Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2023, T. 40, № 1, стр. 61-65

ВВЕДЕНИЕ

Фотодинамическая терапия представляет собой одну из интересных реализаций фотонной терапии для лечения рака. Терапевтический эффект достигается за счет использования фотосенсибилизаторов (ФС) органического (порфирины, фталоцианины и др.) или неорганического (например, наночастицы TiO₂, CdSe/CdS, ZnO) происхождения, способных генерировать активные формы кислорода (АФК), включая синглетный кислород и свободные радикалы. Раковые клетки уничтожаются за счет передачи энергии от фотосенсибилизаторов, активируемых светом, к кислороду, что вызывает внутриклеточный окислительный стресс вследствие генерации АФК. Именно АФК, образующиеся при фотовозбуждении ФС, вызывают повреждение ДНК, белков и липидов раковых клеток. Данный подход отличается селективностью и локальностью терапевтического воздействия на опухоль, поскольку разрушение раковых клеток происходит только при облучении зоны опухоли светом определенной длины волны, необходимой для возбуждения накопившегося в клетках ФС [1, 2].

В настоящее время в экспериментальной онкологии развиваются подходы, основанные на разработке адресных ФС, представляющих собой химические конъюгаты с направляющими модулями белковой природы.

Опухоль-ассоциированный антиген HER2 (рецептор 2 эпидермального фактора роста человека), являющийся рецепторной тирозинкиназой, представляет собой привлекательную мишень для адресной терапии рака, поскольку он сверхэкспрессируется в 15–25% случаев рака молочной железы человека и его наличие коррелирует с агрессивной формой развития заболевания [3, 4].

Создание фототоксичных белков KillerRed [5] и miniSOG [6], способных к производству АФК, натолкнуло исследователей на мысль о создании адресных генетически кодируемых ФС. В качестве адресной молекулы может использоваться антитело, его фрагмент или искусственные белки неиммуноглобулиновой природы [7–9].

Фототоксичный белок miniSOG сконструирован на основе фототропина 2 Arabidopsis thaliana и содержит флавинмононуклеотид в качестве кофактора [6]. В хромофорном кармане кофактор связан с белковой глобулой нековалентно. Именно кофактор ФМН определяет фототоксические (генерацию АФК) и флуоресцентные свойства miniSOG под действием синего света [6, 10, 11].

Ранее нами были получены генетически кодируемые ФС на основе miniSOG, способные специфично и селективно взаимодействовать с рецептором HER2 на поверхности раковых клеток [12, 13]. В качестве HER2-специфичного домена в составе ФС использовали мини-антитело scFv4D5 [14] или DARPin_9-29 [15].

Оказалось, что при наличии одного и того же фототоксического модуля в своем составе данные ФС обладают различным цитотоксическим эффектом в отношении HER2-положительных раковых клеток in vitro. Так, IC₅₀ для 4D5scFv-miniSOG составила 0.16 мкМ, в то время как для DARPin-miniSOG это значение равно 0.8 мкМ [12, 13]. Мы предположили, что возможным объяснением такой разницы в цитотоксичности может быть различная способность генерации АФК. Работа посвящена изучению фотоиндуцированной токсичности генетически кодируемыми ФС (4D5scFv-miniSOG и DARPin-mini-SOG) внутри живой клетки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии. В работе использовали HER2-положительную клеточную линию аденокарциномы протоков молочной железы BT-474 (ATCC HTB-20) и линию аденокарциномы молочной железы с нормальным уровнем экспрессии рецептора HER2 – MDA-MB-231 (ATCC HTB-26). Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл пенициллина при +37°С в атмосфере с 5% СО₂. Для проточной цитометрии и опытов по определению АФК снятие клеток с подложки проводили раствором Версена (ПанЭко, Россия) без использования трипсина.

Наработка белков. Экспрессию генов, кодирующих гибридные белки 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG проводили в штамме Escherichia coli BL21(DE3) по методу автоиндукции [16]. Трансформанты E. coli культивировали в среде для автоиндукции ТВР-5052, содержащей 0.1 г/л ампициллина, при 25°C с интенсивной аэрацией до OD₆₀₀ 12–14 ч. Клетки собирали центрифугированием при 6000 g в течение 10 мин при 4°С. Осадок ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ фосфат натрия (Na-P_i), 500 мМ NaCl, рН 7.5, 50 мкг/мл лизоцима), обрабатывали ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе VibraCell (Sonics, США) (режим: 30 раз по 10 с с интервалом в 10 с). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 15 000 g в течение 20 мин при 4°С. Осветленный лизат пропускали через фильтр 0.22 мкм и наносили на колонку Ni²⁺-NTA (GE Healthcare, США), уравновешенную буфером следующего состава: 20 мМ Na-P_i, pH 7.5, 500 мМ NaCl, 30 мМ имидазол. Последующую очистку целевого белка проводили в соответствии с инструкциями производителя колонки His-tag (GE Healthcare, США). Выход очищенного белка составил 40 мг на 1 л культуры для DARPin-miniSOG и 25 мг на 1 л культуры для 4D5scFv-miniSOG.

Проточная цитометрия. Клетки снимали с подложки раствором Версена, осаждали центрифугированием при 100 g в течение 2 мин и ресуспендировали в среде RPMI-1640 без сыворотки до конечной концентрации 10⁶ клеток/мл. К 100 мкл клеточной суспензии добавляли 4D5scFv-miniSOG или DARPin-miniSOG до конечной концентрации 250 нМ. Инкубацию проводили в течение 10 мин в темноте при 37°С, после чего клетки отмывали трижды от не связавшегося с рецептором белка. Флуоресценцию детектировали с использованием проточного цитометра NovoCyte 3000 (ACEA Biosciences) при следующих параметрах: возбуждение – лазер с длиной волны 488 нм, детекция флуоресценции – фильтр 530 ± 30 нм. Для каждого образца исследовали не менее 10 000 событий.

Измерение АФК в живых клетках. Уровень внутриклеточных АФК в клетках BT-474, инкубированных с 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG, определяли путем окрашивания клеток флуоресцентным красителем карбокси-2',7'-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетатом (carboxy-H₂DCFDA, Invitrogen). Для оценки продукции АФК при фотосенсибилизации, опосредованной внешним источником излучения, клетки высевали в 96-луночный планшет и выращивали в течение ночи. Затем к клеткам добавляли белки 4D5scFv-miniSOG или DARPin-miniSOG до конечной концентрации 500 нМ, инкубировали 10 мин при 37°С, отмывали от не связавшихся с рецептором молекул ФС и подвергали облучению светодиодом (465 нм, 55 мВт/см², Ledszone) в течение 10 мин при 37°С. В качестве положительного контроля продукции АФК использовали клетки, обработанные 50 мМ H₂O₂ при 37°C в течение 30 мин. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, инкубированные с 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG, но не подвергнутые облучению. Клетки промывали фосфатно-солевым буфером и инкубировали в ростовой среде с 10 мМ карбокси-H₂DCFDA в течение 1 ч при 37°C. Флуоресценцию окисленной формы карбокси-H₂DCFDA измеряли на планшетном спектрофлуориметре Infinite Pro M1000 (Tecan) с возбуждением при 485 нм и эмиссией в диапазоне 500–̶ 650 нм с шагом 2 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка взаимодействия с рецептором HER2 гибридных белков 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG. Эффективность взаимодействия HER2-специфичных адресных ФС 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG с рецептором HER2 на поверхности раковых клеток оценивали методом проточной цитометрии. Для этого клетки инкубировали с 4D5scFv-miniSOG или DARPin-miniSOG, как описано в “Материалах и методах”. В качестве контроля специфичности взаимодействия использовали клетки аденокарциномы молочной железы MDA-MB-231, характеризующиеся нормальным для клеток эпителиального происхождения уровнем экспрессии рецептора HER2 [17]. Как видно из результатов проточной цитометрии (рис. 1а и 1б), оба белка, 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG, одинаково эффективно взаимодействуют с рецептором HER2 на поверхности HER2-положительных раковых клеток, о чем свидетельствует значительный сдвиг медианы флуоресценции относительно клеток, не обработанных белком. В то же время для клеток MDA-MB-231, инкубированных с 4D5scFv-miniSOG или DARPin-miniSOG, сдвиг медианы флуоресценции относительно контроля остается незначительным (рис. 1б).

Рис. 1.

Функциональная характеристика адресного и цитотоксического модуля в составе генетически кодируемых ФС 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG. а, б – Взаимодействие 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG с рецептором HER2 на поверхности клеток SK-BR-3 (а) и MDA-MB-231 (б). Зеленая кривая соответствует клеткам, не обработанным белками (контроль автофлуоресценции), красная и синяя кривые соответствуют клеткам, обработанным DARPin-miniSOG и 4D5scFv-miniSOG соответственно. в – Определение уровня АФК, индуцируемых 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG при облучении в живой клетке.

Оценка уровня АФК в живых клетках. Принимая во внимание данные проточной цитометрии и данные по цитотоксичности 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG, полученные нами ранее [12, 13], мы предположили, что значительная разница в вызываемом цитотоксическом эффекте этих двух ФС при одинаково эффективном взаимодействии с рецептором, может быть обусловлена различным уровнем генерации АФК.

Для того чтобы оценить уровень продукции АФК, клетки BT-474 инкубировали с белками 4D5scFv-miniSOG или DARPin-miniSOG в течение 10 мин, облучали синим светом и измеряли АФК согласно протоколу, описанному в “Материалах и методах”. Оказалось, что уровень АФК в клетках, обработанных 4D5scFv-miniSOG, примерно в 4 раза выше, чем в клетках, обработанных DARPin-miniSOG (рис. 1в). Вероятным объяснением этому факту может быть различная скорость рецептор-опосредованной интернализации белков 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG, связанная с размером белков. Как было показано нами ранее, DARPin-miniSOG локализуется в ранних эндосомах через 5–7 мин после начала инкубации, попадая в дальнейшем на терминальную деградацию в лизосомы [13], в то время как процесс интернализации 4D5scFv-miniSOG занимает до 30 мин [12]. Кроме того, также ранее было установлено, что интенсивность флуоресценции 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG на поверхности HER2-положительных клеток в условиях, исключающих процесс рецептор-опосредованной интернализации, одинакова [18], а фототоксичность DARPin-miniSOG повышается, если проводить облучение клеток синим светом при пониженной температуре (4°С); IC₅₀ в этом случае составляла 0.2 мМ [19]. Известно, что при пониженной температуре происходит замедление процесса рецептор-опосредованной интернализации. Таким образом, увеличение времени нахождения на мембране или в липидном бислое для DARPin-miniSOG приводит к тому, что его фотоиндуцированный цитотоксический эффект становится сравним с эффектом от 4D5scFv-miniSOG. Известно, что наибольшие фотодинамические повреждения от ФС можно ожидать, когда он локализуется в клеточной мембране, поскольку именно мембрана является главной мишенью для АФК, продуцируемых ФС [20]. Дополнительным фактором, способствующим повреждению липидов при фотодинамической терапии, является высокая растворимость молекулярного кислорода в липидах. Таким образом, в липидной среде у ФС больше шансов, чем в воде, столкнуться с O₂ и выработать АФК. Более того, если в клетке образуются АФК, существует множество ферментативных и неферментативных способов поддержания внутриклеточного окислительно-восстановительного гомеостаза и защиты клетки от различных типов оксидантов. Система защиты клетки от АФК представлена глутатионом, супероксиддисмутазами, пероксиредоксинами, а также белками семейств тиоредоксина и глутаредоксина, каждый из которых имеет специфическую субклеточную локализацию и активность [21]. Принимая во внимание эти факты, а также наши данные по уровню генерации АФК, можно заключить, что скорость интернализации для генетически кодируемых ФС является одним из важных параметров, определяющих фототоксичность 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG.

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, соглашение № 075-15-2020-773.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.