Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2022, T. 39, № 2, стр. 116-125

ВВЕДЕНИЕ

Основной вклад в процесс выведения кальция из нейронов и глиальных клеток в центральной нервной системе вносит натрий-кальциевый обменник (NCX) плазматической мембраны. Дисфункции NCX вовлечены в патогенез разнообразных нейродегенеративных и психических заболеваний: инсульта и ишемии [1–3], различных форм склероза [4, 5], болезни Альцгеймера [6], эпилепсии [7], нейропатической боли [8] и других. Различные изоформы NCX экспрессированы в плазматической мембране большинства живых клеток, где они осуществляют транспорт кальция путем обмена одного иона Ca²⁺ на три иона Na⁺ за счет натриевого градиента плазматической мембраны [9]. Такая стехиометрия объясняет электрогенность, так как за один транспортный цикл переносится 1 положительный заряд (число переноса для Na⁺ = 1). В нейронах в основном экспрессируются изоформы NCX1 и NCX3 [10]. NCX3, в отличие от NCX1, может функционировать в отсутствии ATP [11], что увеличивает выживаемость нейронов при ишемическом падении уровня ATP и стрессе, вызываемом гиперактивацией глутаматом [12]. Существует также калий-зависимый натрий-кальциевый обменник (NCKX), изоформы которого экспрессируются некоторыми подтипами нейронов (см. обзор [13]). Вклад NCKX в транспорт кальция особенно заметен в нейронах сетчатки, мозжечка и гиппокампа, но незначителен в нейронах коры [13, 14]. Кроме того, NCKX нечувствителен к действию селективного блокатора NCX KB-R7943 (KBR), поэтому его ток в нейронах нельзя выявить с помощью этого блокатора [15].

В нормальных условиях NCX выводит кальций из цитоплазмы наружу клетки (прямой режим работы) и генерирует входящий ток. При падении натриевого градиента (повышение внутриклеточной концентрации Na⁺) NCX переходит в обратный режим работы, закачивая кальций в клетку, и создает выходящий трансмембранный ток.

Распространенным модельным объектом для изучения функций NCX являются кардиомиоциты как клетки с чрезвычайно высокой конститутивной экспрессией обменника [16]. Транспортный ток NCX ингибируется ионами никеля [17]. Большинство электрофизиологических работ выполнено на кардиомиоцитах или в искусственных системах с гиперэкспрессией заданных изоформ NCX: HEK293 [18], CCL39 [19], BHK [20] клетках. Имеются единичные публикации, в которых изучались вольт-амперные характеристики (ВАХ) транспортных токов NCX, нативно экспрессированного нейронами гиппокампа [21, 22] или коры [1]. В этих работах авторы применяли неспецифические ингибиторы NCX – никель, ифенпродил и Ro 25-6981, а не селективные блокаторы подобные KBR или SN6.

Влияние KBR и лития на функционирование NCX в нейронах представляет большой интерес, поскольку ранее было показано, что KBR [23], а также ионы лития [24] непрямым образом усиливают кальций-зависимую десенситизацию NMDA-рецепторов, по-видимому, за счет подавления работы NCX, колокализованного с рецепторами в мембранных плотиках [24, 25]. При этом литий используется в настоящее время как лекарственный препарат для терапии нервных и психических расстройств [26]. Имеются экспериментальные данные, что KBR способен подавлять вызываемую 4-аминопиридином эпилептиформную активность в коре мозга крыс [27]. Сходным кальций-зависимым эффектом на NMDA-рецепторы обладают также и другие потенциальные модуляторы NCX, в частности этанол [28] и амитриптилин [29]. Таким образом, управляя уровнем примембранного внутриклеточного кальция, NCX способен модулировать функционирование возбуждающей глутаматергической синаптической передачи в нервной системе.

Ингибиторы NCX, в частности KBR, одинаково эффективно блокируют как обратный, так и прямой режим работы обменника [16]. В отсутствие активной генерации потенциалов действия концентрация внутриклеточного кальция в нейронах не достигает порога активации NCX (cм. обзор [30]). В связи с этим применение ингибиторов NCX позволяет выявлять только ток, соответствующий обратному режиму работы обменника. Для выявления прямого режима работы NCX требуется загрузка кальция в цитоплазму в качестве субстрата для транспорта [1, 16] и снижение концентрации внеклеточного кальция [16].

Следует отметить, несмотря на значение NCX в поддержании внутриклеточного Ca²⁺-баланса нейронов и возможное применение его антагонистов в качестве лекарственных препаратов, действие селективных блокаторов NCX и ионов лития на его электрогенный транспорт в нейронах ранее не изучалось. Учитывая ключевую роль регуляции внутриклеточного Ca²⁺ в мембранных микродоменах нейронов для функционирования синаптической передачи и десенситизации NMDA-рецепторов, прямое измерение транспортного тока NCX в нейронах представляет большой интерес. В настоящем исследовании на нейронах коры и HEK293 клетках мы выявляем трансмембранные токи, создаваемые NCX в клетках культуры ткани, с использованием селективных ингибиторов обменника KBR и SN6, а также различных концентраций ионов лития как нетранспортируемого субстратного ингибитора NCX [31].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на первичной культуре нейронов коры большого мозга, полученного из эмбрионов крыс линии Вистар [32]. На 16–17 день пренатального развития (E16–E17) выделяли ткань неокортекса и культивировали при 37°C и 5% CO₂ в питательной среде Neurobasal (Invitrogen, США) c ростовой добавкой B-27 (Invitrogen) на покровных стеклах, покрытых поли-D-лизином.

Часть экспериментов выполняли на культуре клеток HEK293, которые высаживали на стекла, покрытые поли-L-лизином, как было описано ранее [33, 34].

Эксперименты на нейронах проводили на 10–14 день культивирования, а опыты на клетках HEK293 через сутки культивирования. В опытах применяли внеклеточный раствор следующего состава (мМ): NaCl 144, KCl 2.8, HEPES 10, CaCl₂ 1, MgCl₂ 1 (pH 7.2–7.4, доводили NaOH). Кроме того, во внеклеточный раствор добавляли нифедипин 10 мкМ и тетродотоксин 100 нМ для блокады кальциевых и натриевых потенциал-чувствительных каналов. В ряде экспериментов применяли внеклеточный раствор, в котором NaCl был заменен на LiCl в эквимолярных количествах для субстратного ингибирования работы NCX. Использовали два пипеточных раствора: (1) без добавления кальция и (2) с высоким содержанием свободного кальция ([Ca²⁺]_i > 1000 нМ), чтобы обеспечить внутриклеточный субстрат для работы NCX в прямом режиме работы. Раствор (1) следующего состава (мМ): CsF 120, CsCl 10, HEPES 10, EGTA 10, ATP-Na 2 (pH 7.2–7.4, доводили с помощью CsOH). Ожидаемая внутриклеточная концентрация свободного кальция <100 нМ. Раствор (2) следующего состава (мМ): CsF 120, CsCl 10, HEPES 10, EGTA 10.5, CaCl₂ 10, ATP-Na 2 (pH 7.2–7.4, доводили с помощью CsOH). Вычисленная концентрация свободного кальция в растворе (2) составляла 1240 нМ (MAXCHELATOR software by Chris Patton). В пипеточном растворе обязательно присутствовала ATP, необходимая для работы NCX (см. обзор [30]). Экспериментально измеренный [35] жидкостный потенциал между внеклеточным и пипеточным раствором (liquid junction potential, LJP) составил около 10 мВ. Данные в статье приведены с учетом коррекции на LJP.

Используя протоколы плавного пилообразного (ramp-протокол) и скачкообразного (step-протокол) изменения мембранного потенциала (V_m), измеряли ВАХ клеток. Регистрацию трансмембранных токов нейронов проводили методом patch-clamp в конфигурации “целая клетка” с использованием стеклянных микропипеток (Sutter BF150-86-10) с сопротивлением кончика 4–6 МОм. Регистрацию токов осуществляли при помощи усилителя MultiClamp 700B (Molecular Devices, США) с системой сбора данных DigiData 1440A под управлением программы pClamp 10. Быструю смену внеклеточного раствора проводили системой быстрой локальной перфузии с многоканальным кончиком, расположенным в 300–500 мкм от сомы регистрируемого нейрона.

Для сравнения групп, состоящих из нескольких опытов, применяли парный критерий Стьюдента. Группы измерений считали достоверно различающимися при уровне доверительной вероятности p < 0.05. На графиках звездочками показаны различные уровни статистически значимых различий: *p < 0.05, **p < 0.01.

Для выявления токов NCX применяли его специфические блокаторы (Tocris, Великобритания): KB-R7943 (KBR, 2-[2-[4-(4-нитробензилокси)фенил]этил]изотиомочевина метан сульфонат) и SN6 (2-[[4-[(4-нитрофенил)метокси]фенил]метил]-4-тиазолидинкарбоксиловая кислота этиловый эфир). Остальные реактивы поставлены Sigma-Aldrich, США.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для выявления токов NCX в нейронах применяли селективные ингибиторы KBR или SN6 в концентрации 10 мкМ, заведомо и многократно превышающие значения IC₅₀ ингибирования обменника. Применяли пипеточный раствор (1), не содержащий кальция. Запись ВАХ нейрона в конфигурации целой клетки в диапазоне от –100 до +60 мВ (рис. 1а) показала обратимое уменьшение тока при аппликации и последующей отмывке обоих ингибиторов (рис. 1б). Разница токов (a – b) в контроле и в присутствии ингибиторов (рис. 1в) соответствовала вкладу транспортного тока, переносимому NCX, в ВАХ нейронов. Усредненные по нескольким нейронам значения токов NCX выявили одинаковый эффект KBR и SN6. Наибольшая величина ингибирования тока NCX выявлялась при положительных потенциалах, а потенциал реверсии составил V_rev ≈ –30 мВ.

Рис. 1.

Вольт-амперные характеристики (ВАХ) нейронов коры, полученные при плавном изменении мембранного потенциала в контроле и при ингибировании тока обменника специфическими блокаторами. а – Экспериментальный протокол изменения командного потенциала от –100 до +60 мВ. б – ВАХ трансмембранных токов при применении командного потенциала (а), зарегистрированные в контроле (Кон.), в присутствии KBR (10 мкМ) или SN6 (10 мкМ) и после отмывки ингибиторов (Отм.). в – Получение ВАХ NCX как разности токов (a – b) в отсутствие (а) и присутствии (b) во внеклеточном растворе ингибиторов NCX. г – Наложение средних ВАХ транспортных токов NCX, полученных из нескольких опытов: KBR (n = 6), SN6 (n = 6). Области с заливкой иллюстрируют стандартную ошибку среднего.

KBR и SN6 считаются ингибиторами обратного режима работы NCX, наблюдаемого при положительных потенциалах, что соответствует выходящему току обменника и входу кальция в цитоплазму. Однако при использовании обычного пипеточного раствора, не содержащего кальций, при отрицательных мембранных потенциалах NCX испытывает дефицит внутриклеточного субстрата, т.е. ионов Ca²⁺, для транспорта во внеклеточное пространство. В результате в наших экспериментах ингибирование транспортного тока NCX при V_m < V_rev в 5–30 раз слабее, чем при V_m > V_rev.

Для того чтобы выявить прямой режим работы обменника, нами был использован пипеточный раствор (2) с расчетной концентрацией свободного кальция >1000 нМ, что многократно превышает K_d связывания кальция обменником (~200 нМ для NCX1, [36]) (рис. 2а). При использовании бескальциевого внутриклеточного раствора наблюдается изгиб ВАХ ингибирования обменника при отрицательных значениях V_m (рис. 2б), а в присутствии высокой концентрации внутриклеточного кальция KBR демонстрирует приблизительно одинаковую степень ингибирования тока, создаваемого NCX, при положительных и отрицательных мембранных потенциалах. Таким образом, повышение цитоплазматического кальция позволяет выявить прямой транспортный ток NCX при отрицательных значениях V_m.

Рис. 2.

Вольт-амперные характеристики (ВАХ) транспортных токов NCX нейронов коры, полученные при ингибировании тока обменника 10 мкМ KBR. a – ВАХ нейронов, зарегистрированные в контроле (a) и в присутствии KBR (b) при использовании пипеточного раствора без кальция (слева) и пипеточного раствора с содержанием свободного кальция >1000 нМ (справа). Разница токов a – b характеризует транспортный ток NCX, ингибируемый блокатором. б – Наложение средних ВАХ обменника, полученных из нескольких опытов для пипеточных растворов с низким ([Ca²⁺]_i < 100 нМ, n = 8) и высоким ([Ca²⁺]_i > 1000 нМ, n = 5) содержанием свободного кальция. Области с заливкой иллюстрируют стандартную ошибку среднего.

Еще одним способом ингибирования работы NCX является замена ионов Na⁺ во внеклеточном растворе на ионы Li⁺, которые не транспортируются обменником [31]. Частичная 15% замена Na⁺ на Li⁺ ингибировала трансмембранный ток, демонстрируя ВАХ ингибированного тока, сходную с таковой у NCX по форме и величине потенциала реверсии (рис. 3а). Однако ВАХ тока, ингибируемого более высокими концентрациями лития 50 и 100%, демонстрировали отсутствие тока или вход тока при положительных потенциалах мембраны, что не соответствует работе NCX. По-видимому, это связано с тем, что в нейронах внеклеточный Li⁺ ингибирует все натрий-зависимые процессы, включая транспортеры нейромедиаторов, и сопровождается неквантовым освобождением глутамата [37]. При этом затруднено выявление транспортных токов NCX из-за падения входного сопротивления клеток. Для того чтобы оценить, является ли ток, ингибируемый литием, током NCX хотя бы при 15% замене Na⁺ на Li⁺, мы сравнили эффект KBR в контроле и в присутствии 15% Li⁺. В отсутствие Li⁺ KBR ингибировал ток, создаваемый NCX, на ~60 и ~130 пА при мембранных потенциалах –70 и +50 мВ соответственно. Однако в присутствии 15% Li⁺ KBR ингибировал ток только на ~13–15 пА при тех же мембранных потенциалах (рис. 3б). Таким образом, ингибирование KBR тока NCX в присутствии Li⁺ многократно ослабевает, что говорит в пользу ингибирования литием тока NCX.

Рис. 3.

Вольт-амперные характеристики (ВАХ) ингибирования литием натрий-зависимых транспортных токов, полученные на нейронах с применением различных протоколов при разных концентрациях внеклеточного лития. а – Усредненные ВАХ (n = 5) тока, ингибируемого в отдельном нейроне различными концентрациями лития. Вставка демонстрирует ramp-протокол применения командного потенциала. б – Усредненные ВАХ (n = 5) тока, ингибируемого 15% литием и 15% литием в присутствии 10 мкМ KBR, полученные при применении протокола (а). в – Протокол изменения командного потенциала ступеньками напряжения (step-протокол) и пример токов, ингибируемых различными концентрациями лития. г – Средние значения (n = 6) токов, ингибируемых в нейронах различными концентрациями лития, полученные при применении протокола (в).

При использовании протокола плавного изменения командного потенциала (ramp-протокола) возникает вопрос о том, достигает ли ток обменника равновесия при каждом конкретном потенциале. Применение другого экспериментального протокола (step-протокола), в котором трансмембранные токи измеряли не при плавном изменении командного потенциала, а при использовании ступенек напряжения длительностью 200 мс и с шагом в 20 мВ от +60 до –120 мВ (рис. 3в) дает обменнику достаточное время для достижения равновесия. Сходные методики регистрации ВАХ ионных каналов широко применялись ранее, например, на астроцитах [38].

При использовании step-протокола были получены ВАХ (рис. 3г), не отличающиеся от ВАХ, полученных с использованием ramp-протокола, как по форме, так и по величине потенциала реверсии (V_rev ramp: –22 ± 4 мВ, n = 5; V_rev step: –19 ± 5, n = 6). Совпадение результатов указывает на рациональность использования обоих методов в наших экспериментах.

Вероятнее всего, на нейронах в условиях замены половины или всего внеклеточного Na⁺ на Li⁺ трудно выявить транспортный ток, соответствующий NCX, на фоне токов других натрий-зависимых обменников и ионных каналов. Таким образом, несмотря на ингибирование NCX литием, измерение токов NCX с его помощью в нейронах методически проблематично.

Для количественной оценки ингибирования тока NCX литием были использованы клетки линии HEK293 (рис. 4), обладающие достаточно высокой нативной экспрессией NCX1 [39], но не имеющие большинства натрий-зависимых обменников и ионных каналов, присущих нейронам. С использованием внутриклеточного раствора (2) с высоким содержанием Ca²⁺ мы провели измерение ВАХ тока, ингибируемого литием при использовании возрастающих концентраций лития (15, 50 и 100%) (рис. 4а). Степень ингибирования трансмембранного тока была пропорциональна концентрации ионов лития, а потенциал реверсии тока составил примерно –25 мВ (рис. 4б). При сравнении средних значений амплитуды ингибированных токов обменника при V_m = +50 мВ блокатором KBR и 100% заменой Na⁺ на Li⁺ (рис. 4в) достоверно не различалась (рис. 4г). При этом 15% замена Na⁺ на Li⁺ ингибировала ток обменника приблизительно наполовину от полного ингибирования (**p = 0.003, n = 4), так как KBR вызывал дополнительное ингибирование на фоне 15% Li⁺ (*p = 0.04, n = 4) (рис. 4в, 4г). На фоне 100% замены Na⁺ на Li⁺ дополнительного ингибирования тока при действии KBR не наблюдалось (рис. 4в, 4г), что говорит о полном ингибировании NCX в отсутствие внеклеточного Na⁺.

Рис. 4.

Вольт-амперные характеристики (ВАХ) транспортных токов NCX, нативно экспрессированного клетками HEK293, полученные при ингибировании обменника различными концентрациями лития. Использован пипеточный раствор с концентрацией свободного кальция >1000 нМ. а – Протокол изменения командного потенциала ступеньками напряжения (step) и пример токов, ингибируемых различными концентрациями лития. б – Средние значения токов, ингибируемых в нейронах различными концентрациями лития, полученные при применении протокола (а) (n = 5). в – Пример ВАХ токов, ингибируемых в отдельной клетке при применении 10 мкМ KBR, 100% и 15% замены Na⁺ на Li⁺ (левая панель), а также при применении KBR на фоне 15% или 100% замены Na⁺ на Li⁺ (правая панель). г – Средние значения амплитуды токов, ингибируемых KBR или Li⁺ при мембранном потенциале +50 мВ. Статистические различия групп по критерию Стьюдента (**p = 0.003, n = 4; *p = 0.04, n = 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

В исследовании на нейронах коры мы показали, что регистрация трансмембранных токов в нейронах позволяет выявлять транспортные токи NCX при использовании селективных блокаторов последнего, в частности KBR и SN6. Различные методики применения командного потенциала – плавное (ramp-протокол) и ступеньки напряжения (step-протокол), демонстрируют одинаковую картину ВАХ транспортных токов обменника, несмотря на то что step-протокол дает обменнику больше времени для достижения равновесия. Если бы при применении ramp-протокола создаваемый обменником транспортный ток не достигал равновесия, мы наблюдали бы разницу ВАХ NCX между ramp- и step-протоколами. Такого расхождения не обнаружено.

Из уравнения потенциала реверсии NCX: V_rev = = RT/F(3 ln([Na⁺]_out/[Na⁺]_in) – ln([Ca²⁺]_out/[Ca²⁺]_in)), учитывая [Na⁺] = 2 мМ в пипеточном растворе и предполагая [Ca]_in = 100 нМ, можно было бы ожидать значительного сдвига V_rev в область положительных потенциалов: V_rev = 25 мВ(3 ln(144/2) – ‒ ln(1/0.000100)) = +90 мВ. Однако экспериментально измеренный потенциал реверсии был в районе –30 мВ. Вероятно, это связано с отсутствием полного диализа цитоплазмы и существенной разницей между концентрацией ионов в пипеточном растворе и в примембранной области. В частности, даже при [Na⁺] = 2 мМ в пипеточном растворе, его вычисленное значение в примембранной области цитоплазмы может составлять около 17 мМ [40].

При использовании обычного пипеточного раствора без кальция можно выявить ток обменника только в обратном режиме работы (выход натриевого тока и вход кальция). Пипеточный раствор с высоким (>1000 нМ) содержанием свободного кальция позволяет смоделировать условия, требующие активации NCX и выявлять прямой режим работы NCX при потенциале покоя менее –70 мВ.

Мы не наблюдали значительного изменения потенциала реверсии NCX при многократном увеличении концентрации кальция в пипеточном растворе, что вероятно объясняется тем, что для сохранения постоянства V_rev многократное увеличение [Ca²⁺]_in может быть скомпенсировано физиологически нормальным увеличением [Na⁺]_in.

При работе на нейронах частичная 15% замена внеклеточного Na⁺ на Li⁺ вызывает ингибирование тока обменника, что уменьшает эффективность KBR. Однако концентрация ионов лития >15% вызывает ингибирование также других электрогенных натрий-зависимых обменников и ионных каналов, токи которых суммируются с током обменника, что не позволяет измерять транспортный ток NCX в “чистом” виде.

Клетки HEK293 не экспрессируют большинство присущих нейронам натрий-зависимых обменников (NCKX, транспортеры глутамата EAAT, транспортеры ГАМК) или ионных каналов (ионотропные рецепторы медиаторов, потенциал-зависимые натриевые и кальциевые каналы). На этих клетках частичная замена Na⁺ на Li⁺ во внеклеточном растворе вызывала ингибирование тока NCX. При этом степень ингибирования была прямо пропорциональна внеклеточной концентрации ионов Li⁺. Полная 100% замена Na⁺ на Li⁺ ингибировала ток обменника полностью, поэтому добавление KBR не вызывало дополнительного ингибирования. Напротив, 15% замена Na⁺ на Li⁺ частично ингибировала ток NCX, так что на фоне 15% [Li⁺] KBR вызывал дополнительное ингибирование.

Ранее нами было показано, что KBR и Li⁺ вызывают значительное уменьшение токов через NMDA-рецепторы за счет усиления кальций-зависимой десенситизации последних [23, 24]. При этом сами по себе KBR и Li⁺ не вызывали ингибирования токов рецепторов в отсутствие внеклеточного кальция. Полумаксимальные эффективные концентрации ингибирования NMDA-рецепторов KBR (5.3 мкМ) [23] и Li⁺ (32% замена Na⁺ на Li⁺) [24], измеренные в присутствии 1 мМ Ca²⁺, соответствуют полумаксимальным эффективным концентрациям ингибирования этими веществами NCX. Это подтверждает большое функциональное значение NCX в модуляции функций рецепторов, подверженных кальций-зависимой десенситизации.

Таким образом, замена Na⁺ на Li⁺ во внеклеточном растворе позволяет эффективно ингибировать токи NCX как в нейронах, так и в клетках HEK293. Следует отметить, что нативные HEK293 клетки являются хорошим объектом для исследования NCX, так как их ВАХ имеют значительный компонент, обеспечиваемый транспортными токами. В отличие от HEK293, на нейронах замена Na⁺ на Li⁺ ингибирует не только NCX, но и другие электрогенные транспортные механизмы, что затрудняет выявление транспортных токов NCX.

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-515-18 008 Болг_а). Работа выполнялась в рамках государственного задания ИЭФБ РАН тема AAAA-A18-118012290427-7. Работа выполнена с использованием ресурсов центра коллективного пользования ИЭФБ РАН.

Соответствие принципам этики. Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.