерная микроскопия. Трехмерная реконструкция. а, б, в – α1-танициты, старые животные; г, е – β1-танициты, старые животные; д – α1-танициты, 7 сутки постнатального развития. Масштабный отрезок 2 мкм.

Рис. 4.

Профиль интенсивности флуоресценции исследуемых белков в ядрышке таницитов. Конфокальная лазерная микроскопия. Одиночный оптический срез. а – Распределение аргентофильных белков нуклеолина (красный цвет) и нуклеофосмин (зеленый цвет) в ядрышке таницитов у старых животных (20–24 мес). Стрелкой отмечена область наименьшей флуоресценции обоих белков. Головка стрелки указывает на пики флуоресценции зеленого и красного каналов. б – Зона колокализации H4K20me3 (красный цвет) и нуклеофосмина (зеленый цвет) в ядрышке таницитов у старых животных (20–24 мес). Область колокализации (желтый цвет) отмечена толстой стрелкой.

При изучении распределения конститутивного гетерохроматина в таницитах и его пространственных взаимоотношениях с ядрышком была поставлена двойная иммуногистохимическая реакция к H4K20me3 и нуклеофосмину. В таницитах конститутивный гетерохроматин представлен в виде отдельных скоплений округлой формы. Они локализуются преимущественно по периферии ядра, однако встречаются и диффузно распределенные глыбки небольшого размера, лежащие в центральной области ядра. Было выявлено, что характерным признаком для всех типов таницитов является увеличение размеров самих гетерохроматиновых глобул в раннем развитии. При старении в α-таницитах значительно увеличивается содержание гетерохроматина как по периферии ядер клеток, так и в центральных областях ядра, а в α1-таницитах может формировать сплошной периферический гетерохроматиновый слой (рис. 5). В β-таницитах содержание гетерохроматиновых агрегатов при старении меняется незначительно. При изучении пространственного расположения гетерохроматиновых скоплений относительно ядрышек было установлено, что в первую неделю развития и у старых животных в α1-таницитах почти все ядрышки погружены в гетерохроматин и окружены им со всех сторон (рис. 5). В α2- и β-таницитах в первую неделю развития, а также во всех типах таницитов на более поздних сроках развития наблюдается наличие околоядрышкового гетерохроматина, который примыкает к ядрышку с одной из сторон в виде небольшой глобулы (рис. 6). Полностью погруженных в гетерохроматин ядрышек на этих сроках выявлено не было. Однако у большинства ядрышек в области примыкания гетерохроматина формируется зона перекрывания (колокализации) нуклеофосмина и H4K20me3. Как правило, это зона небольшая и находится на границе соприкосновения этих двух белков (рис. 4б). В единичных случаях встречается околоядрышковый гетерохроматин, который формирует впячивание в глубь ядрышка (рис. 6).

Рис. 5.

Распределение гетерохроматиновых агрегатов в α1-таницитах. Двойная иммуногистохимическая реакция на H4K20me3 (красный цвет) и нуклеофосмин (зеленый цвет). Трехмерная реконструкция 28 (а) и 29 (б) оптических срезов (режим Transparent). Объектив alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 (масляная иммерсия). а – 7 сутки постнатального развития, б – старое животное (20–24 мес.). Стрелки указывают на гетерохроматиновые скопления. Звездочка – полость желудочка.

Рис. 6.

Околоядрышковый гетерохроматин в β2-таницитах. Двойная иммуногистохимическая реакция на H4K20me3 (красный цвет) и нуклеофосмин (зеленый цвет). Трехмерная реконструкция 24 оптических срезов (а – режим Transparent; б – модуль Maximum). а – Стрелки указывают на околоядрышковый гетерохроматин. Масштабный отрезок равен 5 мкм. б – Стрелкой отмечен околоядрышковый гетерохроматин, формирующий впячивание в глубь ядрышка. Двойной стрелкой отмечены гетерохроматиновые скопления на периферии ядра таницитов. Масштабный отрезок равен 2 мкм.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование архитектуры клеточного ядра в настоящее время является одним из магистральных направлений современной клеточной биологии. В нейробиологических исследованиях накоплен большой массив данных об организации ядра и его компонентов нейронов различных структур головного мозга [13–15], в то время как анализу глиальных клеток, в частности таницитов, в этой области уделено незаслуженно мало внимания [16]. Кроме того, исследования, посвященные организации ядра таницитов в постнатальном развитии и при старении, ранее не проводились. В связи с этим данные, представленные в настоящем исследовании, являются актуальными как для нейробиологии, так и для клеточной биологии в целом.

В рамках представленной работы нами были изучены ядрышки различных типов таницитов в раннем постнатальном развитии и при старении. Было установлено, что в раннем развитии количество ядрышек не меняется, однако при старении наблюдается уменьшение их числа. Кроме того, с возрастом для таницитов характерно увеличение размеров этой субъядерной структуры. Полученные результаты соотносятся с литературными данными. Было показано, что ядрышковые организаторы (nucleolar organizer regions, NORs), число которых определяет максимально возможное число ядрышек в клетке, имеют тенденцию с возрастом объединяться и формировать более крупные ядрышки [17]. Также была продемонстрирована завимость размера ядрышек и синтетической активности клетки, а также числа ядрышек и степени дифференицировки клетки [18, 19]. Это может свидетельствовать, что уменьшение числа ядрышек таницитов с возрастом происходит вследствие слияния ядрышек в более крупные, а также с закономерным увеличением синтетической активности по мере становления и формирования клеток в ходе раннего постнатального развития.

Также нами была отмечена разница в организации ядрышек среди различных типов таницитов, которые, несмотря на то что являются единой популяцией клеток, все же значительно отличаются по своим функциональным и цитохимическим свойствам. Это связано с тем, что они взаимодействуют с разными структурами в медиабазальном гипоталамусе и опосредуют их функции. Начиная с 30-х суток постнатального развития, самое крупное ядрышко присутствует в β1-таницитах, в то время как размеры ядрышек других типов исследуемых клеток не различались между собой статистически значимо. У взрослых и старых животных крупные ядрышки встречаются в α2-, β1- и β2-таницитах. Это может указывать на то, что для β1-таницитов высокая синтетическая активность характерна еще в раннем постнатальном развитии, в то время как для α2- и β2-таницитов она свойственна в более поздние сроки развития. Кроме того, полученные данные позволяют выделить популяцию α1-таницитов, для которой типично наличие некрупных ядрышек, но их количество больше, чем в других типах анализируемых клеток (за исключением α2-таницитов) на протяжении всего постнатального развития. Это соответствует мнению о том, что именно этот тип таницитов осуществляет только транспортную, но не секреторную функцию. Кроме того, поскольку количество ядрышек коррелирует со степенью дифференцировки клетки, то присутствие большого числа ядрышек может указывать и на разную способность таницитов к пролиферации. Так, согласно литературным данным, в раннем постнатальном развитии все типы таницитов характеризуются способностью к пролиферации и дифференцировке в нейроны и глию, в то время как у половозрелых животных это свойство сохраняется только у α-таницитов, а β-танициты являются коммитированными нейральными прогениторными клетками [1].

В рамках представленной работы нами были изучены два основных аргентофильных белка ядрышка – нуклеолин (белок C23) и нуклеофосмин (белок B23/NPM1). Было установлено, что и для нуклеолина, и для нуклеофосмина типично распределение в виде кольца или двояковогнутого диска. Однако характер распределения этих белков в ядрышках таницитов несколько различается. Так, пик интенсивности флуоресценции этих белков не совпадает: пик интенсивности флуоресценции нуклеолина располагается ближе к центру, по сравнению с нуклеофосмином, который тяготеет к периферии ядрышка (рис. 4а). Вероятно, такое распределение связано с тем, что, хотя оба этих белка задействованы в биогенезе рибосом, они вовлечены в разные этапы сборки прорибосомных частиц. Так, нуклеолин имеет высокую аффинность к одноцепочечной рДНК, в области нетранскрибируемого спейсера рДНК, расположенного выше сайта инициации транскрипции и, как следствие, регулирует транскрипцию рРНК, а также этот белок необходим для созревания рРНК и правильной сборки рибосомных частиц, т.е. задействован в ранних этапах созревания рибосомных субъединиц [20, 22]. Нуклеофосмин регулирует поздние этапы созревания рибосомных частиц, а именно он регулирет препроцессинг рРНК, действуя как эндорибонуклеаза, осуществялет высвобождение 28S рРНК посредством связывания со вторым внутренним транскрибируемым спейсером (ITS2) пре-РНК, а также задействован в экспорте субъединиц рибосом в цитоплазму [23, 24]. Отсутствие реакции либо слабая реакция к изучаемым белкам в центральных областях ядрышка может быть связано с тем, что часто здесь может локализоваться фибриллярный центр (ФЦ), в котором изучаемые белки, как правило, отсутствуют, что особенно отчетливо видно в крупных нейронах, где описан гигантский ФЦ [25].

Известно, что белок C23 является многофункциональным белком и выявляется в ядрышке, нуклеоплазме, цитоплазме и на плазматической мембране разных клеток. Различные посттрансляционные модификации нуклеолина и осуществление челночного транспорта опосредуют его многофункциональность. Было показано, что этот белок, помимо участия в биогенезе рибосом, задействован в организации и стабильности хроматина, метаболизме ДНК и РНК, цитокинезе, пролиферации клеток и их выживании, ангиогенезе, регуляции апоптоза, реакции на стресс и процессинге микроРНК, участии в межклеточном сигналинге, а также задействован в ряде патологических процессов [20, 25, 26]. В настоящем исследовании было установлено, что в таницитах нуклеолин помимо ядрышка также локализовался в нуклеоплазме в виде диффузно распределенных глыбок, но не в цитоплазме и не на плазматической мембране клеток. Неравномерность распределения нуклеолина в пределах нуклеоплазмы может быть связана с тем, что этот белок может выступать в качестве шаперона гистонов и локально регулировать транскрипционную активность различных генов. В то время как отсутствие этого белка в цитоплазме и на плазматической мембране может быть связана либо с недостаточной чувствительностью иммуногистохимического метода для выявления небольшого содержания этого белка в этих клеточных компартментах, либо с тем, что в таницитах, этот белок преимущественно задействован в ядрышковых и ядерных процессах.

В свою очередь, нуклеофосмин выявлялся только в пределах ядрышка исследуемых клеток. Согласно литературным источникам, нуклеофосмин локализуется в ядрышке (80% от общего содержания белка) и в нуклеоплазме (20% от общего содержания белка), а также может курсировать между ядрышком, цитоплазмой и плазматической мембраной, осуществляя челночный транспорт различных белков. Существует две изоформы нуклеофосмина – B23.1 и B23.2. N-Концевой и центральный домены у этих изоформ идентичны, в то время как C-концевой домен (имеющий сигнал ядрышковой локализации, Nucleolar localisation signal, NoLS) присутствует только в изоформе B23.1. Это обуславливает преимущественную локализую изоформы B23.1 в ядрышке, а B23.2 – в нуклеоплазме [27]. В настоящем исследовании были использованы антитела, которые выявляют C-концевой участок белка B23, т.е. изоформу B23.1, что объясняет его идентификацию только в пределах ядрышка таницитов.

Распределение гетерохроматиновых агрегатов также является важной характеристикой клеточного ядра. Гетерохроматин входит в состав сразу нескольких ядерных субкомпартментов, таких как ламинассоциированные домены, теломерные и центромерные участки, околоядрышковый гетерохроматин и др. В данном исследовании было показано, что с возрастом наблюдается увеличение размеров гетерохроматиновых скоплений в ядрах α1-таницитов, при этом в β-таницитах содержание гетерохроматина меняется незначительно. В литературных источниках данные об изменении содержания конститутивного гетерохроматина при старении противоречивы. Согласно одним данным, при старении происходит значительное снижение гетерохроматизации в клетках различных типов, так называемая “модель старения с потерей гетерохроматина” (heterochromatin loss model of aging) [28, 29]. Однако в исследовании Lezhava [30] было показано, что при старении в лимфоцитах человека происходит интенсивная гетерохроматизация хромосом. Предполагается, что в данном случае возрастное (после 70 лет) накопление хромосомных аберраций и аннеуплоидий, происходит вследствие активной гетерохроматизации ДНК и невозможности физического доступа репаративных ферментов к этим участкам. Прогрессивное усиление гетерохроматинизации при старении способствует инактивации ряда ранее функционирующих “активных генов”. Это приводит к блоку определенных этапов метаболических процессов клеточных систем, которые происходят в норме, в результате чего недостаток многих специфических ферментов рано или поздно приводит к патологиям старения [30]. Вероятно, α-танициты также являются тем типом клеток, которые подвергаются гетерохроматизации при старении, что может отражаться на их функциях. В этом отношении при старении β-танициты характеризуются стабильностью организации изучаемых компартментов клеточного ядра, что, возможно, связано с их уникальной локализацией в области срединного возвышения, где располагаются капилляры фенестрированного типа (т.е. лишенные гематоэнцефалического барьера). Вероятно, это необходимо для поддержания нормального функционирования не только самих β-таницитов, но и адекватной работы гипоталамо-гипофизарной оси в целом.

При изучении пространственных взаимоотношений ядрышек и гетерохроматина было установлено, что ядрышки всех типов таницитов на всех исследованных сроках находятся в тесной ассоциации с околоядрышковым конститутивным гетерохроматином. В области их контакта формируется зона колокализации, что может свидетельствовать о структурно-функциональном взаимодействии этих двух компартментов. Известно, что нуклеофосмин имеет сайты связывания с тетрамером гистонов H3-H4 и H2A-H2B, а также линкерным гистоном H1. Связываясь с гистоном, белок B23 выступает в качестве шаперона гистонов, и принимает участие в формировании нуклеосомной частицы [31]. Ранее Lafarga и соавт. [32] в своих работах показали, что околоядрышковый гетерохроматин в ряде случаев формирует впячивание – хроматиновую ножку (chromatine pedicle), которая проходит через ПФК и касается фибриллярного центра ядрышка. Нами также было обнаружено, что в единичных клетках встречается околоядрышковый гетерохроматин, который формирует впячивание в глубь ядрышка.

Таким образом, настоящее исследование представляет собой первый сравнительно-онтогенетический анализ ядрышек и конститутивного гетерохроматина в различных типах таницитов в ходе раннего постнатального развития и при старении. В данной работе была показана гетерогенность как в размерах ядрышек, так и в их количестве не только между различными субпопуляциями таницитов, но и в возрастном аспекте, что может свидетельствовать о различном функциональном статусе этих клеток. Так, было показано увеличение размеров ядрышек и уменьшения их количества с возрастом, что, вероятно, говорит о закономерном увеличении синтетической активности по мере становления и формирования клеток в ходе раннего постнатального развития. Впервые описано распределение главных аргентофильных белков ядрышка, нуклеолина и нуклеофосмина, а также конститутивного гетерохроматина в таницитах на различных этапах развития. Было продемонстрировано, что нуклеолин и нуклеофосмин имеют различную пространственную локализацию в пределах ядрышка. Распределение гетерохроматиновых скоплений различается среди субпопуляций таницитов в ходе старения: α-танициты подвержены интенсивной гетерохроматизации, в то время как β-танициты характеризуются стабильностью организации изучаемых компартментов клеточного ядра. Полученные данные существенно дополняют современное представление об организации ядрышкового аппарата и гетерохроматина в таницитах в ходе нормального развития и старения, что создает условия для определения роли этих субъядерных структур в патологических процессах при различного рода повреждающих воздействиях.

Представленные изображения получены с помощью оборудования Центра коллективного пользования научным оборудованием “Микробиом человека” при ФГБНУ “Институт экспериментальной медицины”.

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источники финансирования. Работа финансировалась из средств Государственного задания ФГБНУ “Институт экспериментальной медицины”.

Соответствие принципам этики. Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.