1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии
  4. T. 39, № 5, 2022

Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2022, T. 39, № 5, стр. 398-403

Мониторинг агонист-индуцированной активности PI3-киназы в клетках HEK-293 с использованием генетически кодируемого сенсора

П. Д. Котова a, *, О. А. Рогачевская a, Н. В. Кабанова a, С. С. Колесников a

a Институт биофизики клетки РАН, ФИЦ ПНЦБИ РАН
142290 Пущино, Московская обл., Россия

* E-mail: p.d.kotova@gmail.com

Поступила в редакцию 04.04.2022
После доработки 23.05.2022
Принята к публикации 24.05.2022

Аннотация

IP3-зависимый выброс депонированного Са2+ вносит ключевой вклад в агонист-индуцированную мобилизацию Са2+ в невозбудимых клетках. Эффективность фосфоинозитидного каскада, сопрягающего поверхностные рецепторы с мобилизацией внутриклеточного Са2+, модулируется рядом киназ, включая фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K), которая, фосфорилируя PIP2, продуцирует фосфолипид PIP3. Ранее нами было показано, что ингибитор PI3K вортманнин не влияет на способность клеток HEK-293 генерировать Ca2+-ответы на ацетилхолин, тогда как ингибитор PI3K другой химической природы PI828 полностью подавляет эти ответы. Разная эффективность вортманнина и PI828 могла быть связана с тем, что в клетках HEK-293 функционируют изоформы PI3K, существенно более чувствительные к PI828. Для внесения ясности в этот вопрос нами была получена моноклональная линия клеток HEK-293, экспрессирующих два генетически кодируемых сенсора, а именно сенсор цитозольного Ca2+ (R-GECO1) и сенсор PIP3 PH(Akt)-Venus. Клетки этой линии позволяли одновременно регистрировать Са2+-сигналы и проводить мониторинг активности PI3K. Характерной особенностью R-GECO1 является увеличение интенсивности флуоресценции при повышении концентрации цитозольного Ca2+, в то время как PH(Akt)-Venus при PI3K-зависимой генерации PIP3 в плазмалемме перераспределяется из цитозоля в мембрану клетки. Оказалось, что ацетилхолин инициировал кратковременное повышение внутриклеточного Са2+, но не влиял на распределение PIP3-сенсора в цитоплазме клеток. Последнее указывало на отсутствие ацетилхолин-зависимой активации PI3K. В то же время инсулин, стимулирующий PI3K при участии тирозин-киназных рецепторов, вызывал перераспределение молекул PH(Akt)-Venus из цитозоля в мембрану клеток, что демонстрировало инсулин-индуцированную активность PI3K. Этот феномен не наблюдался в присутствии вортманнина или PI828, что свидетельствовало об эффективном подавлении активности PI3K этими соединениями. Таким образом, стимулируя внутриклеточную Са2+-сигнализацию в клетках HEK-293, ацетилхолин не инициировал активацию PI3K-пути, который, следовательно, не был вовлечен в холинергическую трансдукцию. Хотя полученные данные свидетельствуют об эффективном ингибировании активности PI3K вортманнином и PI828, последний подавлял ацетилхолин-индуцируемую Ca2+-сигнализацию неспецифически, т.е. воздействуя не на PI3K, а на какую-то иную клеточную мишень.

Ключевые слова: мускариновые рецепторы, внутриклеточная Ca2+-сигнализация, PI3-киназа, генетически кодируемый сенсор PIP3, ацетилхолин

Список литературы

  1. Clapham D. 2007. Calcium signaling. Cell. 131, 1047–1058.

  2. Berridge M.J. 2016. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiol. Rev. 96, 1261–1296.

  3. Vanhaesebroeck B., Guillermet-Guibert J., Graupera M., Bilanges B. 2010. The emerging mechanisms of isoform-specific PI3K signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 329–341.

  4. Jean S., Kiger A.A. 2014. Classes of phosphoinositide 3-kinases at a glance. J. Cell Sci. 127, 923–928.

  5. Parys J.B., Vervliet T. 2020. New insights in the IP 3 receptor and its regulation. Adv. Exp. Med. Biol. 1131, 243–270.

  6. Graves B.M., Simerly T., Li C., Williams D.L., Wondergem R. 2012. Phosphoinositide-3-kinase/akt – dependent signaling is required for maintenance of [Ca2+]i, ICa, and Ca2+ transients in HL-1 cardiomyocytes. J. Biomed. Sci. 19, 59.

  7. Ghigo A., Laffargue M., Li M., Hirsch E. 2017. PI3K and calcium signaling in cardiovascular disease. Circ. Res. 121, 282–292.

  8. Santoso N.G., Cebotaru L., Guggino W.B. 2011. Polycystin-1, 2, and STIM1 interact with IP3R to modulate ER Ca2+ release through the PI3K/Akt pathway. Cell. Physiol. Biochem. 27, 715–726.

  9. Marchi S., Marinello M., Bononi A., Bonora M., Giorgi C., Rimessi A., Pinton P. 2012. Selective modulation of subtype III IP3R by Akt regulates ER Ca2+ release and apoptosis. Cell Death Dis. 3, e304.

  10. Fregeau M.O., Rergimbald-Dumas Y., Guillemette G. 2011. Positive regulation of inositol 1,4,5-trisphosphate-induced Ca2+ release by mammalian target of rapamycin (mTOR) in RINm5F cells. J. Cell. Biochem. 112, 723–733.

  11. Szado T., Vanderheyden V., Parys J.B., De Smedt H., Rietdorf K., Kotelevets L., Chastre E., Khan F., Landegren U., Söderberg O., Bootman M.D., Rode-rick H.L. 2008. Phosphorylation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors by protein kinase B/Akt inhibits Ca2+ release and apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2427–2432.

  12. Zhang Y., Kwon S.H., Vogel W.K., Filtz T.M. 2009. PI(3,4,5)P3 potentiates phospholipase C-β activity. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 52–62.

  13. Дымова Е.А., Рогачевская О.А., Воронова Е.А., Котова П.Д. 2021. PI828 подавляет Ca2+-сигнализацию, инициируемую аминергическими агонистами, по механизму, независимому от ингибирования PI3-киназы. Биол. мембраны. 38 (5), 388–392.

  14. Zhao Y., Araki S., Wu J., Teramoto T., Chang Y.-F., Nakano M., Abdelfattah A.S., Fujiwara M., Ishihara T., Nagai T., Campbell R.E. 2011. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888–1891.

  15. O'Neill P.R., Gautam N. 2014. Subcellular optogenetic inhibition of G proteins generates signaling gradients and cell migration. Mol. Biol. Cell. 25 (15), 2305–2314.

  16. Hopkins B.D., Goncalves M.D., Cantley L.C. 2020. Insulin-PI3K signalling: An evolutionarily insulated metabolic driver of cancer. Nat. Rev. Endocrinol. 16 (5), 276–283.

  17. Backer J.M., Schroeder G.G., Kahn C.R., Myers M.G. Jr., Wilden P.A., Cahill D.A., White M.F. 1992. Insulin stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase activity maps to insulin receptor regions required for endogenous substrate phosphorylation. J. Biol. Chem. 267 (2), 1367–1374.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал