Биология моря, 2022, T. 48, № 1, стр. 53-61

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объектами исследования послужили 330 образцов талломов бурых (10 видов), красных (6 видов и Porphyra spp.) и зеленых (Cladophora rupestris, Ulva spp.) водорослей, отобранных в четырех географических точках побережья и островов прол. Великая Салма Кандалакшского залива Белого моря с координатами 66°30′ N, 33°08′ E; 66°31′ N, 33°11′ E; 66°32′ N, 33°11′ E и 66°30′ N, 33°22′ E в период c 12 по 20 августа в 2019 и 2020 гг. (табл. 1). Сборы спорофитов, различающихся по размерам, степени отмирания, обрастания и развития спороносных пятен, проводили без учета их возраста и дифференциации по структурным элементам. Целые талломы, взятые с субстрата в естественной среде обитания, сушили в токе воздуха при температуре 40–60°С и транспортировали, сохраняя в суховоздушном состоянии; затем измельчали в лабораторной мельнице. Для экстракции применяли смесь ацетонитрила и воды в соотношении 84 : 16 по объему при расходе 10 мл на 1 г навески. Экстракты после 10-кратного разбавления буферным раствором использовали для непрямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). Микотоксины – Т-2 токсин (Т-2), диацетоксисцирпенол (ДАС), дезоксиниваленол (ДОН), зеараленон (ЗЕН), фумонизины (ФУМ), альтернариол (АОЛ), охратоксин А (ОА), цитринин (ЦИТ), афлатоксин В₁ (АВ₁), стеригматоцистин (СТЕ), циклопиазоновую кислоту (ЦПК), микофеноловую кислоту (МФК), PR-токсин (PR), эмодин (ЭМО), роридин А (РОА) и эргоалкалоиды (ЭА) анализировали с помощью коммерческих и исследовательских аттестованных иммуноферментных тест-систем (ГОСТ 31653–2012). Нижние пределы количественных измерений соответствовали 85% уровню связывания антител и составляли 1 (АВ₁, ЭА), 2 (Т-2, ОА, СТЕ), 5 (РОА), 10 (АОЛ, МФК, ЗЕН, ЭМО, ЦИТ, ЦПК), 40 (ДОН, ФУМ) и 100 (ДАС, PR) нг/г. Данные по выборкам, включающим от 5 до 33 образцов, обсчитаны в программе Microsoft Office Excel 2018 и представлены в виде минимального, максимального и среднего арифметического значений.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Талломы водорослей рода Fucus содержали полный набор анализированных микотоксинов (табл. 2). Уровни ДОН, ДАС, ФУМ, АОЛ, ЦПК, МФК, ЭА и PR достигали десятков тысяч нг/г, минимальные значения находились вблизи пределов определения методов; на немногих образцах F. vesiculosus и F. distichus провести измерения не удалось. Лишь содержание Т-2 и ОА составляло около 1000 нг/г и ниже. По усредненным показателям F. serratus характеризовался наибольшим содержанием большинства микотоксинов; F. distichus уступал по накоплению Т-2, ДОН, а также ЦПК, ЭМО, РОА и ЭА. Диапазоны варьирования концентрации составляли 1–2 порядка у F. serratus и F. distichus, а также 2–4 порядка у F. vesiculosus. У Ascophyllum nodosum анализируемые вещества обнаружены во всех образцах, при этом со сверхвысоким содержанием только ДАС и PR (более 10  000 нг/г), с наименьшим Т-2, ОА, АВ₁ (ниже 1000 нг/г) и диапазоном варьирования содержания 1–2 порядка. У Pelvetia canaliculata концентрация токсинов была определена не во всех образцах, поскольку содержание анализируемых веществ в некоторых образцах было ниже предела определения. Тем не менее, концентрация ДАС и PR составляла 10 000 нг/г и более; измеренные значения, как правило, колебались в пределах двух порядков, а для ЭА и ФУМ – трех (табл. 2).

В ламинариевых водорослях очень редко и в небольшом количестве регистрировали только ЭА: в двух образцах из 17 образцов Laminaria digitata на уровне 1 нг/г и в 12 образцах из 25 Saccharina latissima в концентрации от 1 до 5 нг/г; остальные микотоксины не были обнаружены (табл. 3). У Dictyosiphon foeniculaceus из семейства Chordariaceae выявлены все анализируемые метаболиты, однако их содержание в целом было ниже, чем в других бурых водорослях, за исключением ДАС и PR (табл. 3). У другого представителя этого семейства Chordaria flagelliformis микотоксины Т-2, ЗЕН, АВ₁, ЭМО, PR и POA отсутствовали; АОЛ и ЭА определены во всех образцах в количестве 52 и 12 нг/г соответственно, а остальные вещества выявлены лишь у части образцов в концентрациях, близких к пределам определения. Образцы данной водоросли были представлены равным числом “чистых” и “обросших” талломов, на которых визуально были отмечены многочисленные эпибионты – водоросли и другие организмы. Редкие случаи выявления ДОН (75 нг/г), ЦИТ (49 нг/г), СТЕ (12 нг/г) и МФК (19 нг/г) приходились исключительно на “чистые” образцы, а образец с обрастаниями содержал ФУМ (280 нг/г). У Chorda filum семейства Chordaceae в единичных образцах найдены лишь СТЕ и ЭА в низких концентрациях (табл. 3).

Среди красных водорослей у Odonthalia dentata с частотой 64–100% определены СТЕ, ЦПК, МФК и ЭМО, реже выявляли ФУМ (36%) и еще реже − АОЛ (9%) (табл. 4). В Palmaria palmata, Devaleraea ramentacea и Phycodrys rubens редко содержались АОЛ, ЦПК и ЭА, в Ahnfeltia plicata – МФК и ЭМО, а в Porphyra spp. обнаружены ЭА в единичных образцах на фоновом уровне. В Coccotylus truncatus микотоксины не найдены.

В части образцов зеленых водорослей Ulva spp. детектированы малые концентрации АОЛ, ЦПК и ЭА, а в Cladophora rupestris – ЗЕН и ЭА (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Недавно установлено, что лишайники и высшие сосудистые растения разных систематических групп из одного экотопа (и даже растущие в непосредственной близости) сохраняют специфические черты профиля токсичных метаболитов, свойственных свободно живущим микроскопическим грибам (Буркин, Кононенко, 2013; Кононенко, Буркин, 2018, 2019). Как показали полученные данные, аналогичное свойство характерно и для морских макрофитов.

Среди бурых водорослей у представителей рода Fucus при общем сходстве по компонентному составу наблюдались различия по частоте обнаружения отдельных микотоксинов. Для относящихся к этому же семейству видов Ascophyllum nodosum и Pelvetia canaliculata были характерны меньшие концентрации анализированных веществ, особенно низкие у P. canaliculata. Ранее было показано, что состав микобиоты фукусовых водорослей также зависит главным образом от таксономической принадлежности макрофитов (Бубнова, Киреев, 2009; Коновалова, Бубнова, 2011). Оба вида семейства Laminariaceae − Laminaria digitata и Saccharina latissima не содержали микотоксинов, лишь спорадически у них выявляли фоновые концентрации ЭА. Среди представителей семейства Chordariaceae полный набор микотоксинов отмечен у Dictyosiphon foeniculaceus, хотя и в меньших количествах, чем у фукусов, а у Chordata flagelliformis регулярно выявляли лишь АОЛ и ЭА. У Chorda filum, единственного доступного для исследования вида из семейства Chordaceae, микотоксины практически отсутствовали.

Красные водоросли также явно различались по числу выявленных компонентов (от 6 до 1) в ряду Odonthalia dentata > Palmaria palmata = Devaleraea ramentacea > Phycodrys rubens = Ahnfeltia plicata > > Porphyra spp.; у Coccotylus truncatus микотоксины не обнаружены. Среди Chlorophyta Ulva spp. содержали АОЛ, ЦПК и ЭА, а у Cladophora rupestris обнаружены лишь ЗЕН и следы ЭА.

Таким образом, всем трем группам водорослей свойственны таксономические различия по встречаемости и содержанию микотоксинов. Как и в обитающих на суше лишайниках и травянистых растениях (Буркин, Кононенко, 2013; Кононенко, Буркин, 2018, 2019), в данных водных организмах формируются своеобразные комплексы микотоксинов – от крайне насыщенных до слабых и малочисленных. По-видимому, каждый организм по-своему реализует свои ресурсы в установлении отношений с токсинообразующими микромицетами − либо через доступность для заселения, либо через создание особых условий для их существования.

Представители семейств Laminariaceae (L. digitata, S. latissima) и Chordaceae (C. filum) не содержали микотоксины, лишь иногда в макроводорослях выявляли фоновые концентрации ЭА или СТЕ. Возможно, рост токсигенных микромицетов в этих водорослях заторможен, блокирована их метаболическая активность или трансформированы биосинтетические пути, приводящие к метаболитам с измененной структурой. Проверка данных гипотез может стать интересным направлением научного поиска. Практически полное отсутствие микотоксинов подтверждено на трех сборах L. digitata и S. latissima в мае 2019 г. (Буркин и др., 2021), а также в августе 2019 и 2020 гг. В то же время подобное явление пока не обнаружено у высших растений и лишайников, что позволяет в будущем ориентировать исследования на большее разнообразие видов и другие ареалы обитания представителей семейств Laminariaceae и Chordaceae.

Микологи, изучающие макрофиты, отмечают, что слизь на поверхности водорослей может быть благоприятным субстратом для развития грибов, способствуя формированию специфических многокомпонентных микробных сообществ и изменению их видового состава (Бубнова, Киреев, 2009). В связи с этим интересен результат исследования образцов C. flagelliformis, когда более выраженная контаминация микотоксинами была отмечена в так называемых чистых талломах, а не в обросших.

Сведения, полученные нами для бурых водорослей F. vesiculosus, A. nodosum и P. canaliculata, и данные 2019 г. (Буркин и др., 2021) в целом совпадают. Однако объединение результатов за два года по нескольким точкам сбора привело к завышению показателей содержания микотоксинов, расширению диапазонов их концентраций и внесло ожидаемые коррективы в общую картину: меньшее, чем 100%, обнаружение метаболитов у F. vesiculosus и P. canaliculata. Варьирование количества микотоксинов у F. vesiculosus может быть обусловлено особенностями реакции вида на внешнее воздействие. Альтернативный путь адаптации на уровне мембранных липидов отмечен, в частности, при изучении устойчивости этого вида к химическому загрязнению и другим альтерирующим факторам – опреснению, отрицательной температуре и ультрафиолету (Немова, Шкляревич, 2009). В отличие от A. nodosum, произрастающего в относительно однородной среде, P. canaliculata обитает на камнях у приливной границы, с этим, предположительно, может быть связана изменчивость данного вида. Для более корректной оценки таких эффектов, вероятно, необходимы дальнейшие исследования с привлечением еще большей выборки анализируемых объектов.

Широкие диапазоны колебаний содержания микотоксинов, выявленные при обобщении данных по точкам сбора, могут быть свидетельством участия продуцентов этих метаболитов в реакциях водорослей на совокупность внешних факторов. Исследования, проведенные в Кандалакшском заливе в августе 2005–2007 гг., показали, что условия обитания фукусовых водорослей (гидродинамический режим, тип берега) оказывают влияние на состав микобиоты (Бубнова, Киреев, 2009; Коновалова, Бубнова, 2011). Более того, для микромицетов известен феномен смещения биосинтеза токсичных метаболитов при изменении температуры, кислотности и солености ростовых сред (Merhej et al., 2011; Geisen et al., 2018). Ранее при изучении трех видов фукусовых водорослей из одной точки коэффициент вариации значений для однотипных образцов, как правило, не превышал 20% (Буркин и др., 2021). Напротив, у P. canaliculata резкое колебание количества микотоксинов было отмечено и при точечном сборе (Буркин и др., 2021), что подтверждает связь данного вида с ее супралиторальным обитанием. С полной определенностью судить о причинах различий содержания метаболитов “грибного” происхождения у водорослей семейств Fucaceae, Chordaceae, Chordariaceae и Laminariaceae, как и о факторах, вызывающих у P. canaliculata и F. vesiculosus значительное варьирование их количеств в зависимости от точки сбора, пока не представляется возможным. Вероятно, полученные результаты отражают совместное влияние комплекса биогенных и антропогенных факторов.

Роль вторичных метаболитов грибов многообразна, во многих случаях не очевидна и только в последнее время становится предметом подробных исследований. Установлено, что в растениях они активно участвуют во внутренних метаболических процессах и причастны к механизмам формирования их отношений с сообществами других организмов, выполняя функции сигналов для конкуренции и поддержания ассоциативных связей (Brakhage, 2013; Knox, Keller, 2015; Macheleidt et al., 2016). Однако для выяснения вклада вторичных метаболитов грибов в реакции организма-хозяина на многообразие воздействий глобального и локального значения, несомненно, требуются дальнейшие исследования. Морские местообитания в этом отношении мало изучены (Suryanarayanan, Johnson, 2014; Zhang et al., 2016), и каждый новый научный факт расширяет возможности для понимания механизмов регуляции биоценотических взаимодействий.

Из всего многообразия обследованных бурых, красных и зеленых водорослей виды Fucus имели наибольшую нагрузку микотоксинами. Данная информация, впервые полученная на столь обширном материале, безусловно, важна для дальнейшего изучения этой проблемы. С научной и практической точек зрения чрезвычайно важно располагать подобными сведениями и о других водорослях акватории Белого моря, а также о высших растениях, повсеместно встречающихся в приморской полосе. Недавно подробно изучены ассоциированные сообщества микроорганизмов Zostera marina (см.: Ettinger, Eisen, 2020), которая служит основным нерестовым субстратом для беломорской сельди. Следует признать, что исследования роли микотоксинов, санитарно-значимых для водных экосистем, пока крайне малочисленны и посвящены в основном экотоксикологическим рискам от “эстрогенного фактора” зеараленона, появление которого в водоемах европейских стран и США связывают с близостью сельскохозяйственных угодий (Gromadzka et al., 2009; Maragos, 2012; Laranjeiro et al., 2018), и негативному действию фузариотоксинов на непромысловых рыб (Кононенко и др., 2021).

Сочетанная множественная контаминация микотоксинами, которая установлена для ряда объектов растительного происхождения, пока не получила определенной интерпретации специалистов, занимающихся вопросами безопасности пищевой и кормовой продукции, однако рассматривается в числе первоочередных проблем, требующих разносторонней профессиональной оценки. Морские макроводоросли издавна служат объектом промысла и аквакультуры, используются в пищу, а также в качестве лекарственного и технического сырья. В связи с этим оценивается их потенциал как источников перспективных фармакологических субстанций и сорбентов (Bogolitsyn et al., 2017). В нашей стране водоросли прибрежных зон и отходы водорослей от экстракционной переработки служат сырьем при производстве кормовой водорослевой муки и крупки (ГОСТ 22455–77), а штормовые выбросы традиционно используются местным населением как удобрение, поэтому микотоксикологическая оценка этого биоресурса c побережий других морей по-прежнему актуальна.