Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2023, T. 40, № 2, стр. 122-132

ВВЕДЕНИЕ

Согласно хемиосмотической теории Митчелла [1, 2] в митохондриях транспорт электронов комплексами электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) сопряжен с векторным переносом Н⁺ из матрикса в межмембранное пространство. Это приводит к запасанию энергии в виде разности электрохимических потенциалов Н⁺ или выраженной в вольтах протон-движущей силы (Δр). Энергия Δр расходуется на синтез АТР Н⁺-АТР-синтазой, а также на связанный с этим транспорт в матрикс ADP и P_i в обмен на АТР [1, 3–7]. Часть энергии Δр рассеивается вследствие пассивной утечки протонов [3, 4, 6, 8, 9]. В отсутствие синтеза АТР в интактных митохондриях пассивная утечка протонов рассматривается как один из основных механизмов потребления кислорода [3, 4, 6, 8, 9]. Наряду с окислительным синтезом АТР, это так называемое свободное дыхание (окисление) имеет важное физиологическое значение. Так, в качестве основных функций свободного дыхания в митохондриях рассматриваются: продукция тепла для поддержания температуры тела у теплокровных животных и ингибирование продукции активных форм кислорода [3, 4, 6, 8, 9].

Для характеристики эффективности генерации Δр комплексами дыхательной цепи Митчеллом предложен стехиометрический коэффициент Н⁺/О, свидетельствующий о количестве протонов, перенесенных комплексами ЭТЦ через внутреннюю мембрану митохондрий при потреблении одного атома кислорода [2]. В том случае, если рассматривается перенос пары электронов каким-либо одним комплексом ЭТЦ, применяется также коэффициент Н⁺/2е^– [3]. В последнее десятилетие достигнут консенсус в вопросе о значениях этих величин для различных комплексов ЭТЦ. Так, комплекс I (NADH-CoQ-редуктаза) при окислении NADH + Н⁺ транспортирует 2 электрона на кофермент Q (CoQ) сопряженно с векторным переносом 3–4 Н⁺ [3, 5, 10, 11]. Окисление CoQН₂ комплексом III (bc₁-комплекс, CoQH₂-цитохром с-редуктаза) сопровождается транспортом 2 электронов на цитохром с, что сопряжено с векторным переносом 2 Н⁺, дополнительно к этому в межмембранное пространство освобождаются 2 Н⁺ [3, 5, 12–14]. В процессе переноса комплексом IV (цитохром c-оксидаза) 2 электронов от цитохрома с до молекулярного кислорода из матрикса захватывается 4 Н⁺ и в межмембранное пространство освобождается 2 Н⁺ с трансмембранным переносом 4 положительных зарядов [3, 5, 15]. Таким образом, при условии, что в расчет принимаются освобожденные в межмембранное пространство протоны, значения коэффициента Н⁺/О (Н⁺/2е^–) составляют 4, 4 и 2 для комплексов I, III и IV соответственно. Если же в расчет принимаются захваченные из матрикса протоны, значения коэффициента Н⁺/О (Н⁺/2е^–) составляют 4, 2 и 4 для комплексов I, III и IV соответственно. Эти значения коэффициентов соответствуют количеству перенесенных положительных зарядов из матрикса в межмембранное пространство [3, 5].

Методы определения коэффициента Н⁺/О (Н⁺/2е^–) для ЭТЦ изолированных митохондрий основаны на регистрации количества перенесенных через мембрану протонов в обмен на проникающий катион (К⁺ в присутствии валиномицина или Са²⁺) [16–18]. В этом случае происходит падение мембранного потенциала (Δψ) и увеличение ΔрН. Очевидно, что такое действие проникающих катионов делает невозможным непосредственное определение значений коэффициента Н⁺/О (Н⁺/2е^–) при различных функциональных состояниях митохондрий, в частности, при окислительном фосфорилировании и при вызванном пассивной утечкой протонов свободном дыхании.

Теоретически обосновано, что, исходя из молекулярной структуры и функции Н⁺-АТР-синтазы, для синтеза 1 молекулы АТР в митохондриях млекопитающих необходимо 2.7–3 протона [3, 19]. Еще 1 протон необходим для электрогенного обмена ADP и Р_i на АТР [3, 7]. Экспериментально установлено, что значения коэффициента ADP/2е^– для комплексов I, III и IV близки к 1, 0.5 и 1 соответственно [20–22]. Исходя из этих данных, значения коэффициента Н⁺/2е^– при окислительном фосфорилировании определены как 4, 2, 4 для комплексов I, III и IV соответственно [3, 20]. Эти значения соответствуют количеству положительных зарядов, перенесенных комплексами дыхательной цепи, что свидетельствует об электрогенных процессах синтеза АТР Н⁺-АТР-синтазой, а также обмена ADP и Р_i на АТР, связанных с совершением работы [3, 7, 19]. Выше уже отмечалось, что свободное дыхание митохондрий обусловлено пассивной утечкой протонов через внутреннюю мембрану [3, 4, 6, 8, 9]. Очевидно, что в этом случае, в отличие от окислительного фосфорилирования, протонами не совершается какой-либо работы. Недавно нами было предположено, что при свободном дыхании митохондрий значения коэффициента Н⁺/О составляют 4, 4 и 2 для комплексов I, III и IV соответственно [23]. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения этой гипотезы.

В митохондриях усиление пассивной утечки протонов с помощью протонофорных разобщителей, таких как 2,4-динитрофенол (ДНФ) и др., сопровождается стимуляцией дыхания и снижением Δр без изменения коэффициента Н⁺/О [24]. Вместе с тем, изначально сопряженная с трансформацией энергии дыхательная цепь может быть модифицирована таким образом, что электроны будут переноситься без формирования Δр [25–29]. В этом случае увеличение скорости дыхания митохондрий без изменения пассивной утечки протонов и Δр сопровождается уменьшением коэффициента Н⁺/О [25, 27]. Этот феномен определен как “декаплинг” (decoupling) или, говоря по-другому, “отключение” [25, 26, 28–30].

В качестве агентов, осуществляющих подобное отключение, наше внимание привлекли: N,N,N',N'-тетраметил-п-фенилендиамин (ТМФД), способный шунтировать комплекс III ЭТЦ путем передачи электронов от CoQН₂ до цитохрома с [25, 31], и α,ω-гексадекандикарбоновая кислота (ГДК), переключающая комплекс III на холостой режим работы [29]. Представляет интерес методический подход, позволяющий вычислить значения коэффициента Н⁺/О (Н⁺/2е^–) для комплексов III и IV в случае свободного дыхания митохондрий при полном отключении одного из них. При окислении митохондриями сукцината в условиях свободного дыхания избирательное полное отключение комплекса III ЭТЦ должно приводить к снижению коэффициента Н⁺/О до значения, характерного для комплекса IV.

В настоящей работе установлено, что ТМФД и ГДК, в используемых концентрациях, стимулируя дыхание митохондрий: а) не оказывают существенного влияния на эффективность окислительного синтеза АТР, б) не усиливают пассивную утечку протонов и в) не влияют на трансформацию энергии комплексом IV ЭТЦ. Принимая во внимание эти данные, на основе экспериментальных исследований в условиях свободного дыхания митохондрий теоретически определены значения коэффициента Н⁺/О для комплексов III и IV ЭТЦ. Установлено, что в митохондриях печени, окисляющих сукцинат при отключении ТМФД и ГДК комплекса III ЭТЦ значение коэффициента Н⁺/О уменьшается с 6 до предельных значений 2. Полученные результаты рассматриваются как свидетельство того, что при свободном дыхании митохондрий значения коэффициента Н⁺/О составляют 4 и 2 для комплексов III и IV соответственно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Митохондрии из печени белых половозрелых крыс самцов (весом 210–250 г) выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью бычьего сывороточного альбумина (БСА) фракции V в соответствии с описанной ранее методикой [28]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ EGTA, 5 мМ MOPS (рН до 7.4 доводили трис). Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали раствор БСА. Во время проведения эксперимента суспензию митохондрий (60–70 мг митохондриального белка в 1 мл) хранили на льду.

Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом при 37°С в термостатируемой ячейке объемом 1 мл с помощью кислородного электрода типа Кларк и установки Oxygraph Plus (Hansatech Instruments, Великобритания). Концентрация в ячейке белка митохондрий – 1.0 мг/мл. Калибровку осуществляли общепринятым методом, при этом концентрация кислорода в указанной среде инкубации, насыщенной воздухом при нормальном атмосферном давлении при 37°С, была принята как 406 мкМ O (203 мкМ O₂) [25]. Скорость дыхания митохондрий выражали как мкМ О/мин.

При исследовании сопряженного с синтезом АТР дыхания митохондрий (окислительного фосфорилирования) применяли метод пульса ADP, как подробно описано в работе [32]. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ KCl, 5 мМ янтарную кислоту, 5 мМ КН₂РО₄, 0.5 мМ EGTA, 2 мМ MgCl₂, 10 мМ MOPS (рН до 7.4 доводили трис). Применяли следующий порядок работы. Сразу после митохондрий в кислородную ячейку добавляли 2 мкМ ротенон и, если это необходимо, ТМФД или ГДК, или ДНФ. В отсутствие указанных активаторов дыхания митохондрии потребляют кислород с низкой скоростью – нами рассматривается как состояние 4а (J_4а). Через 2 мин после внесения ротенона, ТМФД или ГДК, или ДНФ к митохондриям добавляли 200 мкМ ADP, это приводило к многократной стимуляции сопряженного с синтезом АТР дыхания – состояние 3 (J₃). После того как весь добавленный ADP был израсходован в процессе синтеза АТР, митохондрии вновь потребляют кислород с низкой скоростью – состояние 4б (J_4б). Еще через 2 мин после выхода митохондрий в состояние 4б добавляли 50 мкМ ДНФ для определения максимальной скорости транспорта электронов по дыхательной цепи (состояние разобщенное, J_u). В качестве меры эффективности окислительного синтеза АТР применяли, как в работе [32]: скорость синтеза АТР (J_р), коэффициент дыхательного контроля (R_C), стехиометрические коэффициенты ADP/О (P/O). Наряду с этим, для оценки эффективности окислительного фосфорилирования применяется также стехиометрический коэффициент ADP/ΔO (P/ΔO), где ΔO количество кислорода, потребляемого митохондриями в состоянии 3, за вычетом количества кислорода, потребленного в состоянии 4б за тот же промежуток времени [32]. Коэффициент R_C определяли как отношение величин J₃ и J_4б. Коэффициент ADP/O (P/O) определяли с учетом всего количества кислорода потребляемого митохондриями в состоянии 3, как подробно описано в работах [22, 32]. Скорость синтеза АТР (J_р) определяли как произведение величин J₃ и ADP/O. Коэффициент ADP/ΔO определяли как отношение величин скорости синтеза АТР и разности между скоростями дыхания в состояниях 3 и 4б по уравнению: ${{{\text{ADP}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{\text{ADP}}} {\Delta {\text{O}}}}} \right. \kern-0em} {\Delta {\text{O}}}} = {{{{J}_{p}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{J}_{p}}} {\left( {{{J}_{3}} - {{J}_{{4{\text{б}}}}}} \right)}}} \right. \kern-0em} {\left( {{{J}_{3}} - {{J}_{{4{\text{б}}}}}} \right)}}$.

При исследовании несопряженного с синтезом АТР дыхания митохондрий (свободное дыхание, нами рассматривается как состояние 4) применяли среду инкубации следующего состава: 250 мМ сахароза, 5 мМ янтарная кислота, 0.5 мМ EGTA, 10 мМ MOPS (рН до 7.4 доводили трис). Концентрация в ячейке белка митохондрий – 1.0 мг/мл. При регистрации дыхания в полярографическую ячейку сразу после митохондрий добавляли ротенон (2 мкМ) и через 2 мин после этого ТМФД или ГДК в указанных в табл. 2 концентрациях.

Протонофорную активность исследуемых в работе соединений определяли двумя способами. Во-первых, путем индукции набухания деэнергизованных митохондрий печени крыс, инкубированных в изотоническом растворе ацетата калия в присутствии валиномицина, как в работах [33, 34]. Среда инкубации содержала 145 мМ ацетат калия, 0.2 мМ EGTA, 5 мМ цианид натрия, 5 мМ трис, pH 7.4. Во-вторых, путем индукции набухания также деэнергизованных митохондрий печени, инкубированных в изотоническом растворе нитрата аммония [35]. Среда инкубации содержала 135 мM NH₄NO₃, 0.1 мM EGTA, 5 мМ цианид натрия, 10 мM HEPES, pH 7.4. Набухание митохондрий определяли по уменьшению поглощения митохондриальной суспензии при 600 нм с помощью планшетного спектрофотометра Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific, США).

В работе использовали MOPS, трис, ГДК, янтарную кислоту, ТМФД, FCCP, валиномицин, ацетат калия, NH₄NO₃, очищенный от жирных кислот БСА фракции V (Sigma); ротенон, EGTA (Serva); ДНФ, сахарозу, KCl (Fluka); КН₂РО₄, MgCl₂ (Merck).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние ТМФД, ГДК и ДНФ на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий печени. Эффекты ТМФД и ГДК целесообразно сравнить с действием одного из классических протонофорных разобщителей ДНФ. Как следует из данных табл. 1, в отсутствие синтеза АТР (состояние 4а) ДНФ, ТМФД и ГДК в указанных концентрациях стимулируют дыхание митохондрий в 1.96, 1.89 и 1.86 раза соответственно, т.е. в равной степени. В состоянии 3 ДНФ и ТМФД стимулируют, а ГДК ингибирует дыхание митохондрий (табл. 1). Обращает на себя внимание то, что скорости дыхания митохондрий в состояниях 4а (J_4а) и 4б (J_4б) равны как в отсутствие, так и в присутствии изучаемых соединений (табл. 1). Следовательно, в состоянии 4б ТМФД и ГДК не индуцируют гидролиз АТР, образованный в процессе окислительного фосфорилирования. ТМФД стимулирует, а ГДК ингибирует разобщенное 50 мкМ ДНФ до максимального уровня дыхание митохондрий (табл. 1).

Известно, что стимуляция дыхания митохондрий протонофорными разобщителями, в частности ДНФ, сопровождается снижением показателей эффективности окислительного фосфорилирования: J_P, R_C и ADP/O [32, 36, 37], но без изменения коэффициента ADP/ΔO [32]. В наших условиях аналогичные эффекты ДНФ наблюдаются уже при концентрации этого разобщителя 5.5 мкМ (табл. 1). ТМФД, также как ДНФ, снижает R_C, но в отличие от этого разобщителя не оказывает существенного влияния на скорость синтеза АТР (J_P) и коэффициент ADP/O, но увеличивает коэффициент ADP/ΔO (табл. 1). ГДК, также как ТМФД, не оказывает существенного влияния на коэффициент ADP/O, увеличивает коэффициент ADP/ΔO, но снижает скорость синтеза АТР (табл. 1).

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что ТМФД, стимулируя дыхание в состояниях 4а и 4б в равной степени, не оказывает существенного влияния на эффективность окислительного синтеза АТР. Как известно, дыхание митохондрий в состоянии 3 состоит из двух составляющих: сопряженного с синтезом АТР дыхания и свободного дыхания [22, 32]. Ранее нами было обосновано, что при каком-либо воздействии на митохондрии увеличение коэффициента ADP/ΔO без изменения коэффициента ADP/O свидетельствует о том, что при данных условиях скорость свободного дыхания как составляющая скорости дыхания в состоянии 3 меньше скорости дыхания в состоянии 4 [32]. Следовательно, в отличие от протонофорных разобщителей, ТМФД и ГДК в меньшей степени увеличивают скорость свободного дыхания как составляющую дыхания в состоянии 3, чем скорость дыхания в состоянии 4. Подробное выяснение молекулярных механизмов их действия – задача последующих исследований. ГДК отличается от ТМФД только тем, что снижает скорость окислительного синтеза АТР. Такое действие ГДК, по-видимому, обусловлено ингибированием транспорта электронов по дыхательной цепи. Во всех последующих экспериментах концентрация ГДК была не выше 0.1 мМ.

Влияние ТМФД, ГДК и ДНФ на пассивную утечку протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану. При проведении исследований эффекты ТМФД и ГДК сравнивали с действием одного из классических протонофорных разобщителей ДНФ. Концентрации этих соединений, в которых они при окислении сукцината приблизительно в равной степени (в 2.0 раза) стимулируют свободное дыхание, приведены в табл. 1.

Одним из методов оценки способности различных соединений транспортировать протоны через внутреннюю митохондриальную мембрану является регистрация набухания органелл в изотоническом растворе ацетата калия в присутствии валиномицина [33, 34]. С помощью этого метода определяется транспорт протонов из матрикса в межмембранное пространство, т.е. в направлении противоположном пассивной утечке протонов через внутреннюю мембрану энергизованных митохондрий [33, 34].

Другим методом оценки способности различных соединений транспортировать протоны через внутреннюю митохондриальную мембрану является регистрация набухания органелл в изотоническом растворе нитрата аммония [35]. Индукция протонной проводимости при одновременном транспорте NH₃ и ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ приводит к накоплению в матриксе осмотически активных ионов ${\text{NH}}_{4}^{ + }$, ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ и вследствие этого набуханию митохондрий. Этот метод позволяет определить наличие транспорта протонов из межмембранного пространства в матрикс, как это характерно для пассивной утечки протонов через внутреннюю мембрану энергизованных митохондрий. Вместе с тем известно, что транспорт таких анионов как ${\text{NO}}_{3}^{ - }$, SCN^– и др. через внутреннюю мембрану митохондрий осуществляется при участии анионного канала, который может блокироваться гидрофобными соединениями [38]. Сказанное в полной мере относится и к методу оценки способности ТМФД транспортировать протоны через внутреннюю митохондриальную мембрану путем регистрации набухания органелл в изотоническом растворе роданида аммония [25]. В настоящей работе для оценки влияния ТМФД и ГДК на транспорт протонов были применены оба описанных выше метода.

Как видно из рис. 1а, ДНФ в концентрациях 5.5 мкМ эффективно индуцирует снижение оптической плотности суспензии деэнергизованных митохондрий, инкубируемых в изотонической среде ацетата калия, что свидетельствует об увеличении проницаемости внутренней митохондриальной мембраны для протонов. В отличие от этого разобщителя 0.1 мМ ГДК и ТМФД вплоть до концентрации 0.2 мМ не оказывают существенного влияния на снижение оптической плотности суспензии митохондрий (рис. 1а). Следовательно, ГДК и ТМФД не влияют на проницаемость внутренней мембраны митохондрий для протонов при условии их перемещения из матрикса в межмембранное пространство. Как показано на рис. 1б, ДНФ в той же концентрации также эффективно индуцирует снижение оптической плотности суспензии деэнергизованных митохондрий, инкубируемых в изотоническом растворе нитрата аммония. ГДК и ТМФД в указанных концентрациях не оказывают существенного влияния на снижение оптической плотности суспензии митохондрий (рис. 1б). Следовательно, ГДК и ТМФД также не усиливают проницаемость внутренней мембраны митохондрий для протонов при условии их перемещения из межмембранного пространства в матрикс.

Таким образом, результаты исследований, полученные двумя независимыми методами, свидетельствуют о том, что ТМФД и ГДК, в отличие от протонофорных разобщителей, стимулируют дыхание митохондрий без усиления пассивной утечки протонов. Эти данные подтверждают известные ранее, полученные другими методами результаты [25, 29].

Исследовано влияние ТМФД и ГДК на трансформацию энергии цитохром с-оксидазой. В качестве доноров электронов, передающих электроны непосредственно на цитохром с, используются ферроцианид с аскорбатом [22, 29]. В наших экспериментах, как и в предыдущей работе [29], использовали ферроцианид и аскорбат в концентрации 10 и 5 мМ соответственно. Установлено, что в этих условиях ДНФ стимулирует дыхание до максимального уровня уже в концентрации 30 мкМ. Увеличение концентраций и ферроцианида, и аскорбата не влияет на скорость дыхания как в отсутствие, так и в присутствии ДНФ (данные не приведены). При окислении ферроцианида с аскорбатом скорость дыхания в отсутствие и в присутствии 0.2 мМ ТМФД составляет 76.2 ± 5.81 и 82.0 ± 6.12 мкМ О/мин (n = 4) соответственно. 30 мкМ ДНФ стимулирует скорость дыхания в отсутствие и в присутствии 0.2 мМ ТМФД до 193.0 ± ± 14.73 и 209.6 ± 15.11 мкМ О/мин (n = 4) соответственно. Как показано нами ранее [29] и подтверждено в настоящей работе (данные не приведены), при окислении ферроцианида с аскорбатом ГДК не влияет на дыхание митохондрий в состоянии 4, но частично ингибирует разобщенное 30 мкМ ДНФ дыхание. Следовательно, ТМФД и ГДК не оказывают существенного влияния на трансформацию энергии цитохром с-оксидазой. Эти данные свидетельствуют о том, что при окислении митохондриями сукцината десопрягающее действие этих соединений заключается в избирательном отключении комплекса III ЭТЦ от генерации Δр.

Теоретическое обоснование и экспериментальное исследование применения ТМФД и ГДК как инструмента для определения значений коэффициента Н⁺/О комплексов III и IV. Свободное дыхание митохондрий в отсутствие синтеза АТР или действия разобщителей (дыхание в состоянии 4) определяется пассивной утечкой протонов по эндогенным путям [36, 39]. Скорость пассивной утечки протонов (${{{v}}_{{{{{\text{H}}}^{ + }}}}}$) в стационарном состоянии может быть определена как произведение скорости дыхания и коэффициента Н⁺/О [8, 27]. Как уже отмечалось во введении, увеличение скорости дыхания митохондрий без изменения ${{{v}}_{{{{{\text{H}}}^{ + }}}}}$ сопровождается уменьшением коэффициента Н⁺/О [25, 27]. Очевидно, что при этих условиях справедливо уравнение:

где, ${{J}_{4}}$ и ${{J}_{{\text{A}}}}$ – скорости дыхания в состоянии 4 в отсутствие и в присутствии стимулирующих дыхание эффекторов (ТМФД или ГДК) соответственно, ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{4}}$ и ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ – коэффициенты Н⁺/О в отсутствие и в присутствии этих стимулирующих дыхание эффекторов соответственно.

Исходя из уравнения (1), коэффициент ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ может быть определен как:

В том случае, если скорость дыхания при повышении концентрации активатора стремится к своему максимальному значению (${{J}_{{{\text{Amax}}}}}$), коэффициент ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ стремится к наименьшей величине ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{{\text{Аmin}}}}}$ согласно уравнению: При окислении сукцината митохондриями в состоянии 4 в генерации Δр принимают участие только III и IV комплексы дыхательной цепи. Хорошо установлено, что в этом случае значение коэффициента Н⁺/О равно 6 [3, 5, 20, 40]. Если при окислении сукцината и при условии постоянного значения Δр полностью и избирательно переключить комплекс III на холостой режим работы (транспорт электронов без генерации Δр), то скорость дыхания в состоянии 4 достигнет максимальной величины ${{J}_{{{\text{Amax}}}}}$. В этом случае в трансформации энергии принимает участие только комплекс IV, и, следовательно, по уравнению (3) можно определить значение коэффициента Н⁺/О для этого комплекса.

В табл. 2А приведены значения скорости свободного дыхания митохондрий и рассчитанные по уравнению (2) значения коэффициента ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ при последовательно повышающихся концентрациях ТМФД вплоть до 0.3 мМ в отсутствие и в присутствии ГДК. Как видно из таблицы, при окислении сукцината ТМФД эффективно стимулирует дыхание митохондрий. Последующее внесение 50 мкМ ДНФ приводит к дальнейшей стимуляции дыхания (табл. 2А). Стимулирующее действие ТМФД сопровождается снижением коэффициента ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ (табл. 2А). ГДК в концентрации 0.07 мМ стимулирует дыхание митохондрий в отсутствие и в присутствии ТМФД в концентрациях 0.05 и 0.1 мМ и ингибирует в присутствии 50 мкМ ДНФ (табл. 2А). ГДК существенно снижает коэффициент ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$, но только при концентрации ТМФД не более 0.05 мМ (табл. 2А).

В табл. 2Б приведены значения скорости свободного дыхания митохондрий и рассчитанные по уравнению (2) значения коэффициента ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ при последовательно повышающихся концентрациях ГДК в присутствии и в отсутствие ТМФД. Как видно из табл. 2, ГДК вплоть до концентрации 0.1 мМ стимулирует дыхание митохондрий, внесение ДНФ в указанной концентрации также приводит к дальнейшей стимуляции дыхания (табл. 2Б). Стимулирующее действие ГДК сопровождается снижением коэффициента ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$. ТМФД в концентрации 0.1 мМ стимулирует дыхание митохондрий в отсутствие и в присутствии ГДК (табл. 2Б). ТМФД, стимулируя дыхание в отсутствие и в присутствии ГДК, существенно снижает коэффициент ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ (табл. 2Б).

Полученные результаты можно было бы формально рассматривать как свидетельство аддитивного действия ТМФД и ГДК при стимуляции дыхания и снижении коэффициента ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$. Однако по мере увеличения концентрации ТМФД действие ГДК ослабляется так же, как по мере увеличения концентрации ГДК ослабляется действие ТМФД. Следовательно, такое аддитивное действие могло быть обусловлено тем, что ТМФД и ГДК в указанных концентрациях не достигают своего максимального эффекта.

Эффективность действия ТМФД и ГДК может быть выражена количественно как величина снижения коэффициента Н⁺/О ($\Delta {{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$) по уравнению:

Очевидно, что, если концентрации ТМФД и ГДК стремятся к бесконечно большим значениям, их эффект достигает максимальной величины ($\Delta {{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{{\text{Аmax}}}}}$). В этом случае справедливо уравнение: Принимается, что зависимость коэффициента $\Delta {{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ от концентрации ТМФД или ГДК может быть описана с помощью уравнения: где К_0.5 – концентрации ТМФД и ГДК, при которых их эффект достигает 1/2 от максимальной величины.

Используя уравнения (4) и (5), уравнение (6) можно преобразовать как:

В соответствии с уравнением (7) исследовали при различных концентрациях ТМФД и ГДК зависимость ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ от величины ${{\Delta {{{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}}_{{\text{А}}}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{\Delta {{{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}}_{{\text{А}}}}} {\left[ A \right]}}} \right. \kern-0em} {\left[ A \right]}}$. Эту величину можно рассматривать как удельные активности ТМФД и ГДК. Как видно из рис. 2а, зависимость значений коэффициента ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ от удельных активностей ТМФД (1) и ГДК (2) линейна в соответствии с уравнением (9). Точка пересечения экспериментальной прямой с осью ординат определяет величину ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{{\text{Аmin}}}}}$. Значение этой величины составляет 2 как при максимальном эффекте ТМФД, так и при максимальном эффекте ГДК (рис. 2а).

На рис. 2б зависимость коэффициента ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{\text{А}}}}$ от удельных активностей ТМФД в присутствии ГДК (1) и ГДК в присутствии ТМФД (2). В этом случае точка пересечения экспериментальной прямой с осью ординат также определяет величину ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{{\text{Аmin}}}}}$. Значение этой величины также составляет 2 как при максимальном эффекте ТМФД в присутствии ГДК, так и при максимальном эффекте ГДК в присутствии ТМФД (рис. 2б). При совместном действии ТМФД и ГДК коэффициент ${{({{{{{\text{Н}}}^{ + }}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{{\text{Н}}}^{ + }}} {\text{О}}}} \right. \kern-0em} {\text{О}}})}_{{{\text{Аmin}}}}}$ достигает такой же величины, как при действии этих агентов по отдельности. Следовательно, действие ТМФД и ГДК при достижении их максимальных эффектов неаддитивное. Как известно, ТМФД, будучи редокс-активным соединением, способен шунтировать комплекс III путем передачи электронов от CoQН₂ до цитохрома с [25, 31]. В то время как ГДК, не обладая способностью транспортировать электроны, переключает комплекс III на холостой режим работы по другому механизму [29]. Вполне вероятно, что при совместном действии ТМФД и ГДК до максимального уровня происходит полное отключение комплекса III от генерации Δр. При этих условиях в генерации Δр будет принимать участие только комплекс IV, и характеризующий работу этого комплекса коэффициент Н⁺/О равен 2.

Таким образом, при свободном дыхании митохондрий в отличие от окислительного фосфорилирования значения коэффициента Н⁺/О составляют 4 и 2 для комплексов III и IV соответственно. Как уже отмечалось во введении, электрогенные процессы синтеза АТР Н⁺-АТР-синтазой, а также обмена ADP и Р_i на АТР связаны с совершением работы [3, 7, 19]. Исходя из термодинамических расчетов, обосновано, что значения коэффициента Н⁺/2е^– для комплексов I, III и IV составляют 4, 2 и 4 соответственно [3]. В отличие от окислительного синтеза АТР при свободном дыхании пассивная утечка протонов из межмембранного пространства в матрикс не сопровождается совершением работы. Как уже предполагалось нами ранее [41], в отсутствие синтеза АТР и разобщения (при свободном дыхании) возвращение протонов из межмембранного пространства в матрикс осуществляется путем простой диффузии протонов через какие-либо каналы внутренней мембраны митохондрий. Можно полагать, что скорость диффузии зависит от общего количества протонов, освобождаемых комплексами ЭТЦ в межмембранное пространство.

Суммируя полученные данные, можно сделать следующие выводы:

1. При окислении сукцината митохондриями печени ТМФД и ГДК эффективно стимулируют свободное дыхание (в состояниях 4а и 4б), и такое их действие, в отличие от протонофорного разобщителя ДНФ, не вызвано индукцией протонной проводимости внутренней мембраны. Эти соединения, стимулируя свободное дыхание и снижая коэффициент дыхательного контроля, в отличие от ДНФ не оказывают существенного влияния на коэффициент ADP/O, но увеличивают коэффициент ADP/ΔO. В отличие от протонофорных разобщителей ТМФД и ГДК в меньшей степени увеличивают скорость свободного дыхания как составляющей части скорости дыхания в состоянии 3, чем скорость дыхания в состоянии 4.

2. ТМФД и ГДК не оказывают влияния на трансформацию энергии цитохром с-оксидазой. Следовательно, десопрягающее действие этих соединений при окислении митохондриями сукцината заключается в избирательном отключении комплекса III ЭТЦ от генерации Δр.

3. Теоретически обосновано, что коэффициент Н⁺/О может быть определен исходя из отношения скоростей дыхания в отсутствие и в присутствии ТМФД и ГДК. Под влиянием ТМФД или ГДК значение коэффициента Н⁺/О уменьшается при окислении сукцината с 6 до предельных значений 2. Таким образом, в митохондриях печени при свободном дыхании в отличие от окислительного синтеза АТР значения коэффициента Н⁺/О составляют 4 и 2 для комплексов III и IV соответственно.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (№ 20-015-00124).

Соответствие принципам этики. Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.