Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2021, T. 38, № 6, стр. 434-439

ВВЕДЕНИЕ

Функциональная разгрузка, наблюдаемая как в условиях микрогравитации при космическом полете, так и в земных условиях при моделировании микрогравитации (антиортостатическое вывешивание грызунов, модель “сухой” иммерсии с участием человека), а также при иммобилизации конечностей и постельном режиме, приводит к мышечной атрофии, снижению мышечного тонуса (атонии), снижению окислительных способностей мышц и трансформации мышечных волокон из “медленного” типа в “быстрый” [1]. В последние годы в нашей лаборатории было показано, что ингибирование киназы GSK-3 предотвращает снижение экспрессии медленной изоформы тяжелых цепей миозина (ТЦМ) в камбаловидной мышце крысы на фоне антиортостатического вывешивания [2]. Также по данным ряда работ, GSK-3 способна инактивировать экспрессию PGC1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), ключевого регулятора митохондриального биогенеза, на фоне функциональной разгрузки и в процессе миогенеза [3, 4]. Ряд литературных данных свидетельствует о том, что экспрессия медленной изоформы ТЦМ способна регулировать экспрессию ключевого фактора митохондриального биогенеза PGC1α за счет активации сигнального пути микроРНК-208/myh7b/микроРНК-499 [5, 6]. В процессе экспрессии мРНК гена myh7, кодирующего медленную изоформу ТЦМ, также происходит экспрессия микроРНК-208b, закодированной в одном из интронов этого гена. МикроРНК-208b способна индуцировать экспрессию гена myh7b, который представляет собой древний ген одной из миозиновых изоформ, играющий в мышечных волокнах камбаловидной мышцы исключительно регуляторную роль. мРНК гена myh7b кодирует регуляторную микроРНК-499 [7]. Сверхэкспрессия микроРНК-499 в миотубах С2С12 приводит к усилению экспрессии медленной изоформы тропонина tnni1, миоглобина и PGC1α [8]. Таким образом, данная микроРНК играет важную роль в реализации окислительного фенотипа мышечного волокна. Влияние ингибирования GSK-3 на трансформацию миозинового фенотипа в условиях антиортостатического вывешивания было исследовано ранее, однако возможность предотвращения инактивации митохондриального биогенеза в условиях функциональной разгрузки путем ингибирования GSK-3 остается неисследованной. Таким образом, цель работы заключалась в исследовании влияния ингибирования GSK-3 на ряд параметров, регулирующих биогенез митохондрий и экспрессию гена myh7b в постуральной камбаловидной мышце крыс в условиях 7-суточного антиортостатического вывешивания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения эксперимента было отобрано 24 самца крыс линии Вистар массой 200 ± 10 г и возрастом 2.5 мес. Все животные содержались при температуре 20–25°C, вода и корм грызунам давались без ограничения в соответствии с рационом для лабораторных животных. Эксперимент был проведен согласно биоэтическим правилам проведения исследований на животных и одобрен комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ – ИМБП РАН (протокол № 421, 14.04.2016). Для решения поставленной задачи в эксперименте проводилось моделирование гравитационной разгрузки в течение 7 сут по методу антиортостатического вывешивания Новикова–Ильина в модификации Morey-Holton [9, 10]. В соответствии с данным методом крысы были вывешены за хвост под углом 30 градусов к полу клетки таким образом, что передние конечности крысы опирались на пол, а задние конечности не касались пола. Животные были случайным образом разделены на 3 группы по 8 особей в каждой: С – группа виварного контроля; 7HS – группа, вывешенная на протяжении 7 сут; 7HS + G – группа, вывешенная на протяжении 7 сут, которой также ежедневно вводили AR-A014418 (ингибитор GSK-3) в дозировке 4 мг на 1 кг массы тела животных. Все препараты вводили внутрибрюшинно, растворенными в 1% DMSO в физрастворе в объеме 1.5 мл. Группам C и HS ежедневно вводили 1.5 мл раствора 1% DMSO в физрастворе. После проведения эксперимента у каждого животного под авертиновым наркозом (трибромэтанол, 240 мг/кг) из обеих ног были выделены камбаловидные мышцы, взвешены на аналитических весах и немедленно заморожены в жидком азоте. Замороженный биоматериал использовали для выделения тотальной РНК и ДНК, а также тотальной белковой фракции.

Для выделения тотальной белковой фракции и последующей оценки содержания в ней GSK-3β, фосфорилированной GSK-3β (Ser 9), гликогенсинтазы (GS) и фосфорилированной GS (Ser 641) был использован набор реагентов RIPA Lysis Buffer System (Santa Cruz, США). При этом дополнительно использовались ингибиторы протеаз Complete Protease Inhibitor Coctail (Santa Cruz), 10 мкг/мл апротинина (Sigma-Aldrich, США), 10 мкг/мл леупептина (Sigma-Aldrich) 10 мкг/мл пепстатина (Sigma-Aldrich), 20 мкл Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Швейцария), 40 мкл фосфоингибиторного коктейля (Santa Cruz). Содержание тотальной и фосфорилированной форм GSK-3β проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом, как было описано ранее [11]. Выявление целевых белков проводилось с помощью следующих первичных антител: p-GSK3β (Ser 9) (1 : 1000, #9322, Cell Signaling Technology, США), GSK-3β (1 : 1000, #12456, Cell Signaling Technology), p-glycogen synthase 1 (Ser 641) (1 : 10 000, Abcam, США), anti-glycogen synthase 1 antibody (1 : 1000, ab40867, Abcam). В качестве вторичных антител использовались биотинилированные антитела goat anti-rabbit (sc-2004, Santa Cruz) в разведении 1 : 1000.

Выделение тотальной РНК проводили с помощью набора RNeasy Micro Kit (Qiagen, США) согласно рекомендациям производителя. Для синтеза кДНК использовали набор фирмы Синтол (Россия). Анализ экспрессии генов проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Выделение ДНК проводили с использованием набора QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen) согласно рекомендациям производителя. Содержание митохондриальной ДНК определяли с помощью ПЦР в реальном времени, в качестве праймеров к митохондриальной ДНК использовали праймеры к COX I. Список использованных в работе праймеров представлен в табл. 1. Анализ данных ПЦР проводился по методу Pfaffl с учетом эффективностей амплификации [12]. Статистическую обработку данных проводили с помощью непараметрического критерия Краскела–Уоллиса с последующим апостериорным тестом Данна. Достоверными считались различия с p < 0.05. В качестве референсного гена использовался RPL19.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После 7 сут антиортостатического вывешивания мы обнаружили достоверное снижение уровня фосфорилирования GSK-3β по 9 остатку серина, что свидетельствует об активации данной киназы (рис. 1а) Введение ингибитора GSK-3 не повлияло на уровень фосфорилирования GSK-3β, что было ожидаемо, поскольку принцип действия AR-A014418 не предполагает влияния на посттрансляционные модификации GSK-3β [13]. AR-A014418 является высокоселективным конкурентным ингибитором GSK-3, механизм действия которого основан на препятствии связывания ATP в активном центре фермента. Действие ингибитора было подтверждено с помощью оценки фосфорилирования гликогенсинтазы (GS) – ключевого субстрата GSK-3β.

Рис. 1.

Процент фосфорилирования GSK-3β по Ser 9 (а) и GS по Ser 641 (б) в камбаловидных мышцах крыс. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. С – контрольная группа, 7HS – группа 7-суточного антиортостатического вывешивания, 7HS + G – группа 7-суточного антиортостатического вывешивания с введением ингибитора GSK-3. * – достоверные отличия от контрольной группы (p < 0.05).

После 7 сут антиортостатического вывешивания мы обнаружили достоверное повышение уровня фосфорилирования GS-1 по 641 остатку серина (рис. 1б), что свидетельствует об активации GSK-3β. Введение ингибитора GSK-3 снизило уровень фосфорилирования GS-1 до контрольного уровня.

После 7 сут антиортостатического вывешивания содержание митохондриальной ДНК в камбаловидной мышце животных достоверно снизилось вдвое в сравнении с контрольной группой (рис. 2а). Эти результаты соответствуют данным о снижении количества копий митохондриальной ДНК на фоне функциональной разгрузки, полученным другими авторами, и могут считаться показателем снижения уровня биогенеза митохондрий в камбаловидных мышцах при вывешивании [4]. Также после 7 сут вывешивания мы обнаружили снижение уровня экспрессии мРНК ключевого регулятора биогенеза митохондрий PGC1α (рис. 2б), его мишени – фактора транскрипции митохондриальных генов TFAM (рис. 2ж), а также мРНК генов митофузина-1 (рис. 2е) и митофузина-2 (рис. 2д). Снижение других генов-мишеней PGC1α, NRF-1 и NRF-2α, являющихся коактиваторами транскрипции ряда генов, необходимых для биогенеза митохондрий, не было достоверным (рис. 2б–2ж). Введение ингибитора GSK-3 на фоне функциональной разгрузки привело к достоверному повышению содержания митохондриальной ДНК (рис. 2а), повышению экспрессии PGC1α (рис. 2б), митофузинов 1 (рис. 2е) и 2 (рис. 2д), а также TFAM (рис. 2ж) в сравнении со значениями в группе вывешивания с введением плацебо. Стоит отметить, что митофузины 1 и 2 принимают участие в регуляции слияния митохондрий и играют ключевую роль в адаптации мышц к упражнениям на выносливость [14]. Таким образом, GSK-3-зависимое снижение экспрессии данных белков может вносить вклад в развитие повышенной утомляемости скелетных мышц в условиях функциональной разгрузки. При этом введение ингибитора GSK-3 также привело к повышению экспрессии мРНК NRF-1 (рис. 2в) и NRF-2α (рис. 2г) в сравнении с группой вывешивания с введением плацебо. Таким образом, можно сделать вывод, что ингибирование GSK-3 приводит к предотвращению снижения биогенеза митохондрий, вероятно, посредством влияния на уровень экспрессии PGC1α. Эти результаты соответствуют данным, полученным ранее с использованием трансгенных животных [4].

Рис. 2.

Содержание митохондриальной ДНК (а), экспрессия мРНК PGC1α (б), экспрессия мРНК NRF-1 (в), экспрессия мРНК NRF-2α (г), экспрессия мРНК митофузина-2 (д), экспрессия мРНК митофузина-1 (е), экспрессия мРНК TFAM (ж), экспрессия мРНК myh7b (з) в камбаловидных мышцах крыс. Данные представлены в виде медианы, интерквартильного интервала, а также максимумов и минимумов. С – контрольная группа, 7HS – группа 7-суточного антиортостатического вывешивания, 7HS + G – группа 7-суточного антиортостатического вывешивания с введением ингибитора GSK-3. * – достоверные отличия от контрольной группы (p < 0.05), & – достоверные отличия от группы 7HS (p < 0.05).

Механизмы влияния GSK-3 на экспрессию PGC1α при функциональной разгрузке остаются неизвестными. Тем не менее известно, что микроРНК-499 способна активировать экспрессию PGC1α [6, 8, 15]. Мы обнаружили, что ингибирование GSK-3 приводит к частичному предотвращению снижения предшественника микроРНК-499, мРНК гена myh7b, в камбаловидных мышцах животных из группы 7HS + G. Также после 7 сут антиортостатического вывешивания мы обнаружили снижение экспрессии мРНК миоглобина и медленной изоформы тропонина (рис. 3), при этом в группе 7HS + G снижение уровня экспрессии данных генов было лишь частично предотвращено (рис. 3). С учетом того факта, что экспрессия этих генов способна регулироваться микроРНК-499, можно предположить, что GSK-3 регулирует их экспрессию за счет влияния на myh7b/микроРНК-499. Таким образом, не исключено, что и эффект GSK-3 на экспрессию PGC1α и митохондриальный биогенез по крайней мере частично осуществляется за счет микроРНК-зависимых регуляторных механизмов.

Рис. 3.

Экспрессия мРНК гена миоглобина (а) и медленной изоформы тропонина (Tnni) (б) в камбаловидных мышцах крыс. Данные представлены в виде медианы, интерквартильного интервала, а также максимумов и минимумов. С – контрольная группа, 7HS – группа 7-суточного антиортостатического вывешивания, 7HS + G – группа 7-суточного антиортостатического вывешивания с введением ингибитора GSK-3. * – достоверные отличия от контрольной группы (p < 0.05).

С учетом того, что GSK-3 является негативным регулятором экспрессии гена медленной изоформы ТЦМ [2], можно заключить, что активация GSK-3 на фоне антиортостатического вывешивания приводит к трансформации фенотипа мышечных волокон в постуральной мышце крысы: от “медленного” (окислительного и устойчивого к утомлению) к “быстрому” (гликолитическому, менее устойчивому к утомлению).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена в рамках проекта РНФ № 17-75-20 152.

Соответствие принципам этики. В настоящей статье все эксперименты были проведены с соблюдением всех биоэтических норм и одобрены комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ – ИМБП РАН (протокол № 421, 14.04.2016).