Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2022, T. 39, № 5, стр. 398-403

ВВЕДЕНИЕ

Мобилизация внутриклеточного Са²⁺ является одной из наиболее универсальных форм реакции клеток на внешние возмущения, включая стимуляцию первичными медиаторами, обеспечивающими аутокринную и паракринную регуляции клеточных функций. Хотя в генерации Са²⁺-сигналов принимает участие множество внутриклеточных сигнальных и транспортных систем, ключевой вклад в агонист-индуцированную мобилизацию Са²⁺ в невозбудимых клетках вносит IP3-зависимый выброс депонированного Са²⁺ [1, 2]. Фосфоинозитидный каскад может сопрягать разнообразные поверхностные рецепторы, включая гептаспиральные трансмембранные рецепторы (G-protein coupled receptor, GPCR-рецепторы), с мобилизацией внутриклеточного Са²⁺. Его эффективность модулируется при участии различных сигнальных систем, включая каскад фосфатидилинозитол-3-киназы класса I (PI3К) – фермента, катализирующего образование сигнального/регуляторного фосфолипида PIP3 (фосфатидилинозитол-3,4,5-трисфосфата) [3–5]. Так, например, показано, что PI3K/Akt-путь является важным регулятором Ca²⁺-сигнализации и сократительной активности кардиомиоцитов [6, 7]. Участие PI3K/Akt-каскада в регуляции выброса Ca²⁺ из Са²⁺-депо было продемонстрировано для клеток MDCK [8], COS-7 [9] и RINm5F [10]. Его роль в Ca²⁺-сигнализации может быть обусловлена PI3K/Akt-зависимой регуляцией активности IP3-рецепторов и/или фосфолипазы С [10–12].

Ранее при исследовании роли PI3K в генерации Са²⁺-ответов на GPCR-агонисты, нами был использован ряд ингибиторов PI3K, включая вортманнин и PI828, различающиеся по химической структуре. Было установлено, что вортманнин не влиял на способность клеток HEK-293 генерировать Ca²⁺-ответы на ацетилхолин, в то время как PI828 полностью подавлял эти ответы [13]. Причины столь разной эффективности PI828 и вортманнина оставались неясными. Одна из возможных причин состояла в том, что в сравнении с вортманнином PI828 существенно более эффективно блокировал изоформы PI3K, функционирующие в клетках HEK-293. В любом случае эти данные свидетельствовали о том, что механизм действия вортманнина и PI828, которые считаются ингибиторами PI3K, в действительности не так очевиден. Следовательно, результаты, полученные при исследовании роли PI3K в механизме генерации Ca²⁺-сигналов с использованием данных соединений, нельзя интерпретировать однозначно, что делает целесообразным проведение одновременного мониторинга внутриклеточного Са²⁺ и активности PI3K. Данная работа посвящена отработке такой методологии и ее использованию для установления роли PI3K в генерации Ca²⁺-ответов клеток HEK-293 на ацетилхолин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток. Клетки линии НЕК-293 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных) и модифицированные клетки HEK-293/R-GECO1/PH(Akt)-Venus культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (Invitrogen) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), 100 мг/мл гентамицина (Sigma-Aldrich), 2 мМ глутамина (Sigma-Aldrich) (ростовая среда) во влажной атмосфере c 5% содержанием CO₂ в воздухе при 37°C. Для культивирования моноклональных линий в ростовую среду добавляли 300 мкг/мл селективного антибиотика генецитина G418 (Invivogen).

Трансфекция клеток. Клетки НЕК-293 трансфицировали плазмидными векторами CMV-R-GECO1 (Addgene plasmid #32444) и PH(Akt)-Venus (Addgene plasmid #85223) одновременно, используя набор для трансфекции FuGENE 6 (Promega) по протоколу, оптимизированному согласно рекомендациям производителя. Накануне трансфекции клетки рассевали из расчета (2–4) × 10⁵ клеток в 1 лунку 12-лучночного планшета в 1 мл ростовой среды. Для трансфекции в лунку к среде с растущими клеткам добавляли трансфекционную смесь, содержащую 100 мкл среды OptiMEM (Gibco), 4 мкл FuGENE 6 (Promega), 0.5 мкг CMV-R-GECO1 и 0.5 мкг PH(Akt)-Venus. Через 24 ч среду заменяли на свежую ростовую.

Получение моноклональных линий HEK-293/R-GECO1/PH(Akt)-Venus. Популяцию трансфицированных клеток селектировали в ростовой среде с добавлением 700 мкг/мл G-418 (Invivogen) в течение 2–3 недель. Из полученной после селекции популяции с помощью клеточного сортера FACSAria SORP (Beckton Dickinson) отбирали клетки, обладающие флуоресценцией, соответствующей экспрессии обоих белков интереса: флуоресценцию R-GECO1 возбуждали при длине волны 561 нм, эмиссию регистрировали в области 610 ± 10 нм, флуоресценцию PH(Akt)-Venus возбуждали при длине волны 488 нм, эмиссию регистрировали в области 515 ± 10 нм. Клетки, обладающие наиболее яркой флуоресценцией обоих сенсоров, помещали по одной в лунку 96-луночного планшета, содержащую 150 мкл ростовой среды с повышенным до 15% содержанием сыворотки, и культивировали, наращивая таким образом моноклональные линии. Клетки каждой полученной моноклональной линии тестировали физиологически, а именно, работоспособность полученных клеток оценивали по ответам сенсоров R-GECO1 и PH(Akt)-Venus на стимуляцию ацетилхолином и инсулином соответственно. В результате проведенного тестирования была отобрана лучшая моноклональная линия клеток HEK-293/R-GECO1/PH(Akt)-Venus.

Мониторинг внутриклеточных Ca²⁺ и PIP3. Перед экспериментом клетки HEK-293/R-GECO1/PH(Akt)-Venus культивировали в фотометрических камерах в течение 24 ч в ростовой среде в CO₂-инкубаторе. В процессе эксперимента клетки находились во внеклеточном растворе, содержащем (мМ): 130 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES, pH 7.4, 10 глюкозы (все соли и буфер произведены Sigma-Aldrich). Фотометрические эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200 (Zeiss), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20×/0.75, цифровой sCMOS камерой Zyla 4.2P (Andor Technology), металлогалогенным источником света AMH-200-F6S (Andor Technology) и спиннинг-диском для конфокальной микроскопии Revolution DSD2 (Andor Technology). Флуоресценцию R-GECO1 и PH(Akt)-Venus возбуждали поочередно при длинах волн 560 ± 20 и 500 ± 10 нм соответственно, эмиссию регистрировали в областях 630 ± 37 и 535 ± 15 нм соответственно. Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли с использованием программы NIS Elements (Nikon).

Аппликацию всех соединений, использовавшихся в описанных ниже экспериментах, проводили путем полной замены раствора в фотометрической камере с помощью системы перфузии. В работе использовали ацетилхолин, инсулин, вортманнин и PI828 производства Tocris Bioscience.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Мониторинг активности PI3K проводили в клетках моноклональной линии HEK-293/R-GECO1/PH(Akt)-Venus, экспрессирующих сенсор цитозольного Ca²⁺ R-GECO1 и сенсор PIP3 PH(Akt)-Venus, принципы функционирования которых различаются. Характерной особенностью сенсора R-GECO1 является градуальное увеличение интенсивности флуоресценции при повышении концентрации цитозольного Ca²⁺ [14]. В покое, когда уровень PIP3 в плазмалемме низок, сенсор PH(Akt)-Venus локализован преимущественно в цитозоле, но при PI3K-зависимой генерации PIP3 он перераспределяется из цитозоля к мембране клетки [15]. Этот феномен можно наблюдать при регистрации флуоресценции PH(Akt)-Venus на оптическом срезе клетки, в связи с этим в данной работе использовали SDCM-микроскопию (spinning disk confocal microscopy).

Оказалось, что при стимуляции клеток HEK-293/R-GECO1/PH(Akt)-Venus инсулином, запускающим PI3K-сигнализацию посредством активации тирозин-киназных рецепторов [16], регулярно наблюдалось перераспределение флуоресценции сенсора PH(Akt)-Venus из цитозоля к плазматической мембране клетки, причем этот эффект отменялся в присутствии вортманнина или PI828 (рис. 1). Эти данные свидетельствовали о том, что инсулин действительно стимулировал активность PI3K в исследовавшихся клетках, а вортманнин и PI828 эффективно ингибировали PI3K. Для выявления роли PI3K в генерации агонист-индуцированных Ca²⁺-сигналов клетки HEK-293/R-GECO1/PH(Akt)-Venus последовательно стимулировали ацетилхолином и инсулином (схема эксперимента представлена на рис. 2а). Хотя для стимуляции Са²⁺-сигнализации было достаточно аппликации ацетилхолина длительностью 1 мин, PI3K-сигнализация является более медленным процессом [17], и поэтому клетки инкубировали в присутствии ацетилхолина в течение 10 мин. При таком протоколе клетки массово генерировали кратковременные Ca²⁺-ответы в течение первой минуты после начала стимуляции, хотя затем некоторые клетки могли генерировать повторные Ca²⁺-сигналы (рис. 2б, R-GECO1). При этом изменений в пространственном распределении флуоресценции сенсора PIP3 PH(Akt)-Venus, которое в контроле было равномерным, в присутствии ацетилхолина зарегистрировано не было (рис. 2б, PH(Akt)-Venus). В то же время при последующей стимуляции клеток инсулином наблюдалась иная реакция. Оказалось, что инсулин не вызывал детектируемого изменения уровня внутриклеточного Ca²⁺ по отношению к покою, но инициировал аккумуляцию PH(Akt)-Venus у плазматической мембраны клеток, свидетельствуя о PI3K-зависимой генерации PIP3 (рис. 2б).

Рис. 1.

Мониторинг инсулин-индуцированной активности PI3K с помощью сенсора PH(Akt)-Venus. а, б – Репрезентативные последовательные изображения клеток HEK-293/R-GECO1/PH(Akt)-Venus, полученные непосредственно перед (левые панели) и через 5 мин после (средние панели) начала стимуляции 100 нМ инсулина. Падение флуоресценции тела клетки и появление различимых полосообразных флуоресцентных зон (указаны стрелками на средних панелях) свидетельствовали об индуцированном инсулином перераспределении сенсора PH(Akt)-Venus из цитозоля к мембране клеток. На правых панелях представлены изображения клеток, полученные в присутствии 10 мкМ вортманнина (а) и 30 мкМ PI828 (б), которые были добавлены в раствор через 5 мин после инсулина. Локализованный у мембраны после стимуляции инсулином сенсор PH(Akt)-Venus в присутствии ингибиторов PI3K возвращался в цитозоль. Флуоресцентные изображения клеток (а, б) получены с помощью SDCM-микроскопии.

Рис. 2.

PI3K не вовлечена в сигнальные процессы, стимулируемые ацетилхолином. а – Схема протокола эксперимента; моменты и продолжительность аппликаций веществ обозначены горизонтальными линиями выше экспериментальной кривой; моменты получения изображений указаны стрелками; б – репрезентативные последовательные изображения клеток HEK-293/R-GECO1/PH(Akt)-Venus, полученные в контроле (за 30 с до стимуляции ацетилхолином) и после их стимуляции 1 мкМ ацетилхолина и 100 нМ инсулина. На верхней и нижней панелях представлены сигналы от Ca²⁺-сенсора R-GECO1 и PIP3-сенсора PH(Akt)-Venus соответственно. Как видно, аппликация ацетилхолина (1 мкМ) инициировала кратковременное увеличение интенсивности флуоресценции R-GECO1, что свидетельствовало о повышении концентрации цитозольного Ca²⁺. При этом пространственное распределение флуоресценции PH(Akt)-Venus не менялось, что указывает на отсутствие ацетилхолин-зависимой активации PI3K. Стимуляция инсулином (100 нМ) не влияла на флуоресценцию R-GECO1, т.е. не затрагивала внутриклеточный Ca²⁺, но приводила к аккумуляции PH(Akt)-Venus у плазмалеммы клеток (указано стрелками), свидетельствуя об активации PI3K.

Таким образом, полученные данные наглядно демонстрируют, что, стимулируя Са²⁺-сигнализацию, ацетилхолин не инициирует существенную активацию PI3K-пути в клетках HEK-293. Поэтому PI3K не может быть вовлечена в трансдукцию ацетилхолина в клетках HEK-293. Как следствие, хотя результаты работы свидетельствуют об эффективном ингибировании PI3K вортманнином и PI828, последний не мог подавлять Ca²⁺-ответы на ацетилхолин, воздействуя на PI3K, но действовал на какую-то иную клеточную мишень. Ее идентификация представляет собой задачу для последующих исследований.

Авторы благодарят Д.М. Поташникову за помощь в проведении работ по сортировке клеток на клеточном сортере FACSAria SORP в рамках Программы развития МГУ.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 19-75-10068.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.