Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2022, T. 39, № 2, стр. 107-115

ВВЕДЕНИЕ

Прегнан Х рецептор (PXR, steroid and xenobio-tic receptor – SXR, NR1I2 – Nuclear Receptor Subfamily 1, Group I, Member 2) является членом суперсемейства ядерных рецепторов, которое в основном включает факторы транскрипции [1].

Впервые PXR был независимо клонирован в лабораториях Kliewer в Glaxo Wellcome и Evans в Salk Institute в 1998 году [2, 3]. PXR был назван Kliewer на основании его активации 21-углеродными стероидами прегнанами. В лаборатории Evans данный рецептор получил наименование стероидный и ксенобиотический рецептор (SXR) из-за его активации широким спектром природных и синтетических стероидов, а также ксенобиотиков [3].

PXR экспрессируется преимущественно в печени и кишечнике. Первоначально было выявлено, что PXR регулирует экспрессию ферментов I фазы биотрансформации, таких как изоферменты цитохрома P450 CYP3A и CYP2B. Последующие исследования, выполненные во многих лабораториях, показали, что PXR является одним из главных регуляторов ксенобиотического ответа, регулируя экспрессию ферментов, также II фазы биотрансформации UDP-глюкуронозилтрансферазы 1A1 и сульфотрансферазы, а также переносчиков лекарственных веществ MDR1 и MRP2 [4].

PXR контролирует экспрессию генов через модуль PXR-чувствительного элемента в промоторной области генов-мишеней. Основными индукторами PXR являются рифампицин, рифаксимин, ампренавир, литохолевая кислота, соломстерол A и B, дексаметазон, никардипин и др. [5].

Совсем недавно было показано, что PXR-опосредованная регуляция ферментов и переносчиков может принимать участие во многих физиологических и патологических процессах, например, обмене желчных кислот, билирубина, стероидных гормонов, глюкозы и липидов. Эти новые данные предполагают, что функции PXR выходят за рамки “рецептора ксенобиотиков” [4].

Активные формы кислорода (АФК) образуются во время физиологических процессов и, взаимодействуя с белками, жирами, нуклеиновыми кислотами, играют значимую роль в регуляции клеточных функций. Однако избыточная продукция АФК может приводить к структурным и функциональным изменениям, вызывающим повреждение клеток. Эти потенциально токсические эффекты компенсируются в нормальных условиях внутренними антиоксидантными механизмами, которые участвуют в физиологическом и/или патологическом метаболизме АФК [6].

Окислительный стресс, который возникает в результате повышенной продукции АФК и/или снижения емкости антиоксидантной защиты, может вызывать повреждение клеточных компонентов, аутоиммунные реакции и, в конечном итоге, способствовать нарушению биохимических и физиологических процессов [7].

В ряде исследований оценивалось влияние окислительного стресса на количество PXR. В опытах in vivo на мышах и крысах выявлено, что развитие воспаления и окислительного стресса, вызванных введением липополисахарида или наночастиц меди, сопровождается снижением количества PXR в печени животных [8, 9]. В то же время в опытах in vitro на эндотелиальных клетках HUVEC показано, что воздействие H₂O₂ в концентрации 400 мкМ и длительностью экспозиции 3 ч не влияет на уровень PXR [10].

Таким образом, данные о функционировании PXR в условиях окислительного стресса носят противоречивый характер. Поэтому целью настоящего исследования было оценить влияние окислительного стресса на функционирование PXR.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток. Исследование выполнено на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека (Caco-2) (ЦКП “Коллекция культур клеток позвоночных”, Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали при 37°C и 5% содержании СО₂ в инкубаторе WS-189C (World Science, Корея) в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) (Sigma-Aldrich, США), с добавлением L-глутамина (4 мМ) (Sigma-Aldrich), 15% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich), 100 ед/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (Sigma-Aldrich) соответственно.

Клетки культивировали в течение 21 сут, поскольку при данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в энтероцитоподобные клетки, экспрессирующие PXR [11].

Окислительный стресс моделировали добавлением в культуральную среду пероксида водорода Н₂О₂ (Sigma-Aldrich) в конечных концентрациях 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 и 100 мкМ и инкубацией в течение 3, 24 и 72 ч.

Контрольным клеткам в эквивалентном объеме в культуральную среду добавляли воду для инъекций (растворитель для H₂O₂). На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения. При инкубации 72 ч смену питательной среды проводили каждые 24 ч. В качестве контроля индукции PXR дополнительно проводили инкубирование клеток Сасо-2 с рифампицином (Sigma-Aldrich) в концентрации 10 мкМ в течение 24 ч.

Дополнительно для изучения механизма влияния окислительного стресса на количество PXR были выполнены серии экспериментов с оценкой влияния продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) – малонового диальдегида (МДА, Sigma- Aldrich) – в концентрациях 10, 100 и 150 мкМ и экспозицией 24 ч на содержание PXR (n = 3 для каждой концентрации).

Для исследования цитотоксичности пероксида водорода и МДА клетки высевали в 96-луночный планшет (Сorning, США), для изучения влияния данных веществ на концентрацию продуктов ПОЛ и количество PXR клетки культивировали в 6-луночных планшетах (Сorning).

Цитотоксический тест (МТТ-тест). Клетки засевали в 96-луночный планшет из расчета 10⁴ клеток на каждую лунку и культивировали в течение 21 сут, затем добавляли питательную среду с Н₂О₂ или МДА. После окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 20 мкл 0.5% раствора бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия (МТТ, ПанЭко, Россия) и инкубировали в течение 2 ч, затем раствор МТТ удаляли и добавляли 200 мкл 1% раствора диметилсульфоксида (ПанЭко) [12]. Поглощение измеряли через 10 мин при 530 нм на спектрофотометре для планшетов Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США).

Жизнеспособность клеток Сасо-2 рассчитывали по формуле: (ОП опытных лунок – ОП среды)/ (ОП контрольных лунок – ОП среды) × 100%, где ОП — оптическая плотность.

Получение тотальных клеточных лизатов. Клетки засевали в 6-луночные планшеты из расчета 10⁵ клеток на каждую лунку и культивировали в течение 21 сут, затем добавляли питательную среду с Н₂О₂ или МДА в соответствующие планшеты. После окончания экспозиции с пероксидом водорода или МДА клетки снимали с лунок раствором трипсин–EDTA (0.25% трипсина и 0.2% EDTA, Sigma-Aldrich).

Клетки из расчета 1 × 10⁶ промывали изотоническим солевым раствором (Медпро, Россия) и лизировали в 150 мкл ледяного буфера (50 мМ, pH 7.4 трис-HCl, 150 мМ KCl, 0.5% тритон X-100, смесь ингибиторов протеиназ (аминоэтилбензенсульфонил флуорида гидрохлорид (AEBSF) 2 мМ, апротинин 0.3 мкМ, бестатин 130 мкМ, EDTA 1 мМ, эпоксисукциниллейцингуанидинобутиламид (Е-64) 14 мкМ, лейпептин 1 мкМ, Sigma-Aldrich), встряхивали на шейкере и инкубировали на льду в течение 10 мин. Затем центрифугировали в течение 10 мин при 5000 g (СМ-50, Eppendorf, Германия). Цитоплазматическую (экстраядерную) фракцию переносили в отдельные пробирки и использовали для определения концентрации продуктов ПОЛ (МДА и 4-гидрокси-олефины).

Определение концентрации продуктов перекисного окисления липидов. В лизате клеток с помощью коммерческого набора определяли концентрацию продуктов ПОЛ (Elabscience, Китай). Метод определения продуктов ПОЛ – МДА и 4-гидрокси-олефинов (4-гидрокси-2-ноненаля и 4-гидрокси-2-гексеналя) основан на их взаимодействии с 1-метил-2-фенилиндолом с образованием стабильного хромофора, который имеет максимум поглощения при 586 нм [13]. Полученные результаты выражали в мкмоль/мг белка. Анализ выполняли на спектрофотометре для планшетов Stat Fax 2100 (Awareness Technology).

Количество белка в пробах анализировали методом Бредфорда (Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, США) [14].

Определение количества PXR в клетках линии Сасо-2 проводили методом вестерн-блот. После окончания экспозиции с пероксидом водорода и МДА, клетки снимали с лунок раствором трипсин–EDTA (Sigma-Aldrich), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich) в течение 30 мин при +4°C и постоянном перемешивании из расчета 10⁷ клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 22 440 g в течение 10 мин (AvantiJXN-3, Beckman Coulter, США). Цитоплазматические белки (30 мкг) подвергали электрофорезу с использованием TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit (Bio-Rad) в буферной системе Лэммли (BioRad). Перед загрузкой образцы обрабатывались в соответствии с протоколом Bio-Rad. Их смешивали с буфером для образцов Лэммли (Bio-Rad), содержащем 2.5% 2-меркаптоэтанола (Bio-Rad) в соотношении 1 : 3, инкубировали 5 мин при температуре 95°C. Гели прогоняли при 100 В в течение 90 мин. Для определения относительного количество PXR методом вестерн-блот использовали первичные мышиные моноклональные антитела (MA5-31808 PXR Monoclonal Antibody (1D12G1, Invitrogen, США) в концентрации 1 : 200. Визуализацию первичных антител осуществляли с использованием вторичных кроличьих антител (Rabbit anti-Mouse IgG (H + L) Secondary Antibody, HRP, Invitrogen) в разведении 1 : 4000. Белки визуализировали хемилюминесценцией с помощью Chemi Doc XRS+ (Bio-Rad). Интенсивность полученных полос (бэндов) анализировали денситометрически с помощью программного обеспечения ImageLab (Bio-Rad). Количество PXR оценивали относительно содержания белка домашнего хозяйства GAPDH (первичные антитела к GAPDH – Loading Control Monoclonal Antibody (GA1R), DyLight 68, Invitrogen, разведение 1 : 1000, вторичные кроличьи антитела к первичным антителам GAPDH – Rabbitanti-Mouse IgG (H + L) Secondary Antibody, HRP, Invitrogen, разведение 1 : 4000).

Статистический анализ. Полученные результаты анализировали с помощью программ StatSoft Statistica 13.0 (США) и Microsoft Excel for MAC ver. 16.24. Результаты представлены в виде M ± SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена–Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАЫ

Цитотоксическое действие H₂O₂ и МДА на клетки линии Caco-2. Цитотоксическое действие H₂O₂ и МДА оценивалось по результатам МТТ-теста. В контрольной группе жизнеспособность клеток составила 100%. При воздействии пероксида водорода в концентрациях 0.1–10 мкМ и сроках инкубации 3, 24 и 72 ч жизнеспособность клеток не изменялась и составляла в среднем 87.6 ± 9.3%.

При инкубации клеток с H₂O₂ в течение 3, 24 и 72 ч при концентрации прооксиданта 50 мкМ жизнеспособность клеток снижалась до 71.3 ± ± 12.1% (p = 0.01), 54.1 ± 9.5% (p = 0.001) и 58.8 ± ± 11.5 (p = 0.02), а при концентрации 100 мкМ – до 70.9 ± 12.2% (p = 0.006), 26.8 ± 14.3% (p = = 0.0003) и 34.3 ± 11.1% (p = 0.002) соответственно (рис. 1).

Рис. 1.

Изменение жизнеспособности клеток линии Сасо-2 в зависимости от концентрации пероксида водорода при инкубации 3 (1), 24 (2) и 72 ч (3) (n = 3). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста. *p < 0.05 по сравнению с контролем.

При воздействии МДА на клеточную линию Сасо-2 их жизнеспособность снижалась при концентрации субстанции 100 и 150 мкМ до 88.5 ± ± 4.6% (p = 0.028) и 63.9 ± 3.1% (p = 0.0003), а при концентрации 10 мкМ статистически значимо не отличались от значений контрольной группы и составила 98.1 ± 6.5% (рис. 2).

Рис. 2.

Изменение жизнеспособности клеток линии Сасо-2 в зависимости от концентрации МДА при инкубации 24 ч (M ± SD, n = 3). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста. *p < 0.01 по сравнению с контролем.

Концентрация продуктов ПОЛ в клетках Caco-2 после инкубации с H₂O₂ и МДА. Воздействие пероксида водорода на клетки линии Caco-2 в течение 3 ч приводило к увеличению уровня продуктов ПОЛ лишь в концентрации 100 мкМ на 35.7% (p = 0.04) по сравнению с контролем. Увеличение длительности экспозиции Н₂О₂ до 24 ч сопровождалось повышением содержания МДА и 4-гидроксиолефинов уже при двух концентрациях прооксиданта: 50 мкМ – на 42.1% (p = 0.006) и 100 мкМ – на 57.1% (p = 0.0007) соответственно (рис. 3). При увеличении длительности воздействия пероксида водорода до 72 ч отмечалось дальнейшее нарастание уровня продуктов ПОЛ при концентрациях Н₂О₂ 50 и 100 мкМ, данные показатели превышали значение контроля на 194.9% (p = 0.0002) и 323.4% (p = 0.0003) соответственно.

Рис. 3.

Изменение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (МДА и 4-гидроксиолефинов) при индукции окислительного стресса пероксидом водорода в концентрациях 0.1–100 мкМ в течение 3, 24 и 72 ч. Количественное определение продуктов ПОЛ проводили фотометрическим методом в лизате клеток линии Сасо-2 (M ± SD, n = 3). *p < 0.05 по сравнению с контролем. ^#p < 0.01 по сравнению с группой 24 ч.

Важно отметить, что при увеличении срока инкубации до 72 ч концентрация продуктов ПОЛ возрастала также относительно значений при сроке инкубации 24 ч на 87.6% (p = 0.002) при концентрации 50 мкМ и на 144.8% (p = 0.0004) при концентрации 100 мкМ.

Добавление МДА в питательную среду к клеткам линии Сасо-2 в концентрации 10, 100 и 150 мкМ приводило к статистически значимому увеличению количества МДА в лизате клеток на 63.8% (p = 0.03), 168.3% (p = 0.02), 325.1% (p = = 0.0008) соответственно, что свидетельствует о проникновении продукта ПОЛ в цитоплазму клеток (рис. 4).

Рис. 4.

Изменение концентрации МДА в лизате клеток линии Сасо-2 после инкубации в питательной среде с добавлением МДА в концентрациях 10, 100 и 150 мкМ в течение 24 ч (M ± SD, n = 3). *p < 0.05 по сравнению с контролем.

Влияние H₂O₂ и МДА на количество PXR. Классический индуктор PXR – рифампицин в концентрации 10 мкМ и длительностью воздействия 24 ч вызывал увеличение количества PXR на 64.6% (p = 0.0003) по сравнению с контролем (рис. 5), что подтверждает адекватность метода оценки регуляции данного транскрипционного фактора и согласуется с данными литературы [15].

Рис. 5.

Относительное количество PXR в клетках линии Сасо-2 при воздействии рифампицина в концентрации 10 мкМ в течение 24 ч. Относительное количество PXR определяли методом вестерн-блот с последующим денситометрическим анализом с помощью программного обеспечения ImageLab. 1 – контроль; 2 – рифампицин; *p < 0.05 по сравнению с контролем (дисперсионный анализ).

Воздействие пероксида водорода на клетки линии Caco-2 в течение 3 ч не влияло на количество PXR, данный показатель достоверно не отличался от значений контроля (рис. 6).

Рис. 6.

Относительное количество PXR в клетках линии Сасо-2 при индукции окислительного стресса пероксидом водорода в концентрациях 0.1–100 мкМ в течение 3, 24 и 72 ч (M ± SD, n = 3). Относительное количество PXR определяли методом вестерн-блот с последующим денситометрическим анализом с помощью программного обеспечения ImageLab. К – контроль; *p < 0.05 по сравнению с контролем.

Увеличение длительности экспозиции с прооксидантом до 24 ч вызывало повышение количества PXR при концентрации H₂O₂ 10, 50 и 100 мкМ на 67.1% (p = 0.03), 25.9% (p = 0.0003) и 35.9% (p = = 0.0003) соответственно (рис. 6).

Увеличение длительности воздействия до 72 ч сопровождалось нормализацией уровня PXR при концентрации H₂O₂ 0.1–10 мкМ и его снижением при концентрации 50 мкМ на 18.6% (p = 0.0003) и при концентрации 100 мкМ на 26.9% (p = 0.03) по сравнению с контролем (рис. 6).

При концентрации пероксида водорода 100 мкМ и длительности инкубации 72 ч отмечалось расщепление бэнда PXR, что скорее всего, связано с повреждением молекулы транскрипционного фактора за счет окислительного повреждения или действием протеолитических ферментов.

Инкубирование клеток с МДА также приводило к индукции PXR: при концентрации МДА 10 мкМ количество PXR возрастало на 38.6% (p = = 0.007), 100 мкМ – на 20.8% (p = 0.07), а при 150 мкМ – снизилось на 8.9% (p = 0.21) (рис. 7).

Рис. 7.

Относительное количество PXR в клетках линии Сасо-2 при воздействии МДА в концентрациях 10, 100 и 150 мкМ в течение 24 ч (M ± SD, n = 3). Относительное количество PXR определяли методом вестерн-блот с последующим денситометрическим анализом с помощью программного обеспечения ImageLab. К – контроль; *p < 0.05 по сравнению с контролем.

ОБСУЖДЕНИЕ

Активные формы кислорода (АФК) постоянно образуются в ходе жизнедеятельности клеток. При этом их избыточное образование может вызывать окислительное повреждение биомакромолекул клеток и способствовать развитию заболеваний и старению [16]. Между тем, АФК могут играть и регуляторную роль [17]. В настоящее время принято считать, что в функции АФК как сигнальной молекулы главную роль играет цистеин [18]. Тиолы белков образуют различные окислительные модификации, такие как сульфеновая кислота, сульфиновая кислота, сульфоновая кислота, дисульфидные связи, S-глутатионилированные и S-нитрозилированные производные. Эти окислительные модификации тиолов участвуют во множестве клеточных процессов, таких как экспрессия генов, энергетический метаболизм, фосфорилирование белков [19]. Кроме этого, известно, что изучаемые нами показатели – малоновый диальдегид и 4-гидроксиолефины – могут выступать в качестве сигнальных молекул, а именно доказана их цитотоксическая роль в подавлении экспрессии генов, что способствует гибели клеток [20].

В ходе настоящего исследования было показано, что воздействие пероксида водорода на клетки линии Caco-2 в течение 3 ч не влияло на количество PXR, увеличение длительности экспозиции с прооксидантом до 24 ч вызывало повышение количества PXR при концентрации H₂O₂ 10, 50 и 100 мкМ. При длительности экспозиции 72 ч отмечалась нормализация уровня PXR при концентрации H₂O₂ 0.1–10 мкМ и его снижение в концентрации 50 и 100 мкМ. Снижение количества изучаемого транскрипционного фактора, скорее всего, связано с усилением окислительного стресса: при данных концентрациях и длительности воздействия отмечалось максимальное увеличение уровня МДА и снижение жизнеспособности клеток. Кроме этого, в условиях окислительного стресса происходит активация протеолитических ферментов, что может приводить к протеазному расщеплению PXR и вследствие этого снижать его количество.

Для исследования механизма повышения количества PXR при развитии окислительного стресса были выполнены эксперименты по оценке влияния МДА-конечного продукта ПОЛ на уровень изучаемого транскрипционного фактора. В ходе эксперимента было установлено, что инкубация клеток линии Caco-2 с МДА в течение 24 ч приводила к повышению его концентрации внутри клеток. По данным литературы известно, что МДА может растворяться в билипидной мембране клеток и проникать внутрь клеток [21], тем самым оказывая внутриклеточные эффекты.

МДА в концентрации 10 мкМ вызывал повышение содержания PXR, а увеличение концентрации МДА до 100 и 150 мкМ приводило к проявлению его цитотоксических свойств и снижению содержания PXR.

В совокупности данные результаты свидетельствуют о том, что индукция PXR при развитии окислительного стресса обусловлена влиянием продуктов пероксидации (в частности МДА) на данный транскрипционный фактор.

Сделанный вывод согласуется с данными литературы. Известно, что короткоцепочечные жирные кислоты, например бутират натрия, могут вызывать индукцию экспрессии гена PXR на клетках линии Caco-2 [22].

На данный момент механизмы индукции PXR продолжают активно изучаться [4]. Для низкомолекулярных веществ наиболее вероятным механизмом является их связывание с аналогичными рецепторами ксенобиотиков (например, Farnesoid X receptor) и повышение транскрипции гена PXR.

Повышение количества PXR при развитии окислительного стресса может иметь двоякое значение. С одной стороны, PXR может способствовать генерации АФК и повреждению клеток за счет индукции изоферментов цитохрома Р450 (CYP2B1/2B2, CYP3A1/3A2 и CYP2C6) и интенсификации метаболизма ксенобиотиков [23]. С другой – PXR может иметь приспособительную функцию, так как данный транскрипционный фактор стимулирует экспрессию антиоксидантного фермента глутатион-S-трансферазы [24].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе исследования на клетках линии Caco-2 было показано, что H₂O₂ в концентрациях при 10, 50 и 100 мкМ при длительности экспозиции 24 ч вызывает повышение количества PXR, что сочетается с увеличением концентрации продуктов липопероксидации (ПОЛ). Продолжение воздействия пероксида водорода до 72 ч сопровождается нарастанием концентрации продуктов ПОЛ и снижением количества PXR до показателей контроля (10 мкМ) или ниже него (50 и 100 мкМ). Инкубирование клеток с МДА в концентрации 10 мкМ также приводит к индукции PXR, что свидетельствуют о том, что индукция PXR при развитии окислительного стресса обусловлена влиянием продуктов пероксидации (в частности МДА) на данный транскрипционный фактор.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук МК-1856.2020.7.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.