Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2022, T. 39, № 4, стр. 271-282

ВВЕДЕНИЕ

В 1997 году Нобелевская премия по химии была вручена трем ученым: датчанину Й. Скоу из Орхусского университета, американцу П. Бойеру из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и англичанину Дж. Уокеру из лаборатории молекулярной биологии Медицинского исследовательского совета Великобритании (Кембридж) за изучение ферментов, обратимо преобразующих энергию АТР в трансмембранный градиент ионов. П. Бойер и Дж. Уокер длительное время занимались изучением АТР-синтетазы митохондрий: П. Бойер предложил трехтактный механизм работы этого фермента и предсказал существование вращения части этой молекулярной машины в процессе работы, а Дж. Уокер с использованием методов электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа выяснил строение этого фермента и подтвердил трехтактную кинетическую схему его работы. Вращение части фермента при его функционировании было позднее подтверждено японскими исследователями.

Третий нобелевский лауреат Й. Скоу был известен научному миру как первооткрыватель и исследователь Na⁺,K⁺-АТР-азы, фермента, обеспечивающего перенос ионов Na⁺ и К⁺ через плазматическую мембрану клеток животных против электрохимического градиента. В 1957 году, исследуя гомогенат нервов краба, Й. Скоу обнаружил в нем АТР-азную активность, зависящую от соотношения ионов Na⁺ и К⁺ в среде, т.е. обнаружил фермент, который специфически распознает два этих одновалентных иона [1].

Еще в конце 30-х годов прошлого века было установлено, что кардиотонические стероиды (класс родственных соединений, в структуру которых входит циклопентанпергидрофенантреновое (стероидное) ядро) вызывают накопление ионов Nа⁺ и потерю ионов К⁺ в сердечной мышце [2], а в 1953 году Х. Шатцман установил, что эти соединения подавляют АТР-зависимую аккумуляцию К⁺ и выведение Na⁺ из эритроцитов человека [3]. Эти эксперименты дали основание считать, что в клетках имеется Na⁺,K⁺-насос, который переносит ионы Na⁺ и K⁺ через клеточную мембрану против электрохимического градиента. Уже через три года после обнаружения Na⁺,K⁺-зависимой АТР-азы Й. Скоу опубликовал следующую работу, в которой показал, что обнаруженная им Na⁺,K⁺-АТР-аза ингибируется уабаином (соединением из класса кардиостероидов) и заключил, что именно она является тем самым Na⁺-насосом, который выкачивает Na⁺ из клетки, используя в качестве источника энергии АТР [4].

Na⁺,K⁺-ATP-аза: СТРОЕНИЕ И ТРАНСПОРТНЫЕ ФУНКЦИИ

Во второй половине XX века в лаборатории Й. Скоу и еще в нескольких лабораториях США и Европы начали интенсивно исследовать механизм работы Na⁺-насоса. Этот фермент был получен из почек [5], где он принимает активное участие в реабсорбции ионов Na⁺ из первичной мочи, а также (за счет создания градиента Na⁺) обеспечивает энергией системы вторичного транспорта, такие как Na⁺,K⁺,Сl^–-котранспорт, Na⁺/Cа²⁺-обменник, Na⁺/H⁺-обменник, а также системы реабсорбции аминокислот, нуклеотидов и др. [6]. Изучение его структуры показало, что Na⁺,K⁺-АТР-аза состоит минимум из двух типов субъединиц, одна из которых является каталитической ($\alpha $-субъединица) с молекулярной массой около 100 кДа, а другая ($\beta $-субъединица), белковая часть которой имеет массу около 35 кДа, существенно гликозилируется (до достижения молекулярной массы в 55–60 кДа) и непосредственного участия в катализе не принимает, однако обеспечивает доставку α-субъединицы от места синтеза к плазматической мембране и является регуляторной, влияя на сродство фермента к одновалентным катионам [7, 8].

В настоящее время идентифицировано 4 изоформы α- (α1–α4) и 3 изоформы β-субъединиц (β1–β3), они характеризуются различным распределением в тканях и могут образовывать комплексы в любом сочетании, например, α1β1, α1β2 и т.д. Образованные путем таких комбинаций тканеспецифичные изоферменты Na⁺,K⁺-ATP-азы различаются по кинетическим свойствам, в частности имеют различное сродство к уабаину, АТР и одновалентным катионам [7, 9].

Почти сразу после получения очищенной Na⁺,K⁺-АТР-азы из почек была обнаружена и ее третья, γ-субъединица [10]. Однако ее функциональное значение долгое время оставалось неясным, пока не было обнаружено, что она формирует в мембране единый комплекс с αβ-димером, влияя на некоторые кинетические характеристики Na⁺,K⁺-АТР-азы, в частности на ее чувствительность к одновалентным катионам [11]. γ-Cубъединица Na⁺,K⁺-АТР-азы относится к семейству малых мембранных белков FXYD с единственным трансмембранным доменом, по крайней мере 5 из 7 белков этого семейства, имеющие различные названия, а именно FXYD1 (фосфолемман), FXYD2 (γ-субъединица Na⁺,K⁺-ATP-азы), FXYD3 (Mat-8), FXYD4 (CHIF) и FXYD7, входят в состав Na⁺,K⁺-ATP-азы и принимают участие в регуляции ее активности. Следует, однако, отметить, что белки семейства FXYD взаимодействуют не только с Na⁺,K⁺-ATP-азой, они способны образовывать комплексы и с другими мембранными белками, например, в плазматической мембране сердца они находятся рядом и при иммунопреципитации осаждаются совместно с Na⁺/Ca²⁺-обменником и Са²⁺-каналом L-типа [12]. Взаимодействуя с этим транспортером, фосфолемман (FXYD1) подавляет его активность [13].

При изучении ферментативных свойств Na⁺,K⁺-АТР-азы было установлено, что в процессе каталитического цикла происходит образование так называемого фосфорилированного интермедиата, возникающего за счет переноса терминального фосфорильного остатка АТР на остаток аспартата, расположенного в активном центре Na⁺,K⁺-АТР-азы [14]. Этот процесс происходит одновременно с переносом Na⁺ из клетки наружу, в то время как гидролиз фосфоинтермедиата – с переносом ионов K⁺ в противоположном направлении. Почти сразу после обнаружения фосфоинтермедиата Р. Постом была предложена схема каталитического цикла фермента, получившая название схемы Алберса–Поста, по фамилиям авторов, опубликовавших статью с этой схемой [15, 16]. В процессе исследований она уточнялась, несколько модифицировалась, и в результате оказалась пригодной для описания каталитического цикла других ферментов, относящихся к АТР-азам Р-типа (например, Са²⁺-АТР-азы, Н⁺,К⁺-АТР-азы слизистой оболочки желудка и др.) [17].

Итак, уже к началу XXI века были выявлены изоформы всех субъединиц Na⁺,K⁺-АТР-азы, исследовано их распределение в различных тканях, выяснено, как именно полипептидные цепи этих субъединиц располагаются внутри мембраны. Благодаря усилиям сотрудников нескольких лабораторий была установлена аминокислотная последовательность отдельных субъединиц. И наконец, фермент был закристаллизован в различных конформациях и были получены 3D-структуры Na⁺,K⁺-АТР-азы с высоким разрешением [18]. Следует отметить, что все работы по кристаллизации и определению третичной структуры фермента были выполнены с использованием α1β1γ-изофермента, поскольку только этот изофермент был получен в очищенном виде.

После получения Й. Скоу Нобелевской премии и установления механизма функционирования и трехмерной структуры Nа⁺,К⁺-АТР-азы стало казаться, что этот объект уже не представляет интереса для исследователей. Однако ситуация оказалась не столь проста, как выглядела на первый взгляд. Последние данные позволяют считать Na⁺,K⁺-АТР-азу белком с множественными функциями.

КАРДИОТОНИЧЕСКИЕ СТЕРОИДЫ – РЕГУЛЯТОРЫ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА

Работы, вызвавшие вторую волну интереса к Na⁺,K⁺-АТР-азе, были начаты еще в 80-е годы прошлого века. Они привели к открытию так называемых эндогенных кардиостероидов. Кардиотонические стероиды, являющиеся ингибиторами Na⁺,K⁺-АТР-азы, были известны как вещества растительного происхождения. С давних времен они использовались в качестве ядов и лекарств. Например, название “уабаин” происходит от сомалийского waabaayo, что означает “яд стрелы”. Он в больших количествах содержится в африканских растениях строфант приятный (Strophanthus gratus) и акокантера абиссинская (Acokanthera schimperi) и применялся охотниками для отравления наконечников стрел. Отвары из растений рода наперстянка (Digitalis purpurea и Digitalis lanata), содержащих родственные уабаину кардиостероиды дигоксин и дигитоксин, использовались для лечения водянки. Еще в 1650 г. наперстянка пурпурная была включена в английскую фармакопею, но ее перестали использовать в 1746 г. из-за часто происходящих отравлений. [19]. Однако в 1775 г. английский врач сэр У. Визеринг опубликовал сообщение о том, что экстракт из листьев наперстянки является средством для лечения сердечной недостаточности, и потратил почти 10 лет на его реабилитацию [20]. Дигоксин и в настоящее время используют для лечения хронической сердечной недостаточности, связанной с декомпенсированными пороками клапанов сердца, а также при атеросклеротическом кардиосклерозе и перегрузке миокарда вследствие артериальной гипертензии [21].

Все кардиотонические стероиды по структуре делят на две группы: карденелиды и буфадиенолиды. Соединения обеих групп содержат стероидное ядро, которое в 17 положении имеет в качестве заместителя пятичленное (карденелиды) или шестичленное (буфадиенолиды) лактоновое кольцо. Кроме того, у карденелидов в 3-м положении могут находиться от одного до трех остатков сахаров; буфадиенолиды являются, главным образом, агликонами. Буфадиенолиды обнаружены в слизи жаб рода Bufо (в частности, Bufo rubescens и Bufo marinus), они защищают этих амфибий от поедания хищниками.

В 80-е годы прошлого столетия было обнаружено, что у некоторых экспериментальных животных, например, крыс с гипертензией, сопровождающейся увеличением объема циркулирующей жидкости (модель “one clip, one kidney”), а также у больных гипертонической болезнью и некоторыми другими заболеваниями, в крови обнаруживаются органические соединения с молекулярной массой менее 1000 Да [22]. Использование антител против дигоксина у таких животных снижало у них артериальное давление. Это привело исследователей к выводу, что у млекопитающих в крови присутствуют так называемые эндогенные кардиостероиды, повышение концентрации которых происходит при развитии сердечно-сосудистых, почечных, нейрональных и некоторых других заболеваний [22, 23].

Длительные поиски этих соединений привели к выделению из биологических жидкостей млекопитающих и идентификации сначала уабаина [24], а затем и таких кардиостероидов, как дигоксин, буфалин, маринобуфагенин, телоцинобуфагин и маринобуфатоксин [25]. Есть данные, свидетельствующие в пользу того, что эти эндогенные кардиостероиды синтезируются, предположительно, в коре надпочечников и гипоталамусе [6].

Какова же функция эндогенных стероидов? Что они регулируют в организме млекопитающих? В течение последних двух десятилетий было показано, что длительная инкубация различных клеток с кардиостероидами (в первую очередь с уабаином, который благодаря хорошей растворимости в воде обычно используется в экспериментах in vitro) приводит в разных клетках к различным физиологическим эффектам. Так, было показано, что уабаин влияет на экспрессию генов, синтез белка, состояние плотных контактов, адгезию клеток, вызывает гипертрофию миокарда, активирует генерацию свободно-радикальных форм кислорода, а также инициирует смерть или выживание клеток в зависимости от типа ткани и видовой принадлежности животного [25].

Обнаружено, что кардиотонические стероиды способны активировать различные сигнальные каскады благодаря конформационным переходам α1-субъединицы Na⁺,K⁺-АТР-азы. Их связывание с α1-субъединицей и вызванный этим конформационный переход приводит к активации нерецепторной тирозинкиназы Src, фосфатидилинозитол-3-киназы и рецептора инозитол-1,4,5-трифосфата (Ca²⁺-канал эндоплазматического ретикулума) [26]. Эти данные позволили предположить, что эндогенные кардиостероиды представляют собой новый класс стероидных гормонов.

Достаточно давно было выявлено, что инкубация клеток с уабаином приводит к увеличению экспрессии генов, в частности тех, что кодируют собственные субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы (по крайней мере, в нервной ткани [27–29]). Но одно из обширных пионерских исследований, проведенных в лаборатории А. Аскари с использованием кардиомиоцитов, показало, что после связывания уабаина Na⁺,K⁺-ATP-аза взаимодействует с заякоренной в мембране нерецепторной Src-киназой, вызывая ее активацию [30].

Прямое взаимодействие Src-киназы с Na⁺,K⁺-АТР-азой впоследствии было подтверждено в экспериментах других исследователей [31], и механизм, лежащий в основе этого явления, был подробно изучен [32]. Установлено, что активированная Src-киназа фосфорилирует остаток тирозина в рецепторе фактора роста эпидермиса (EGFR), находящемся в плазматической мембране, и в нескольких других белках, причем это фосфорилирование устраняется ингибиторами Src-киназы, например, гербимицином A [33]. После фосфорилирования EGFR с остатком фосфотирозина этого белка взаимодействует адапторный белок Shc, содержащий необходимый для такого взаимодействия SH2-домен. В свою очередь с белком Shc взаимодействует белок Grb2, после чего последний связывает белок Sos, являющийся фактором обмена нуклеотидов. После образования комплекса с Grb2 он активируется и обеспечивает обмен GDP на GTP в мономерном G-белке Ras. Эти события происходят независимо от изменения внутриклеточного соотношения ионов Na⁺ и К⁺ [30], т.е. для активации Ras достаточно связывания уабаина с Na⁺,K⁺-АТР-азой. Однако связывание Ras необходимо, но недостаточно для дальнейшей активации классического каскада митоген-активируемых киназ, включающего Raf (MAP3K), MEK (MAP2K) и p42/p44 MAPK. Последняя в этом ряду протеинкиназа называется также ERK1/2. Она проникает в ядро и путем фосфорилирования регуляторных элементов влияет на экспрессию генов.

Активация Ras оказывается также необходима для увеличения генерации свободно-радикальных форм кислорода митохондриями. Параллельно уабаин, ингибируя Na⁺,K⁺-АТР-азу, увеличивает внутриклеточную концентрацию Na⁺, что приводит к активации Na⁺/Ca²⁺-обменника и к локальному повышению внутриклеточной концентрации Ca²⁺ [34]. Это, с одной стороны, вызывает активацию сокращения сердечной мышцы, с чем и связано, как считается, терапевтическое действие дигоксина при хронической сердечной недостаточности, называемое положительным инотропным эффектом. Предполагается, что этот эффект реализуется в специальных микродоменах, называемых плазмеросомами, основными компонентами которых являются α2- и α3-изоформы Na⁺,K⁺-ATP-азы и Na⁺/Ca²⁺-обменник [35]. В то же время точный механизм этого явления неясен, и уже давно вызывает дискуссии [36]. Есть сомнения в том, что в основе положительного инотропного эффекта лежит ингибирование Na⁺,K⁺-ATP-азы, поскольку концентрация дигоксина в плазме крови пациентов, принимающих этот кардиостероид в дозах, снижающих смертность, не превышает 1–2 нМ [37]. Тогда как концентрация дигоксина, при которой наблюдается полумаксимальное ингибирование Na⁺,K⁺-ATP-азы, содержащей α1-субъединицу, составляет 1.2 мкМ [38], а Na⁺,K⁺-АТР-азы, содержащей α2- и α3-субъединицы, равна 219 нМ [39]. Даже если учесть, что все изоферменты Na⁺,K⁺-АТР-азы человека наиболее чувствительны к кардиостероидам, 1–2 нМ дигоксина недостаточно, чтобы вызвать ингибирование фермента. По мнению З. Cе и А. Аскари, именно повышение концентрации внутриклеточного Са²⁺, с одной стороны, активирует факторы регуляции транскрипции NFκB и AP-1, что приводит к активации генов раннего ответа (Fos, Jun), а с другой – это второй фактор, необходимый для активации каскада протенкиназ, заканчивающегося активацией ERK1/2 [30]. Все эти события вызывают стимуляцию синтеза белка и, как следствие, гипертрофию миокарда, а также вовлечены в увеличение продукции свободно-радикальных форм кислорода в различных типах клеток [30]. Важно отметить, что невзирая на существующую возможность уабаина инициировать сигнальный каскад МАРК исключительно за счет белок-белковых взаимодействий, на некоторых этапах реализации его действия необходимо также изменение концентрации внутриклеточных ионов Na⁺ и/или Cа²⁺ [30].

Однако в дальнейшем не все попытки повторить эти эксперименты оказались успешными. А. Аскари пишет о том, что у него в процессе исследования были разногласия по поводу трактовки результатов экспериментов, проведенных в его лаборатории совместно с З. Се, и подробно обсуждает эту проблему [40]. По мнению А. Аскари, невоспроизводимость результатов обусловлена тем, что результаты экспериментов по изучению взаимодействия Na⁺,K⁺-АТР-азы и Src in vitro искажены присутствием детергентов. В дальнейшем было установлено, что активацию Src-киназы вызывает не только уабаин, но и другие ингибиторы Na⁺,K⁺-АТР-азы, например, ванадат. Это позволило предположить, что Src-киназа активируется за счет того, что при ингибировании Na⁺,K⁺-АТР-азы увеличивается локальная концентрация общего для обоих ферментов субстрата, АТР, и экспериментально было показано, что фосфорилирование EGFR меняется в зависимости от активности Na⁺,K⁺-АТР-азы [41]. И наконец, были получены свидетельства, что гипертрофия кардиомиоцитов происходит, скорее всего, с участием одной из изоформ фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) [40]. Стоит отметить, что исследование сигнальных каскадов, между которыми существует множественные взаимодействия, является довольно сложной технической проблемой. По-видимому, вопрос о механизмах, лежащих в основе действия уабаина, опосредующего гипертрофию сердечной мышцы, до сих пор нельзя считать полностью решенным. Возможно, существуют оба механизма взаимодействия Na⁺,K⁺-АТР-азы и Src, которые существуют параллельно, и в определенных условиях преобладает один из них. Для окончательного решения этого вопроса необходимы дальнейшие эксперименты.

Установлено, что кардиотонические стероиды могут через активацию Src инициировать также сигнальный каскад с участием фосфолипазы С (PLC-γ), которая обычно активируется через рецепторы, сопряженные с G-белками. Фосфорилирование Src-киназой PLC-γ крысы по остатку тирозина активирует последнюю, что вызывает гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата и увеличение концентрации 1,2-диацилглицерина и инозитол-1,4,5-трифосфата [42]. Инозитол-1,4,5-трифосфат в свою очередь связывается с Са²⁺-каналом эндоплазматического ретикулума, являющегося рецептором этого вторичного мессенджера, вызывая освобождение ионов Ca²⁺ [42]. Другим сигнальным путем с участием маринобуфагенина, Na⁺,K⁺-ATP-азы и фосфолипазы С является каскад, приводящий к ингибированию транскрипционного фактора Fli1, являющегося негативным регулятором синтеза коллагена [43]. Этот механизм может вносить существенный вклад и в патогенез соль-чувствительной гипертонической болезни [44].

Л. Лю и соавторы показали также, что в присутствии низких концентраций уабаина в культуре крысиных кардиомиоцитов наблюдается активация серин-треониновой протеинкиназы В, известной также как Akt. Эта активация устраняется ингибиторами фосфатидилинозитол-3-киназы [45]. Они обнаружили, что уабаин вызывает увеличение концентрации инозитол-1,4,5-трифосфата и приводит к взаимодействию α-субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы и фосфорилированной 85 кДа субъединицы PI3K (р85). Исследуя роль Src-киназы в индукции PI3K/Akt сигнального каскада, Й. У и соавторы провели эксперименты с мышиными фибробластами с нокаутом Src. Они показали, что 10–100 мкМ уабаин индуцирует накопление фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата, активацию PI3K1A и Akt, а также взаимодействие р85 субъединицы PI3K и Nа⁺,K⁺-AТР-азы в обоих типах клеток (нокаутной и нормальной), и все эти процессы нечувствительны к ингибитору Src-киназы PP2 [46]. Эти данные позволяют считать, что активация Akt обусловлена прямым взаимодействием обогащенного пролином участка α-субъединицы Nа⁺,K⁺-АТР-азы с SH3-доменом p85 субъединицы PI3K, которое индуцируется связыванием кардиотонических стероидов с Na⁺,K⁺-АТР-азой и не связано (или мало) с ингибированием фермента.

Обнаружено, что в клетках проксимального канальца нефрона частичное ингибирование Na⁺,K⁺-АТР-азы низкими концентрациями уабаина приводит к возникновению или усилению осцилляций внутриклеточной концентрации Са²⁺, которые устраняются нифедипином, блокатором Са²⁺-каналов L-типа [47]. Показано, что это обусловлено прямым взаимодействием N-концевой части полипептидной цепи α-субъединицы Na⁺,K⁺-АТРазы с рецептором инозитол-1,4,5-трифосфата, расположенного в прилегающей к плазматической части эндоплазматического ретикулума [47]. Осцилляции внутриклеточной концентрации Ca²⁺ обеспечивают фосфорилирование большого количества Са²⁺-зависимых белков. Блокада индуцируемой уабаином активации транскрипционных факторов NF-kB и CREB, устраняющая их активацию, вызвана их фосфорилированием и входом в ядро [48].

Длительная обработка уабаином различных типов клеток собаки, свиньи и человека вызывает их смерть, сочетающую в себе признаки апоптоза и некроза, причем эта смерть не связана с ингибированием Na⁺,K⁺-АТР-азы, поскольку такое же по времени выдерживание клеток в среде без K⁺, обеспечивающее полное ингибирование Na⁺,K⁺-AТP-азы, не оказывает аналогичного эффекта. Однако столь же длительная обработка уабаином клеток грызунов, также вызывающая полное ингибирование Na⁺,K⁺-AТP-азы, не индуцирует клеточную смерть (см. обзор [49]). Мы предприняли попытку исследовать механизмы, лежащие в основе смерти одних клеток и выживания других. Клетки грызунов отличаются от клеток других млекопитающих “не-грызунов” тем, что они менее чувствительны к уабаину (значения констант диссоциации комплексов уабаин–α1-Na⁺,K⁺-ATP-аза для грызунов примерно на три порядка выше, в то же время существенных различий в сродстве других α2–α4-изоформ между грызунами и “не-грызунами” не выявлено. В этой связи далее по тексту термины “уабаин-чувствительная” и “уабаин-резистентная” применяются по отношению к α1-изоформе Na⁺,K⁺-ATP-азы). В нашей лаборатории, руководимой профессором Орловым C., было обнаружено, что связывание уабаина с уабаин-чувствительной (“не-грызуны”) и уабаин-резистентной (грызуны) Na⁺,K⁺-АТР-азой приводит к различным изменениям конформации фермента, что вызывает активацию в случае “не-грызунов” p38 митоген-активируемой протеинкиназы MAPK [50]. Выживание клеток грызунов обусловлено тем, что уабаин-резистентная Na⁺,K⁺-АТР-аза этих животных при связывании уабаина претерпевает иные конформационные изменения, что приводит к активации сигнального каскада, связанного с ERK1/2 [50]. Введение в клетки мыши гена, кодирующего уабаин-чувствительную форму α1-субъединицы, приводит к тому, что клетки мышей начинают умирать при инкубации с уабаином. Таким образом, смерть клеток под действием уабаина обусловлена, по всей видимости, конформационными переходами Na⁺,K⁺-АТР-азы, которые приводят к активации тех или иных сигнальных каскадов [49].

Способность кардиотонических стероидов индуцировать гибель клеток позволила рассматривать их в качестве сенолитических компонентов – соединений, вызывающих апоптоз стареющих клеток, у которых нарушены процессы программируемой клеточной смерти [51]. Изучение механизмов этого явления, проведенное А. Шатровой и соавторами на мезенхимальных стволовых клетках эндометрия человека, показало, что старение этих клеток сопровождается одновременным уменьшением и увеличением внутриклеточного содержания K⁺ ([K⁺]_i) и Na⁺ ([Na⁺]_i) соответственно. Инкубация этих клеток в присутствии 1 мкМ уабаина в течение 48 ч, приводящая к ингибированию Na⁺,K⁺-ATP-азы и сопровождающаяся дальнейшим увеличением соотношения [Na⁺]_i/[K⁺]_i в этих клетках, не влияла на их жизнеспособность [52]. Стоит отметить, что взаимосвязь между внутриклеточным содержанием одновалентных катионов и нарушением механизмов клеточной смерти обсуждается довольно давно. Так, в монографии “Vitamins and Minerals in the Prevention and Treatment of Cancer” под редакцией М. Джейкобс одна из глав посвящена этой проблеме [53]. Авторы подчеркивают, что высокое содержание K⁺_i снижает рост опухоли и риск онкотрансформации, тогда как высокое соотношение [Na⁺]_i/[K⁺]_i (за счет увеличения [Na⁺]_i) оказывает противоположный эффект. Кроме того, приводятся результаты анализа внутриядерного содержания этих ионов в разных типах раковых клеток, который показал, что соотношение [Na⁺]_i/[K⁺_i] в них в несколько раз больше по сравнению с нормальными клетками того же типа.

КАРДИОТОНИЧЕСКИЕ СТЕРОИДЫ КАК АКТИВАТОРЫ Na⁺,K⁺-ATP-азы

Еще один важный вопрос связан с тем, какова концентрация эндогенного уабаина (или средняя концентрации других кардиостероидов) в организме млекопитающих по сравнению с теми концентрациями, которые вызывают описанные выше эффекты. Сравнение средних концентраций кардиостероидов, оказывающих действие на различные процессы в клетках, показывает, что большинство эффектов инициируется теми концентрациями, которые в крови млекопитающих не достигаются, т.е. при концентрациях кардиостероидов, существующих в организме млекопитающих, ингибирование Na⁺,K⁺-АТР-азы невозможно [25]. Те концентрации уабаина (или других кардиостероидов), которые обнаружены в организмах млекопитающих (менее 1 нМ), могут инициировать лишь часть из описанных выше процессов, а именно: пролиферацию клеток, активацию Src-киназы, оссцилляцию внутриклеточных концентраций Са²⁺ и активацию Na⁺,K⁺-АТР-азы. Таким образом, процессы, для которых необходимо увеличение внутриклеточных концентраций Na⁺, вызываемое ингибированием Na⁺,K⁺-АТР-азы (например, гипертрофия сердечной мышцы), in vivo, по-видимому, не произойдут без воздействия экзогенно добавленных кардиостероидов. Однако нельзя также исключить, что если концентрации разных присутствующих в крови млекопитающих кардиостероидов, например, дигоксина или маринобуфагенина, могут суммироваться и насыщать уабаин-связывающие центры фермента, тогда их суммарной концентрации будет достаточно для инициации процессов, которые обусловлены более высокими концентрациями.

Удивительно, но данные, полученные многими исследовательскими группами, свидетельствуют о том, что уабаин не только ингибирует, но в низких дозах (т.е. в физиологическом диапазоне) активирует Na⁺,K⁺-ATP-aзу. Это явление было описано в литературе еще в 60-х годах XX века [54, 55]. Спустя 10 лет после этого сообщения Т. Годфрейнд и Дж. Гизель-Бертон опубликовали данные о том, что инкубация изолированного левого предсердия морской свинки в присутствии 1 и 3 нМ уабаина в течение 3 ч приводила к уменьшению внутриклеточного содержания Na⁺ и увеличению внутриклеточного содержания K⁺ по сравнению с контрольными образцами [56]. Авторы предположили существование двух участков связывания уабаина с разным сродством внутри молекулы Na⁺,K⁺-ATP-азы. Позднее Д. Лихштейн и соавторы показали, что уабаин в диапазоне концентраций 1–100 нМ оказывает ярко выраженный стимулирующий эффект на Na⁺,K⁺-ATP-азу в гомогенате мозга крысы. Однако подобного эффекта не наблюдалось на препарате микросом, полученных из мозга крысы [36]. Авторы также отметили, что активирующий эффект (в отличие от ингибирующего) уабаина зависит от времени хранения препарата при –20°С, что также ранее было показано другими исследователями [54, 55]. Они предложили два возможных объяснения стимулирующего эффекта низких концентраций уабаина. Первое связано с наличием эндогенного уабаино-подобного соединения, которое, связываясь с высокоаффинным участком Na⁺,K⁺-ATP-азы, приводит к частичной потере активности фермента. Добавление низких концентраций уабаина в такой ситуации “растормаживает” Na⁺,K⁺-ATP-азу. Второе объяснение предполагает изменение мембранного окружения Na⁺-насоса в результате связывания этого кардиостероида, которое само по себе может оказывать ингибирующее действие на фермент. Т. Хоуген и соавторы в экспериментах с использованием изолированного левого предсердия морской свинки также показали увеличение активности Na⁺,K⁺-ATP-азы в присутствии 3 нМ уабаина, и этот эффект устранялся в присутствии пропранолола (ингибитора β-адренергических рецепторов). Это наблюдение (а также эксперименты с использованием резерпина и 6-гидроксидофамина) позволило авторам предположить, что уабаин-опосредованная активация Na⁺-насоса обеспечивается действием эндогенных катехоламинов [57]. Мы также регистрировали увеличение активности Na⁺,K⁺-ATP-азы в микросомах из почек свиньи в присутствии 1–10 нМ уабаина и в клетках эндотелия пупочной вены человека в присутствии 0.3, 1 и 3 нМ уабаина [58, 59].

Возникает вопрос, каков физиологический смысл активации Na⁺,K⁺-ATP-азы уабаином, в частности в отношении невозбудимых тканей? Анализ данных литературы относительно физиологических эффектов суб- и наномолярных концентраций КТС в различных типах клеток позволяет сделать следующие заключения. Такие концентрации КТС часто усиливают клеточную пролиферацию [25]. Так, уабаин в концентрации 1–10 нМ, не ингибирующей Na⁺-насос, увеличивает пролиферацию культивируемых эндотелиальных клеток человека [60], гладкомышечных клеток собаки [61] и эпителиальных клеток почки опоссума [62], содержащих чувствительную к кардиостероидам Nа⁺,K⁺-AТР-азу, до 40%. Мы также регистрировали увеличение жизнеспособности HUVEC (клетки эндотелия пупочной вены человека) и синтез ДНК в HREC (клетки почечного эпителия человека) и HUVEC в присутствии 1 и 3 нМ уабаина [58, 59].

Механизм бимодального действия уабаина на активность Na⁺,K⁺-АТР-азы (активация и ингибирование при низких и высоких концентрациях соответственно) остается пока не выясненным. Среди возможных, описанных в литературе, можно выделить основные: 1) наличие двух участков связывания уабаина внутри молекулы фермента [56]; 2) изменение мембранного окружения фермента, оказывающего ингибирующее воздействие в результате связывания уабаина [36]; 3) белок-белковые взаимодействия (например, с Na⁺/H⁺-обменником [63, 64]), опосредованные связыванием уабаина с Na⁺,K⁺-ATP-азой. Экспериментальные данные, полученные в нашей лаборатории с использованием различных культур клеток, а также частично очищенных (фракция микросом) и высокоочищенных препаратов Na⁺,K⁺-ATP-азы (солюбилизированный фермент), позволяют предположить следующий механизм активации фермента низкими концентрациями кардиотонических стероидов (в частности, уабаина). Функциональной единицей Na⁺,K⁺-ATP-азы является αβ-протомер, который может обратимо олигомеризоваться с образованием более крупных молекулярных комплексов вида (αβ)_n [65]. Этот процесс может регулироваться, например, посредством ATP. Так, его связывание с олигомером Na⁺,K⁺-ATP-азы приводит к формированию ее закрытой конформации [66], последующей диссоциации комплекса на мономеры и усилением транспортной функции фермента [17]. Образованию закрытой конформации Na⁺,K⁺-ATP-азы также способствует связывание уабаина [67]. Таким образом, можно предположить, что уабаин, связываясь с высокоаффинным участком Na⁺,K⁺-ATP-азы в составе ее олигомерного комплекса, провоцирует переход фермента в закрытую конформацию, что влечет за собой диссоциацию олигомера на мономеры, которые проявляют усиленную транспортную активность. Увеличение концентрации уабаина приводит к насыщению фермента ингибитором и сопровождается уменьшением его активности.

Резюмируя вышеизложенные факты, можно заключить, что спектр действия кардиотонических стероидов на различные типы клеток весьма обширен и зависит от того, каким образом они влияют на Na⁺,K⁺-ATP-азу (рис. 1). Эти влияния могут затрагивать как ионный гомеостаз (причем не только увеличивать соотношение [Na⁺]_i/[K⁺]_i, но и снижать), так и внутриклеточный сигналинг посредством изменения конформации фермента. Таким образом, исследуя эффекты кардиотонических стероидов, следует по возможности оценивать их влияние на транспортную функцию Na⁺,K⁺-ATP-азы и внутриклеточный ионный состав.

Рис. 1.

Эффекты связывания кардиотонических стероидов с Na⁺,K⁺-АТP-азой: роль изменений соотношения [Na⁺]_i/[K⁺]_i, которые возникают при ингибировании и активации Na⁺,K⁺-АТP-азы соответственно, и запуска клеточной сигнализации за счет конформационных изменений фермента.

Есть ли взаимосвязь между внутриклеточным соотношением [Na⁺]_i/[K⁺]_i и экспрессией генов? Каковы механизм и физиологическая роль активации Na⁺,K⁺-ATP-азы кардиотоническими стероидами? Что является сенсором внутриклеточных одновалентных катионов? Эти вопросы требуют детального изучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, годы, прошедшие с момента получения Й. Скоу Нобелевской премии, показали, что Na⁺,K⁺-АТР-аза обладает не только транспортной функцией, обеспечивая перенос ионов Na⁺ и К⁺ через плазматическую мембрану. Этот фермент также является рецептором для эндогенных кардиостероидов, связывая которые он может передавать сигнал внутрь клетки за счет взаимодействия с белками-партнерами, включая таким образом сигнальные каскады, регулирующие клеточные функции. Кроме того, от транспортной функции этого фермента зависит внутриклеточная концентрация ионов Na⁺ и K⁺, изменение соотношения этих ионов в клетке прямо влияет на экспрессию многих генов [68–70]. Этот аспект влияния Na⁺,K⁺-АТР-азы на функции клетки не обсуждался в настоящей статье, но прямое действие соотношения [Na⁺]_i/[K⁺]_i на экспрессию генов заставляет нас задуматься о поиске сенсора этих катионов [71]. Заключая, мы можем сказать, что вопросов о роли Na⁺,K⁺-АТР-азы в функционировании клеток и о механизмах, вовлеченных в осуществление влияния фермента на клетку, пока больше, чем ответов. По этой причине Na⁺,K⁺-АТР-аза еще долго останется объектом для исследования.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-75-10 009).

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.