Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2022, T. 39, № 3, стр. 195-204

ВВЕДЕНИЕ

Возбудимость представляет одно из фундаментальных свойств живых клеток. Генерация потенциала действия (ПД) в клетках растений сопровождается повышением уровня Ca²⁺ в цитоплазме, что оказывает влияние на синтез фитогормонов [1], приводит к закрыванию листьев у сейсмочувствительных и насекомоядных растений [2, 3], вызывает изменения дыхания и фотосинтеза [4, 5]. Влияние возбудимости на фотосинтез отчетливо проявляется по изменениям флуоресценции (Фл) хлорофилла (Хл) в междоузлиях харовых водорослей на ярком свету, при котором на поверхности клетки поддерживаются чередующиеся кислые и щелочные зоны с перепадами рН от 6.5 до 10 [6, 7]. Генерация ПД временно устраняла эти неравновесные структуры, а также снижала квантовую эффективность фотосистемы II (ФСII) и линейный поток электронов в области щелочных зон, но оказывала слабое влияние на хлоропласты, расположенные под наружными кислыми зонами [8]. Показано, что наблюдаемое снижение максимальной флуоресценции $F_{{\text{m}}}^{{\text{'}}}$ обусловлено возрастанием ΔрН на тилакоидных мембранах освещенных хлоропластов и усилением тепловых потерь в антенне (нефотохимическое тушение) после генерации ПД [6]. Неоднородный профиль рН в клетках Chara исчезает в темноте, но пространственная неоднородность в распределении некоторых органелл (харасомы) [9] сохраняется в течение 7–10 сут. Еще более устойчивы к долгому затенению кристаллы солей кальция на поверхности клеточной стенки, которые осаждаются на свету в области наружных щелочных зон. Cведения о влиянии возбудимости на фотосинтез и Фл Хл в клетках Chara на слабом свету в условиях сглаживания продольного профиля наружного рН в настоящее время отсутствуют.

При низкой освещенности, недостаточной для развития нефотохимического тушения (NPQ), влияние возбуждения плазматических мембран на хлоропласты может включать регуляторные пути, основанные на изменении редокс-состояния пула пластохинонов (PQ) и первичного хинонного акцептора ФСII Q_A. Сведения о влиянии возбудимости мембран на состояние переносчиков электронов между фотосистемами остаются пока единичными. На листьях венериной мухоловки обнаружено переходное возрастание фактической флуоресценции хлорофилла (F ', F или F_t в разных обозначениях) после индукции ПД при низкой интенсивности света, что указывает на временное восстановление Q_A и пула PQ [10, 11]. В условиях слабого стационарного освещения (при отсутствии NPQ), когда значения максимальной и минимальной флуоресценции $F_{{\text{m}}}^{{\text{'}}}$ и F_o поддерживаются на постоянном уровне, изменения флуоресценции F  ' служат удобным показателем фотохимического тушения q_P в ФСII. Возрастание F  ' отражает восстановление Q_A и увеличение доли закрытых реакционных центров, а снижение F  ' соответствует увеличению содержания окисленной формы Q_A. Сглаживание неоднородного профиля рН в примембранных слоях среды при низких интенсивностях света исключает масштабные изменения наружного рН в качестве переменной величины и упрощает интерпретацию процессов, запускаемых в хлоропластах при возбуждении.

Влияние ПД на фотосинтетическую функцию включает два важных фактора. Повышение концентрации Ca²⁺ в цитоплазме харовых водорослей при генерации ПД (от 0.1 до 10–40 мкМ) [12, 13] сопровождается светозависимым поглощением Ca²⁺ хлоропластами и возрастанием уровня Ca²⁺ в строме [14], что ведет к подавлению фотосинтетической фиксации CO₂ [15]. Кроме того, влияние ПД на активность хлоропластов включает еще одно, ранее не включенное в обсуждение обстоятельство. Повышение уровня Са²⁺ в цитозоле во время потенциала действия вызывает временную остановку течения цитоплазмы [16], что вероятно модифицирует обмен веществ между хлоропластами и цитоплазмой, а также концентрации метаболитов в потоке жидкости. Эти события могут проявляться в дальних межхлоропластных взаимодействиях, опосредованных круговым течением цитоплазмы. Изучение индуцируемых потенциалом действия изменений F ' позволит понять, как сказывается временное прерывание течения цитоплазмы на распределении метаболитов, доставляемых с потоком к исследуемым хлоропластам.

О существовании дальних опосредованных циклозом взаимодействий между неподвижными хлоропластами в гигантских клетках Chara говорят резкие различия индукционных кривых Фл Хл в условиях освещения всего междоузлия в сравнении с освещением небольшого (диаметр ~2 мм) участка клетки, а также исчезновение этих различий после остановки течения цитоплазмы под действием ингибитора актина – цитохалазина D [17, 18]. Аналогичный подход – сравнение ответных реакций хлоропластов на генерацию ПД в условиях общего и локального освещения – может оказаться полезным для выявления дальних внутриклеточных взаимодействий, участвующих в передаче сигнала от возбудимых мембран к фотосинтетическому аппарату.

В данной работе изучали влияние генерации потенциала действия на изменения Фл Хл в клетках междоузлий харовой водоросли, экспонированных на слабом свету, достаточном для поддержания фотосинтетического аппарата в активном состоянии. Наряду со стационарным фоновым освещением всей клетки, использовали длительное (>10 мин) локальное освещение небольшого участка, которое сопровождается инактивацией светозависимых транспортеров оболочки у хлоропластов, расположенных вне освещаемой области. В итоге выявлена неоднородность ответных реакций хлоропластов разных участков клетки на генерацию ПД и установлена важная роль транспортеров оболочки и микрофлуидного транспорта в динамике изменений редокс-состояния фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) при возбуждении плазматических мембран.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Эксперименты проводили на клетках междоузлий Chara australis R. Br. Водоросли выращивали при рассеянном комнатном освещении. Использовали боковые побеги длиной 25–30 мм и диаметром 0.7–0.9 мм, а также закончившие рост клетки центральной оси длиной до 5 см, которые помещали в искусственную прудовую воду, содержащую 0.1 мМ KCl, 1 мМ NaCl и 0.1 мМ CaCl₂. Значения рН среды доводили до рН 7.0 добавлением раствора бикарбоната натрия. Изолированные клетки выдерживали в искусственной прудовой воде не менее суток после отрезания соседних междоузлий. Некоторые особенности строения клеток Chara – наличие зон кальцификации клеточной стенки, ротационное течение цитоплазмы, плотная однослойная упаковка неподвижных хлоропластов – представлены на рис. 1.

Рис. 1.

Микрофотографии сегментов междоузлия Chara и варианты освещения клетки в ходе эксперимента. Стрелками отмечены встречные направления течения цитоплазмы по разные стороны от линии разделения потоков (узкая полоса цитоплазмы, не содержащая хлоропластов). а – Расположение кальцифицированных и свободных от кристаллов участков на поверхности клетки Chara. Окружностями 1 и 2 отмечены области измерения флуоресценции хлоропластов вдали от мест отложения кристаллов CaCO₃ и на границе с кристаллами соответственно. Верхняя и нижняя части рисунка соответствуют режимам общего освещения всей клетки (I) и локального освещения выбранного участка клетки (II) при затемнении остальных частей клетки. Исходное изображение предоставлено профессором Ilse Foissner (Университет г. Зальцбурга, Австрия). б – Участок плотно упакованного слоя хлоропластов на границе зоны отложения кристаллов. Круговые области 1 и 2 соответствуют выбору мест измерения флуоресценции на разном удалении от кристаллов.

Микрофлуориметрия хлорофилла. Выход фактической флуоресценции хлорофилла F ' измеряли на микроучастке клеток (диаметр ~100 мкм) с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 25-CFL (Zeiss, Германия), оборудованного микрофлуориметром с импульсно-модулированным освещением Microscopy-PAM (Walz, Германия). Перед измерениями препарат адаптировали к слабому фоновому свету, направленному от верхнего осветителя микроскопа через сине-зеленый фильтр (СЗС-22, толщина 5 мм) и нейтральный стеклянный светофильтр (плотность потока квантов на уровне объекта ~10 мкмоль м^–2 с^–1, λ < 580 нм). Низкая интенсивность освещения достаточна для поддержания светозависимых ферментов в активном состоянии, но исключает энергозависимое нефотохимическое тушение. Выход модулированной флуоресценции хлорофилла F ' регистрировали при непрерывном фоновом освещении. Сигнал, поступающий с фотоумножителя, обрабатывали в программе WinControl-3 (Walz), оцифровывали с интервалом ~51 мс аналого-цифровым преобразователем PCI-6024E (National Instruments, США) и записывали на компьютер. Измерения проводили при температуре 21–23°С.

Локальное освещение. Для локального освещения области измерения F ' и окружающих участков использовали гибкий оптоволоконный кабель длиной 10 см с диаметром оптического пучка 2 мм [18, 19]. Один конец оптического кабеля проходил через светозащитный экран; на него падал свет от верхнего осветителя микроскопа. Другой конец кабеля был направлен на клетку сверху. Положение торца оптического кабеля относительно области измерения Фл в горизонтальной плоскости и по вертикали регулировали с помощью микроманипулятора при наблюдении в микроскоп. Для большего сужения освещаемой области препарата применяли одноволоконный кварцевый световод с диаметром 0.4 мм. Интенсивности света, падающего на исследуемую область клетки в режимах общего и локального освещения, отличались незначительно, о чем говорят близкие измеряемые значения F ' для этих экспериментальных условий.

Электростимуляция. Изолированную клетку междоузлия помещали в двухсекционную камеру из оргстекла. Стимулирующие токовые Ag/AgCl электроды располагались в разных отсеках камеры. Пропускание импульса электрического тока (10 мкА, 150 мс) между наружными электродами вызывало возбуждение клетки и временное прекращение течения цитоплазмы. Остановку внутриклеточного потока под влиянием ПД проверяли во всех опытах визуально в проходящем свете. Для этого измерения Фл Хл временно прерывали в начале каждой отдельной записи. Последействие однократного электрического возбуждения на эффективный квантовый выход ФСII продолжается от 10 до 45 мин [6]. В данной работе интервалы между возбуждающими стимулами составляли 10–15 мин. Наружный pH возле кальцифицированных и некальцифицированных участков клеток измеряли с помощью сурьмяных рН-микроэлектродов в стеклянной изоляции, как описано ранее [20].

Усредненные кинетические кривые изменения F ', показанные на рисунках, получены при 2–5-кратном воспроизведении в репрезентативных экспериментах на отдельных клетках. В каждой серии экспериментов использовали не менее четырех клеток. Количество измерений указано в подписях к рисункам.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Возрастание F ' в хлоропластах вблизи зон кальцификации после генерации ПД. Приложение короткого импульса электрического тока между частями клетки, находящимися в разных отсеках экспериментальной камеры, вызывало генерацию потенциала действия (ПД), что проявлялось в резкой остановке течения цитоплазмы. Возобновление потока цитоплазмы начинается примерно через 30 с после генерации спайка, а полное восстановление скорости течения достигается в течение 10–15 мин [21]. Опыты, проведенные на кальцифицированных и свободных от кристаллов участках клеток, выявили качественно различную чувствительность флуоресценции хлоропластов F ' к генерации ПД. В областях, далеких от зон отложения кальциевых кристаллов и занимающих подавляющую часть поверхности клетки, возбуждение плазматических мембран при слабом фоновом освещении (10 мкмоль м^–2 с^–1) не оказывало влияния на уровень Фл Хл (рис. 2а). Вместе с тем, в участках, расположенных вблизи кальциевых отложений, генерация ПД вызывала временное повышение Фл хлоропластов и последующее ее снижение до исходного уровня (рис. 2б, 2в). При выдерживании клеток в темноте генерация ПД не вызывала изменений флуоресценции F '. Переходные изменения Фл Хл проявлялись наиболее ярко в хлоропластах, омываемых потоком цитоплазмы на выходе из зоны инкрустации. На противоположной стороне инкрустированной зоны, где цитоплазма поступала в область кальцификации, изменения Фл Хл после генерации ПД были небольшими или отсутствовали.

Рис. 2.

Различия ответных изменений флуоресценции F ' хлорофилла Chara australis при генерации потенциала действия (ПД) в участках разной локализации: (а) вдали (> 3 мм) от зон кальцификации клеточных стенок; (б, в) на границе с зонами отложения наружных кристаллов кальция. а – Отсутствие влияния ПД на F ' в зонах без инкрустации при низкоинтенсивном освещении (10 мкмоль м^–2 с^–1) всего междоузлия; представлены усредненные записи для пяти клеток. б и в – Примеры вызванных возбуждением изменений F ' при аналогичном освещении всего междоузлия (кривые 1) и небольшого (∅ 2 мм) участка клетки (кривые 2) на границе с зоной отложения кристаллов кальция. В части б представлены усредненные кривые F ' и стандартные ошибки для n = 2–3, а в части в – усредненные кривые для n = 8–9. Стрелками отмечены моменты пропускания электрического тока (~10 мкА, 150 мс), вызывающие генерацию ПД и временную остановку течения цитоплазмы.

На рис. 2б и 2в показаны типичные изменения флуоресценции F ', вызванные генерацией потенциала действия в условиях общего и локального освещения клеток Chara светом слабой интенсивности (10 мкмоль м^–2 с^–1). Измерения проводили на свободных от кристаллов участках клетки, граничащих с зонами кальцификации. При общем стационарном освещении активность светозависимых транспортеров оболочки хлоропластов, отвечающих за накопление Ca²⁺ в строме и перенос восстановительных эквивалентов, сохраняется в пределах всей клетки, а в случае локального освещения активность транспортеров ограничена освещаемой зоной. Как видно из рис. 2б и 2в, пиковые значения F ' после генерации ПД достигались раньше при узком диаметре светового луча (кривые 2), чем при широком поле облучения (кривые 1). Кроме того, при общем освещении возврат F ' к исходному уровню продолжался существенно дольше, чем при локальном освещении области измерения и примыкающих участков. Эти наблюдения позволяют предполагать, что ответные изменения F ' после генерации ПД при общем освещении представляют собой суперпозицию нескольких процессов разной природы.

Повышение F ' после генерации ПД, по-видимому, вызвано подъемом уровня Ca²⁺ в строме освещенных хлоропластов [14] и подавлением фиксации СО₂ [15]. Падение потребления NADPH в реакциях цикла Кальвина понижает содержание акцептора NADP⁺, что замедляет отток электронов от ФСI, способствуя восстановлению PQ и Q_A фотосистемой II и повышению флуоресценции F '. Известно, что медленные стадии индукционных изменений Фл Хл в фотосинтезирующих организмах тесно связаны с использованием NADPH в метаболических процессах [22]. Установлено также, что электроны поступают от NADPH и восстановленного ферредоксина в пул PQ по сегментам циклической цепи (по антимицин А-чувствительному и антимицин-нечувствительному путям) [23], что также повышает уровень F '. Параллельно с этим избыток NADPH удаляется из стромы в цитоплазму посредством транспортеров оболочки (“малатный клапан” и переносчик триозофосфатов) [24, 25].

Отмечая замедленный спад F ' на кривых 1 в сравнении с кривыми 2 на рис. 2б и 2в, следует учитывать, что площадь освещаемой области препарата определяет длину участка клетки, где происходит экспорт восстановителей из освещенных хлоропластов после временной остановки циклоза. При общем освещении содержание восстановительных эквивалентов в цитоплазме повышается в широкой области по всей клетке, тогда как при локальном освещении область повышенного содержания восстановителей в цитоплазме не выходит за пределы освещаемой зоны. Поэтому в период возобновления циклоза после ПД поступление восстановителей из цитоплазмы в строму анализируемых хлоропластов занимает более длительное время в условиях общего, а не локального освещения.

После генерации ПД при общем освещении всей клетки часто наблюдалось начальное снижение уровня F ' (рис. 2в, кривая 1). Появление этой стадии указывает на то, что редокс состояние стромы анализируемых хлоропластов контролируется составом цитоплазмы, поступающей с потоком в зону измерения Фл Хл из области кальциевых отложений, где фиксация СО₂ заторможена. Остановка течения цитоплазмы нарушает микрофлуидную регуляцию, в результате чего редокс-состояние стромы временно смещается на новый уровень за счет диффузии и биохимических реакций.

Генерация ПД выявляет неоднородное продольное распределение фотометаболитов. Различия в кинетике изменений F ', вызванных потенциалом действия в условиях общего и локального освещения клетки лучами равной интенсивности (рис. 2) дают основания полагать, что изменения F ' имеют комплексную природу и обусловлены как внутренними процессами, протекающими в хлоропластах при повышении уровня Ca²⁺ в строме, так и обменом фотометаболитов между подвижной цитоплазмой и стромой хлоропластов. В зависимости от физиологического состояния клеток и экспериментальных условий эти процессы могут перекрываться в большей или меньшей степени. В пользу этого предположения говорит регистрация нескольких компонент в изменениях F ' после генерации ПД (рис. 3).

Рис. 3.

Колебания F ', вызванные генерацией ПД в условиях освещения (а) всей клетки и (б) участка клетки диаметром 2 мм. а: 1 – поддержание F ' на стационарном уровне в покое без приложения возбуждающего стимула; 2 – мультифазные изменения F ', вызванные генерацией ПД. б –Изменения F ' в ответ на генерацию ПД при разных расстояниях от места поступления цитоплазмы в освещаемую зону до области измерения F ': 1 – на удалении 1 мм, 2 – на расстоянии 0.5 мм. Стрелками отмечены моменты приложения возбуждающего электрического стимула. Результаты а и б получены при измерениях на одном и том же участке клетки.

При экспозиции интернодальной клетки на слабом непрерывном свету уровень флуоресценции F ' в покое не претерпевал заметных изменений (рис. 3а, кривая 1). Однако электрическая стимуляция клетки запускала переходные процессы, при которых сигнал F ' менялся во времени колоколообразно и нередко в виде серии колебаний (рис. 3а, кривая 2). Существенно, что число наблюдаемых колебаний F ' сокращалось при сужении освещаемой площади препарата (рис. 3б). При переходе от общего освещения клетки к стационарному воздействию узким (диаметром 2 мм) лучом той же интенсивности и того же спектрального состава число осцилляций в ответной реакции F ' на возбуждение уменьшалось от 3–4 до двух. Кроме того, вторая полоса в серии из двух осцилляций дополнительно ослаблялась при сужении освещаемой области, из которой поступала “облучаемая” цитоплазма в зону измерения флуоресценции (кривые 1 и 2 на рис. 3б). Такое сужение дистанции достигалось путем смещения положения световода, а не области измерения F '. При локальном освещении оптоволокном более узкого диаметра (0.4 мм) ответные изменения F ' на возбуждение включали лишь один максимум, достигаемый через 50–80 с после генерации ПД. Зависимость числа колебаний F ' от размера освещаемой части клетки указывает на то, что второе и последующие колебания обусловлены дальними межхлоропластными взаимодействиями, а именно доставкой восстановительных эквивалентов в хлоропласты анализируемой зоны из соседних освещенных участков клетки. По-видимому, прекращение циклоза усиливает неоднородность продольного распределения восстановительных эквивалентов в цитоплазме, что проявляется в образовании чередующихся пиков F ' (рис. 3а, кривая 2). Это контрастирует с отсутствием изменений на записи F ' от времени при стационарной скорости течения цитоплазмы (рис. 3а, кривая 1).

Зависимость индуцированных изменений F ' от состояния транспортеров оболочки. Для выявления роли транспортеров оболочки пластид в ответных реакциях F ' на генерацию ПД интернодальную клетку помещали в темноту, оставляя фоновое освещение лишь на узком (диаметром 2 мм) участке, по центру которого располагалась область регистрации Фл Хл. Результаты более ранней работы позволяют предполагать, что перенос клетки в темноту сопровождается временным понижением содержания восстановительных эквивалентов в цитоплазме [19], так как ферменты цикла фиксации СО₂ и транспортеры редокс-соединений сохраняют активность на протяжении до десятков секунд в темноте и обеспечивают постсветовую ассимиляцию углекислоты. Как показано на рис. 4, генерация ПД через 2 мин после перехода от общего к локальному освещению не оказывала влияния на уровень Фл хлоропластов. Вместе с тем, в условиях стационарного локального освещения (15–60 мин) возбуждение клетки вызывало переходные изменения F ', которые в данном случае включали две волны возрастания свечения. Полученные результаты дополнительно подтверждают предположение о том, что смена общего на локальное освещение клетки Chara сопровождается временным подавлением дальней сигнализации между хлоропластами и последующим возобновлением передачи сигналов при переходе к новому стационарному режиму [19].

Рис. 4.

Различное влияние генерации ПД на флуоресценцию F ' после (1) короткого (2 мин) и (2) длительного (>15 мин) затенения всего препарата, за исключением небольшого (∅ 2 мм) участка клетки, экспонируемого на фоновом свету стандартной интенсивности. Стрелкой отмечен момент приложения электростимула и генерации ПД. Записи 1 и 2 получены для n = 2 и n = 4 соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты данной работы показывают, что наличие щелочных зон с рН 10–10.5 на поверхности освещенных клеток Chara не является необходимым условием для трансформации электрического сигнала плазматической мембраны, приводящей к изменению состояния фотосинтетических мембран. Вместе с тем, ответные реакции F’ хлоропластов на возбуждение плазмалеммы проявлялись преимущественно вблизи участков наружной кальцификации, т.е. в местах возникновения наружных щелочных зон на свету повышенной интенсивности, и отсутствовали в фотосинтетически активных зонах, свободных от кристаллов кальция. Несмотря на отсутствие высокоамплитудных сдвигов рН на поверхности клетки в условиях слабого освещения, рН в области расположения кристаллов был на 0.5–0.75 ед. выше (вследствие гидратации CaCO₃), чем на поверхности некальцифицированных участков и в объеме раствора. Известно, что смещение наружного рН в щелочную сторону повышает проводимость плазмалеммы для Н⁺ или ОН^–, увеличивая входящий поток Н⁺ (или выход ОН^–) [26], что может вызывать подкисление цитоплазмы. Поэтому вполне вероятно, что хлоропласты, лежащие вблизи кристаллов кальция и вдали от них, окружены цитоплазмой с неравными уровнями рН, причем повышенные значения рН стромы более благоприятны для фиксации СО₂.

Известно также, что участки под зонами инкрустации отличаются от свободных областей отсутствием харасом – особых органелл, представляющих собой инвагинации плазмалеммы, обогащенные Н⁺-ATP-азой [9]. Значительное преобладание харасом и Н⁺-насосов в зонах, лишенных кристаллов, и их отсутствие в местах отложения нерастворимых солей кальция может вносить дополнительный вклад в неравномерное распределение Н⁺ в цитоплазме по длине междоузлий. Структурные и биохимические различия кальцифицированных и свободных от кристаллов областей, по-видимому, лежат в основе неодинаковых реакций хлоропластов в этих зонах на генерацию ПД. Участки с высоким содержанием харасом, соответствующие наружным кислым зонам, отличаются повышенным уровнем Са²⁺-связывающих белков в мембранных фракциях [27], что может сглаживать изменения [Ca²⁺] в цитоплазме таких доменов во время потенциала действия. С другой стороны, во фракции мембран щелочных (кальцифицированных) участков выявлено повышенное содержание фотосинтетических белков [27], что может определять высокую чувствительность флуоресценции F  ' хлоропластов в этих областях к индуцированному возбуждением повышению концентрации Ca²⁺ в цитоплазме.

Изменения F ', вызванные генерацией ПД при общем освещении, часто проявляются в виде размытой полосы с характерной длительностью от 100 до 300 с на уровне половины высоты. Вместе с тем, в кинетике ответа нередко присутствовали локальные минимумы или узкие индивидуальные полосы (рис. 3, 4). Число пиков в изменениях F ' после генерации ПД сокращалось с уменьшением освещаемой площади препарата. При локальном освещении анализируемой области лучом с диаметром 0.4 мм ответная реакция F ' включала только один ранний пик. Это говорит о том, что относительно быстрые изменения F ' после генерации ПД отражают внутренние процессы в хлоропластах, протекающие в период остановки циклоза до возобновления активного движения цитоплазмы. В отличие от этого, последующие задержанные стадии связаны с восстановлением течения цитоплазмы, переносом фотометаболитов в потоке жидкости и их обменом между подвижной цитоплазмой и неподвижными хлоропластами. Дальние опосредованные течением цитоплазмы взаимодействия в интернодальных клетках Chara отчетливо выявляются по различиям индукционных кривых Фл Хл, вызываемых локальным и общим освещением [17, 18].

Предполагаемая схема влияния ПД на флуоресценцию F ' включает нарастание [Ca²⁺] в цитоплазме [12], поступление Са²⁺ в хлоропласты по механизму светозависимого унипорта [28], подавление фиксации СО₂ [29], сопряженное с повышением содержания NADPH в строме, торможение в связи с этим линейного потока электронов, а также восстановление PQ и Q_A при переносе электронов от NADPH в пул PQ при участии оксидоредуктазы NDH (NAD(P)H-dependent dehydrogenase complex) [22, 23] и антимицин А-чувствительного сегмента циклической ЭТЦ [30]. Одним из элементов рассматриваемой схемы служит экспорт избытка восстановительных эквивалентов в период временного Са²⁺-зависимого подавления реакций цикла Кальвина, что повышает содержание восстановителей в цитоплазме. После возобновления циклоза восстановительные эквиваленты поступают по градиенту концентрации из обогащенной цитоплазмы в хлоропласты, где содержание NADPH и фотосинтетическая фиксация СО₂ нормализуются в связи с удалением избытка Са²⁺ посредством Са²⁺/Н⁺-антипорта тилакоидных мембран [15].

Наблюдения нескольких волн возрастания F ' после генерации ПД говорят о том, что восстановительные эквиваленты, накапливаемые в цитоплазме в период остановки движения цитоплазмы, распределены неравномерно в осевом направлении. В случае их равномерного распределения изменения F ' проявляются в виде одной размытой полосы с затянутой стадией спада свечения. У клеток в состоянии покоя уровень фотометаболитов в цитоплазме, по-видимому, также распределен неравномерно, однако в стационарных условиях эта неравномерность остается скрытой. Она выявляется при индуцированной возбуждением остановке цитоплазмы. В частности, начальное снижение F ' после генерации ПД при общем освещении всей клетки указывает на то, что редокс-состояние хлоропластов вблизи зоны расположения кристаллов кальция при стационарном потоке смещено в сторону избытка восстановителей, но это смещение устраняется при остановке циклоза. Такое объяснение представляется обоснованным, поскольку хлоропласты в зоне инкрустации возможно экспортируют большее количество восстановителей в текущую цитоплазму из-за пониженного содержания доступного СО₂ в области наружных щелочных зон [20]. Таким образом, возбуждение клеточных мембран позволяет выявить неоднородность распределения фотометаболитов по длине клетки. Не исключено также, что временная остановка течения цитоплазмы усиливает неоднородность распределения метаболитов, что проявляется в последовательном возникновении нескольких волн возрастания F ' после генерации ПД.

Учитывая положение первого пика F ' во времени на рис. 3 и 4, а также тот факт, что движение цитоплазмы становится заметным лишь через 30 с после генерации ПД, становится очевидным, что первый фронт нарастания F ', в отличие от последующей волны, происходит в период остановки циклоза. Поэтому первая волна отражает изменение редокс-состояния стромы за счет внутренних процессов в хлоропластах. Предполагая на основе рис. 3 и 4, что вторая волна изменений F ' достигает пика примерно через 100 с после начала возобновления циклоза, а скорость течения составляет к этому моменту 10 мкм/с при 21°С [21], находим, что за 100-секундный интервал активные метаболиты проходят с потоком расстояние менее 1000 мкм. Таким образом, появление второго максимума F ' вполне может быть связано с опосредованной циклозом доставкой восстановительных эквивалентов в пределах локально освещенного участка с диаметром 2 мм.

Следует отметить, что переход от общего к локальному освещению междоузлия сопровождался временным понижением F ' и сильным подавлением ответных изменений F ' после генерации ПД (рис. 4). Ранее показано, что аналогичная смена световых условий вызывает практически полное переходное устранение дальней передачи сигнала, опосредованной течением цитоплазмы [19]. Эти данные интерпретированы как результат совместного действия двух факторов: (1) прекращение образования NADPH в фотореакциях после затенения хлоропластов и (2) временное сохранение активности метаболических транспортеров оболочки хлоропластов и реакций ассимиляции СО₂ после перехода свет–темнота. Сочетание этих факторов вызывает интенсивное поглощение восстановительных эквивалентов цитоплазмы для нужд постсветовой фиксации СО₂ [31]. В этих условиях восстановительные эквиваленты цитоплазмы активно потребляются хлоропластами на границе освещенной и затемненной областей и не достигают с потоком зоны измерения F '. Следует отметить, что при генерации ПД через 2–3 мин после перехода от общего к локальному освещению в записях F ' часто отсутствовала первая волна изменений, индуцированных возбуждением. Это может говорить о том, что при активном потреблении NAD(P)H вне освещаемой зоны и сохранении активности метаболических транспортеров оболочки накопления NADPH в строме не происходит из-за высокой скорости экспорта восстановительных эквивалентов. Это объяснение аналогично интерпретации подавления стадий S–M–T в индукции Фл Хл клеток Chara после перехода от общего к локальному освещению [18].

Подводя итог, следует отметить, что (1) генерация ПД оказывает влияние на Фл хлоропластов, расположенных вблизи кальцифицированных зон, но не оказывает влияния на F ' в преобладающих по размеру некальцифицированных участках; (2) изменения Фл Хл, вызванные генерацией потенциала действия, включают ранние стадии, обусловленные внутренними процессами в хлоропластах, а также задержанные стадии, обусловленные циклоз-зависимым обменом фотометаболитов между подвижной цитоплазмой и неподвижными хлоропластами; (3) влияние потенциала действия на Фл Хл временно устраняется после перехода от общего освещения клетки к локальному освещению ее небольшого участка, включающего область регистрации F '. Такое нарушение трансформации сигнала связано, вероятно, с усиленным потреблением затененными хлоропластами восстановительных эквивалентов цитоплазмы в период, когда светозависимое образование NADPH прекращается из-за остановки фотосинтетического транспорта электронов, а “малатный клапан” и транслокатор триозофосфатов остаются некоторое время активными в темноте, понижая содержание восстановленных редокс-агентов в цитоплазме.

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источники финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-54-12 015), а также в рамках научного проекта государственного задания МГУ № 121032500058-7.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.