Биология моря, 2021, T. 47, № 2, стр. 121-129

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Образцы бурой водоросли Thalassiophyllum clathrus были собраны в третьей декаде августа в Авачинском заливе на выходе из Авачинской бухты в районе мыса Маячный на глубине 6 м (восточное побережье п-ва Камчатка). Для исследований брали пластины целиком; образцы сушили на воздухе, измельчали, запаковывали и хранили при температуре –18°С. Для экстракции полифенолов образцы воздушно-сухой водоросли измельчали на программируемой шаровой мельнице WiseStir (модель ВМL-2, Республика Корея) со скоростью вращения до 600 об/мин. Остаточная влага в водоросли составляла 5.1%.

Экстракцию и фракционирование полифенолов проводили в соответствии с ранее предложенным методом (Kim et al., 2009) c учетом рекомендаций других авторов (Lee et al., 2012; Lim et al., 2019). В работе использовали аналитически чистые растворители (HPLC, ≥97.0%). Образец массой 500 г помещали в термостойкую колбу, в которую добавляли 2 л этанола, нагретого до 70°С. Колбу выдерживали при периодическом встряхивании и комнатной температуре в течение 3 ч. Экстракцию повторяли трижды. Объединенный спиртовый экстракт концентрировали упариванием на роторном вакуумном испарителе при температуре 40°С до постоянной массы. Этанольный экстракт последовательно экстрагировали смесью гексан : вода (1 : 1), дихлорметаном, этилацетатом и бутанолом в соотношении 1 : 1 (w : w). Схема фракционирования и масса каждой фракции приведены на рис. 1.

Рис. 1.

Схема последовательной экстракции полифенолов из Thalassiophyllum clathrus.

Для выделения отдельных фракций полифенолов использовали ступенчатую экстракцию растворителями разной полярности (рис. 1). Из 500 г высушенного образца T. clathrus было получено 175.2 г спиртового экстракта, который подвергали дальнейшему фракционному разделению с использованием гексана, дихлорметана, этилацетата и бутанола. Во всех полученных экстрактах определяли общее содержание полифенолов и антиоксидантную активность.

Этилацетатный экстракт растворяли в метаноле и фракционировали на колонке Sephadex LH-20 (Merck, 50 × 2.5 см) метанолом, последовательно собирая фракции. Качественный состав фракций оценивали с помощью метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) и объединяли фракции сходного состава (всего было получено 11 фракций). Фракции Ф5, Ф6 и Ф7, имевшие характерную для полифенолов абсорбцию в УФ свете, подвергали повторному разделению на колонке Sephadex LH-20 (Merck, 50 × 1 см) с метанолом в качестве подвижной фазы. Для анализа качественного состава полифенолов было отобрано шесть фракций: Ф5.1, Ф5.2, Ф6.1, Ф6.2, Ф7.1 и Ф7.2.

ТСХ проводили на стеклянных пластинах (LuxPlate Silica gel 60 F 254, Merck). В качестве подвижной фазы использовали смесь хлороформ : этанол : уксусная кислота : вода в соотношении 50 : 25 : 3 : 4. Пятна на хроматограммах визуализировали в УФ свете при 254 и 365 нм.

Общее содержание полифенолов определяли в соответствии с модифицированным методом Фолина–Чекольте (Koivikko et al., 2005), используя галловую кислоту (Sigma–Aldrich) в качестве стандарта, и выражали в миллиграммах галловой кислоты на 1 г экстракта.

Антиоксидантную активность (АОА) растворов определяли с использованием 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH) (Molyneux, 2004). АОА выражали в единицах эффективной концентрации (ЕС₅₀), равных количеству исследуемого экстракта, снижающего интенсивность окраски DPPH на 50%. Чем ниже EC₅₀, тем выше антиоксидантные свойства экстракта. Антиоксидантную активность EC₅₀ образцов сопоставляли с EC₅₀ аскорбиновой кислоты, которую определяли по реакции с DPPH в одинаковых условиях.

Антиоксидантную активность в единицах Тролокса определяли с помощью метода Ре с соавторами (Re et al., 1999) с использованием диаммониевой соли 2,2-азино-бис-3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты (ABTS). АОА выражали в микромолях Тролокса на 1 г исследуемого экстракта.

Спектры полифенольных фракций T. clathrus в видимой области УФ-излучения снимали на планшетном спектрофотометре Polarstar Omega (BMG Labtech GmbH, Германия).

Качественный состав полифенолов исследовали на высокоэффективном жидкостном хроматографе Shimadzu Liquid Chromatograph (Japan), оснащенном двумя насосами LC-10AD, автосемплером SIL-10AС и диодноматричным детектором SPD-M20A. В качестве неподвижной фазы использовали колонку Discovery C18, 5 мкм, 25 см × 4.6 мм (Supelco Analytical, Sigma). Для разделения использовали градиент растворителей А (вода, 0.1% муравьиная кислота) и В (ацетонитрил, 0.1% муравьиная кислота). Профиль элюирования подвижной фазы: 0–5 мин, 100% A; 5–60 мин, 70% A; 60–70 мин, 70–40% A; 70–80 мин, 40% A; 80–90 мин, 40–100% A. Полифенольные компоненты детектировали при 254, 280 и 365 нм (поток 1 мл/мин, температура 25°С, объем пробы 25 мкл). В качестве стандартных растворов использовали галловую, хлорогеновую и кофейную кислоты, а также рутин, кверцетин, апигенин и кемпферол (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA).

Измерения проводили трижды, данные анализировали с помощью программного обеспечения Statistica 7. Коэффициент корреляции рассчитывали по методу Пирсона. Результаты выражали в виде среднего значения со стандартным отклонением. Значения с 95% доверительным интервалом (Р < 0.05) считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Общее количество полифенолов бурой водоросли Thalassiophyllum clathrus изменялось от 56.1 мг/г в гексановом экстракте до 581.2 мг/г в экстракте, полученном с использованием этилацетата (табл. 1). АОА экстракта, полученного с использованием этилацетата, составляла 22.0 ± 0.1 мкг/мл в единицах ЕС₅₀ DPPH и 5.84 ± 1.64 мкмоль/г в эквиваленте Тролокса, что соответствует максимальной АОА среди исследованных фракций. Экстракт, полученный с использованием дихлорметана, содержал 324.2 ± 2.6 мг/г полифенолов, но показывал низкую АОА (39.5 ± 0.4 мкг/мл в единицах ЕС₅₀ и 0.82 ± 0.11 мкмоль/г в эквиваленте Тролокса).

Экстракт, полученный с помощью этилацетата, использовали для дальнейшей очистки с применением препаративной колоночной хроматографии. Состав каждой фракции оценивали методом ТСХ, объединяя фракции сходного состава. Были получены шесть фракций полифенолов (Ф5.1, Ф5.2, Ф6.1, Ф6.2, Ф7.1, Ф7.2), поглощающих при 254 и 365 нм.

Все очищенные фракции полифенолов, выделенные из этилацетатного экстракта, проявляли антиоксидантную активность (рис. 2). Максимальной АОА 3.02 ± 0.5 мкг/мл (DPPH) характеризовалась фракция Ф7.1, что выше АОА аскорбиновой кислоты (ЕС₅₀ = 4.50 ± 0.02 мкг/мл). В эквивалентах Тролокса активность также была максимальной и составляла 6.3 ± 0.5 мкмоль/г. Антиоксидантная активность, сопоставимая с таковой аскорбиновой кислоты, была обнаружена для фракций Ф5.2 (ЕС₅₀ = 5.9 ± 0.6 мкг/мл), Ф6.1 (ЕС₅₀ = 5.6 ± 0.4 мкг/мл) и Ф6.2 (ЕС₅₀ = 5.2 ± 0.5 мкг/мл).

Рис. 2.

Антиоксидантная активность отдельных фракций экстракта Thalassiophyllum clathrus. 1 – DPPH антиоксидантная активность, 2 – ABTS антиоксидантная активность.

При анализе фракций методом ТСХ было отмечено шесть зон с бурой, коричневой и желто-коричневой окраской, времена удерживания (Rt) которых составляли 2.4 см (Ф7.1), 3.0 см (Ф7.2), 3.3 см (Ф6.2, Ф7.1), 3.7 см (Ф7.2), 4.0 см (Ф5.2, Ф6.1, Ф6.2, Ф7.1) и 4.4 см (Ф5.1, Ф5.2, Ф6.1, Ф6.2) при визуализации в УФ свете при 254 нм. При визуализации в УФ свете при 365 нм было отмечено три зоны с ярко-синим окрашиванием и временем удерживания 3.0 см (Ф7.1), 3.3 см (Ф5.1, Ф6.1) и 5.8 см (Ф5.1, Ф5.2); одна зона с ярким сине-зеленым окрашиванием и временем удерживания 6.5 см (Ф5.1), а также пять зон с темно-синим окрашиванием и временем удерживания 2.4 см (Ф7.1), 3.3 см (Ф6.2), 4.0 см (Ф5.2, Ф6.1, Ф6.2, Ф7.1), 4.4 см (Ф5.1, Ф5.2), 6.2 см (Ф5.2, Ф6.2, Ф7.1).

УФ спектры исследованных фракций Ф5.1, Ф6.2, Ф7.1 и Ф7.2 (рис. 3) имели четко выраженные максимумы УФ поглощения. Для фракции Ф5.1 отмечены два максимума при 266 и 372 нм и небольшое плечо в диапазоне 300 нм. Фракция Ф6.2 имела два максимума при 270 и 370 нм и плечо при 295 нм. Фракция Ф7.1 характеризовалась тремя максимумами при 254, 295 и 375 нм, а фракция Ф7.2 – одним четким максимумом при 274 нм и небольшим плечом при 328 нм. Спектры фракций Ф5.2 и Ф6.1 (на рис. 3 не приведены) имели два максимума УФ поглощения в диапазоне 250–280 и 350–370 нм с величиной оптической плотности 0.3–0.4 единицы.

Рис. 3.

УФ спектры отдельных фракций экстракта Thalassiophyllum clathrus.

Для анализа состава полифенольных фракций T. clathrus использовали метод ВЭЖХ в градиентом режиме элюирования. Соединения идентифицировали путем сравнения времен удерживания с таковыми стандартных полифенолов (табл. 2).

Исследуемые полифенольные фракции T. clathrus с применением ВЭЖХ анализировали при трех длинах волн: 254, 280 и 365 нм. Хроматограммы компонентов, полученные при 254 и 280 нм, были практически идентичны, различия наблюдались лишь в интенсивности отдельных пиков. Для фракций Ф5.1, Ф5.2, Ф6.1 и Ф6.2 (рис. 4а, 4б, 4в, 4г) наиболее информативными были хроматограммы, полученные при 254 нм, на которых можно выделить от одного до четырех основных пиков с временами удерживания 9.2 ± 0.2 мин (Ф5.1, Ф5.2), 18.9 ± 0.5 мин (Ф5.2, Ф6.1, Ф6.2) и 24.5 ± 0.1 мин (Ф6.2). Анализ хроматограмм при λ = 365 нм для этих фракций показал наличие только минорных компонентов с низкой интенсивностью светопоглощения. Для фракции Ф7.1 при длине волны 254 нм (рис. 5а) идентифицировались 5 пиков, время удерживания которых составляло 17.1 ± 0.2, 23.5 ± 0.4, 27.9 ± 0.4, 30.7 ± 0.4 и 35.2 ± 0.8 мин. Для фракции Ф7.1 при 365 нм (рис. 5б) определялись один основной пик со временем удерживания 35.2 ± 0.5 мин и один минорный пик со временем удерживания 27.9 ± 0.1 мин.

Рис. 4.

Распределение отдельных фракций экстракта Thalassiophyllum clathrus по результатам ВЭЖХ при длине волны 254 нм. Фракции: а – Ф5.1; б – Ф5.2; в – Ф6.1; г – Ф6.2.

Рис. 5.

Распределение фракции экстракта Thalassiophyllum сlathrus (Ф7.1) по результатам ВЭЖХ при длинах волн 245  (а) и 365 нм (б).

ОБСУЖДЕНИЕ

При анализе состава полифенолов первичной является предварительная очистка экстракта от сопутствующих веществ (белки, пигменты и др.), которые могут переходить в полифенольную фракцию при экстракции (Боголицын и др., 2019). Использование растворителей возрастающей полярности дает возможность выделить отдельные соединения или группу веществ из спиртового экстракта исследуемого образца (Palomino et al., 1996). Среди полученных нами экстрактов (гексан, дихлорметан, этилацетат, бутанол и вода) самый высокий выход экстрагируемых веществ (8.2%) отмечен у водной фракции Thalassiophyllum clathrus. Это обусловлено тем, что в водном экстракте концентрируются соли, полисахариды и другие водорастворимые компоненты. Высокий процент выхода при экстракции гексаном и дихлорметаном (соответственно 3.9 и 2.5%) связан с выделением пигментов, жирных кислот и стеролов. Количественный выход компонентов, экстрагируемых этилацетатом и бутанолом, был достаточно низким – 1.1% для этилацетата и 2.1% для бутанола. Максимальное количество полифенолов экстрагировалось этилацетатом (581.2 ± 8.4 мг/г), что согласуется с данными других исследователей (Liu, Gu, 2012; Wei et al., 2016).

Между содержанием полифенолов и антиоксидатной активностью была установлена корреляционная связь с коэффициентами корреляции 0.79 (DPPH) и 0.83 (ABTS). В экстракте, полученном с применением этилацетата, была определена максимальная антиоксидантная активность, соответствовавшая максимальному содержанию полифенолов (табл. 1). Активность фракции, полученной с использованием дихлорметана, была в 1.5 раза ниже, чем АОА бутанольного экстракта в единицах ЕС₅₀ DPPH, и в 3.5 раза ниже в единицах Тролокса. При этом содержание полифенолов в экстракте, полученном с использованием дихлорметана, было в 1.3 раза выше, чем в экстракте, полученном с использованием бутанола. Можно предположить, что фракция полифенолов, выделенная при экстракции бутанолом, характеризуется более высокой антиоксидантной активностью в пересчете на 1 мг полифенолов; вероятно, это связано с составом и структурой отдельных полифенольных компонентов. Возможно, именно структурные особенности данных полифенолов являются наиболее важными в формировании их окислительно-восстановительной способности. К такому выводу пришли и другие авторы, исследовавшие корреляцию между флавоноидами, продуктами окисления флавоноидов и окислительным стрессом (Williams et al., 2004; Öztürk et al., 2007). Некоторые авторы сообщают о корреляции АОА с общим содержанием полифенолов (Oomah et al., 2011; Xia et al., 2014), при этом отмечают, что активность зависела как от состава использованного экстрагента, так и от типа фенольного соединения (Vasco et al., 2008). Показана связь между молекулярной массой и антиоксидантной активностью полифенольных компонентов бурых водорослей (Bogolitsyn et al., 2019). Отсутствие полной корреляции между АОА и содержанием полифенолов можно объяснить также тем, что фенольные соединения не являются единственным источником антиоксидантных веществ в образцах (Облучинская, 2018). Подтверждением того, что антиоксидантная активность зависит от структуры и состава полифенолов, служат и различия в АОА отдельных фракций полифенолов (рис. 2).

Предварительные выводы о составе полифенолов T. clathrus можно сделать из анализа результатов ТСХ. Пятна флавоноидов на хроматограммах, как правило, не окрашены или очень слабо окрашены, поэтому недостаточно хорошо просматриваются в видимой области спектра, но хорошо визуализируются в УФ свете. Флавоны, флаваноны и гликозиды демонстрируют зоны желто-коричневого окрашивания в УФ свете при 254 нм. Фенольные кислоты характеризуются ярко-синим окрашиванием в УФ свете при 365 нм (Wagner, Bladt, 1996). Сравнение времени удерживания компонентов и стандартных полифенолов на ТСХ пластинах (табл. 3) показало, что в полученных фракциях Ф5.1, Ф5.2, Ф6.1 и Ф6.2 содержались фенольные кислоты, в частности, галловая кислота (Rt = 4.4) и кофейная кислота (Rt = 5.8). Наличие кофейной кислоты или ее производных, характеризующихся ярко-синей окраской при визуализации при 365 нм, отмечено в образцах Ф5.1, Ф5.2, Ф6.1 и Ф7.1. Зоны адсорбции с темно-синей окраской и временем удерживания, сходным с таковым кверцетина и кемпферола (Rt = = 6.2–6.4), отмечены для фракций Ф5.1, Ф5.2, Ф6.2 и Ф7.1.

Используя УФ-спектрофотометрию растворов исследованных полифенолов, можно выявить их определенные структурные особенности. Как правило, УФ спектр полифенолов характеризуется двумя максимумами поглощения, положение и интенсивность которых зависят от структурных различий. Приведенные на рис. 3 УФ спектры отдельных фракций экстракта T. clathrus имеют две основные зоны интенсивного поглощения: 250–270 и 370 нм. Для фракций Ф5.1, Ф6.2 и Ф7.1 интенсивность в области 370 нм ниже интенсивности при 250–270 нм, что характерно для флавоноловых агликонов (кверцетин, кемпферол) (Escarpa, González, 2000). Увеличение интенсивности поглощения в области 270 нм может быть связано с присутствием галловой кислоты (Ф5.1, Ф7.1). УФ спектр фракции Ф7.2 содержит две главные полосы при 240–270 и 310 нм, что характерно для веществ кумариновой природы (Гужва, 2012).

При изучении сложных природных объектов с использованием хроматографического метода разделения важной стадией является идентификация разделяемых компонентов. Поскольку исследуемые полифенолы имеют широкий диапазон полярности, для их анализа используют градиентный режим элюирования с уменьшением полярности (Rajauria, 2018; Боголицын и др., 2019). Еще одним определяющим фактором, влияющим на разделение веществ фенольной природы, является величина рН подвижной фазы. Нестабильность сорбента колонки при рН ниже 2.0, с одной стороны, и диссоциация фенолкарбоновых и коричных кислот при рН выше 3.0, с другой стороны, ограничивают выбор рН элюирующего буфера диапазоном от 2.0 до 3.0. Для хроматографического разделения стандарных полифенолов и идентификации исследуемых фракций экстракта T. clathrus использовали элюенты: А – вода, В – ацетонитрил, с добавлением муравьиной кислоты до рН 3.0. Данные условия были оптимальными для хроматографического разделения и детектирования как стандартных смесей полифенолов, так и исследованных экстрактов. Выбор длин волн 254, 280 и 365 нм обусловлен тем, что они являются характерными для определения производных бензола, фенольных кислот и альдегидов (Andlauer et al., 1999; Rodríguez-Delgado et al., 2001).

Как видно на рис. 4а, фракция Ф5.1 содержит один компонент, время удерживания которого совпадает со временем удерживания стандарта галловой кислоты при 254 и 280 нм. Наличие галловой кислоты в этой фракции подтверждено данными УФ спектра и ТСХ анализа. Хроматограмма фракции Ф5.2 характеризуется двумя пиками при 254 и 280 нм, время удерживания составляет соответственно 9.4 и 18–19 мин. Сопоставляя данные ВЭЖХ анализа, УФ спектра и ТСХ анализа, можно предположить, что фенольные кислоты являются основным компонентом этой фракции, причем доминирует хлорогеновая кислота или ее производные. Отмечен также минорный пик со временем удерживания 28 мин, что соответствует времени удерживания кофейной кислоты. Наличие кофейной кислоты подтверждается и характерным ярко-синим окрашиванием на ТСХ в зоне адсорбции стандарта кофейной кислоты. Следует отметить появление широкого пика для фракции Ф5.2 в диапазоне 65–89 мин, образованного перекрывающимися веществами с близкими временами удерживания, что может быть связано с увеличением числа изомеров близкой полярности (Adamson et al., 1999; Lazarus et al., 1999). Время удерживания этого пика характерно для апигенина и кемпферола. Фракция Ф6.1, вероятно, содержит хлорогеновую кислоту, время удерживания которой совпадает со стандартом. Фракция Ф6.2 характеризуется семью пиками при хроматографическом разделении с детектированием при двух длинах волн: 254 и 280 нм. Время удерживания двух пиков совпадает с таковым фенольных кислот: хлорогеновой (19 мин) и кофейной (28 мин). Фракция Ф7.1 при 254 нм характеризуется пятью основными пиками, из которых можно выделить два пика; время удерживания первого пика близко к таковому хлорогеновой кислоты (17 мин), а время удерживания второго близко к таковому кофейной кислоты (27 мин). При длине волны 280 нм повышается интенсивность пиков на 12-й и 21-й минутах удерживания, что подтверждает наличие фенолкислот и гидроксикоричных кислот во фракции Ф7.1.

В результате комбинации трех аналитических методов исследования можно сделать вывод, что в экстракте T. clathrus присутствуют полифенольные соединения следующих групп: фенолоксикислоты (галловая кислота), гидроксикоричные кислоты (кофейная кислота и ее производное хлорогеновая кислота) и флавонолы (кемпферол, кверцетин). Высокая антиоксидантная активность фракций Ф6.2 и Ф7.1, вероятно, обусловлена присутствием флавонолов (кверцетина и кемпферола). ВЭЖХ полифенолов отдельных фракций экстракта T. clathrus позволила получить ценную информацию для дальнейшего исследования состава и структуры полифенолов, присутствующих в данной водоросли. Метод экстракции и разделения фракций полифенолов из бурых водорослей в дальнейшем может быть успешно применен для масс-спектрометрического метода идентификации полифенольных компонентов. Кроме этого, полученные результаты могут быть использованы при выборе схемы получения биологически активных концентратов полифенолов для практического применения.