Биология внутренних вод, 2023, № 5, стр. 671-679

ВВЕДЕНИЕ

Фауна отдельных водных экосистем, например озер, состоит как из активно распространяющихся животных (амфибионтные летающие насекомые, амфибии), так и пассивно распространяемых беспозвоночных, переносимых ветром или подвижными животными (Fontaneto, 2019; Hessen et al., 2019). При этом птицами и летающими насекомыми переносятся чаще всего покоящиеся стадии этих животных (Green et al., 2005; Frisch et al., 2007; Naceur, 2020). Изучение структуры популяций и филогеографические образцы пассивно расселяемых водных беспозвоночных показало, что, несмотря на их высокую способность к колонизации новых местообитаний в покоящихся стадиях, эти организмы часто демонстрируют неожиданно высокую степень генетической дифференциации и локального эндемизма вследствие низкого потока генов между такими популяциями (Hebert, 1998; De Meester, 2002; Hebert et al., 2003b; Penton et al., 2004; De Gelas, De Meester, 2005; Paland et al., 2005; Ishida, Taylor, 2007). В настоящее время для таких популяций в основном рассматривается два крайних варианта филогеографической структуры. Во-первых, относительно старые популяции в плейстоценовых убежищах или вокруг них демонстрируют глубокую дивергенцию/диверсификацию генетической структуры и сильные межпопуляционные различия с высокой степенью локального эндемизма (Gómez et al., 2000, 2007; Zierold et al., 2007). Во втором случае обнаруживается незначительно дифференцированная географическая структура и пониженное генетическое разнообразие, что свидетельствует о недавнем и быстром расширении ареала в новую доступную область, либо после естественной колонизации, часто послеледниковой, или после интродукции человеком (Weider et al., 1999; Mergeay et al., 2005; Ishida, Taylor, 2007). Сочетание обоих вариантов может быть обнаружено у одного и того же вида в зависимости от возраста его локальных популяций по всему ареалу (Ishida, Taylor, 2007). Для понимания закономерностей формирования филогеографических образцов вида необходимы данные о молекулярно-генетической структуре его локальных популяций на различных пространственных масштабах (Gómez et al., 2002; Adamowicz et a., 2005, 2007).

Удобными модельными объектами для филогеграфических исследований являются виды рода Artemia (Crustacea, Branchiopoda, Anostraca), широко распространенные в мире, играющие важную роль в функционировании экосистем гиперсоленых водоемов и имеющие большую коммерческую ценность (Sanchez et al., 2016; Marden et al., 2020; Van Stappen et al., 2020). В водоемах Крыма при соленостях >100 г/л артемии часто доминируют и достигают весьма высокой численности в гиперсоленых озерах и лагуне Сиваш – >75 тыс. экз./м³ (Балушкина и др., 2009; Anufriieva et al., 2022). Они играют ключевую роль в пищевых сетях этих водоемов, питаясь фитопланктоном, и служат пищей для различных беспозвоночных и водных птиц (Sanchez et al., 2016; Marden et al., 2020). Как организмы-фильтраторы виды рода Artemia участвуют в образовании лечебных грязей (Балушкина и др., 2009) и очищении воды от ртути (Shadrin et al., 2022).

В настоящее время в мире наряду с партеногенетическими популяциями признано существование пяти валидных видов двуполых артемий: A. salina (L., 1758), A. urmiana Günther, 1890, A. monica Verrill, 1869 (=A. franciscana Kellogg, 1906) и A. sinica Cai, 1989, A. persimilis Piccinelliand Prosdocimi, 1968 (Sainz-Escudero et al., 2021). В Крыму, крупнейшем п-ве Черного моря, в многочисленных гиперсоленых водоемах отмечено существование четырех двуполых видов (A. salina, A. urmiana, A. monica и A. sinica) и множество разноплоидных партеногенетических популяций Artemia (Shadrin, Anufriieva, 2017; Lantushenko et al., 2022). Artemia salina – аборигенный вид Средиземноморско-Черноморского региона, характеризующийся высоким локальным генетическим разнообразием (Munoz et al., 2008). Вселение A. monica (=A. franciscana) в гиперсоленые водоемы этого региона ведет к исчезновению локальных популяций A. salina и, следовательно, к снижению генетического разнообразия вида (Munoz et al., 2008). Разнообразие гаплотипов в крымских популяциях A. salina ранее не изучали.

Цель работы – дать анализ гаплотипического разнообразия и оценить уровень его уникальности в популяции A. salina из оз. Сасык-Сиваш, крупнейшего гиперсоленого озера Крыма.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В Крыму зарегистрировано >50 гиперсоленых озер, оз. Сасык-Сиваш (45°09′10″ с.ш., 33°31′04″ в.д.) – крупнейшее среди них (Shadrin et al., 2022). Площадь озера 75.3 км². Озеро мелководное (глубина ≤1.5 м), полимиксное, характеризуется высокой сезонной и многолетней изменчивостью различных характеристик. В настоящее время озеро разделено на две части – с низкой и высокой соленостью. В период наблюдений (2016–2022 гг.) соленость в гиперсоленой части озера колебалась от 220 до 350 г/л (Shadrin et al., 2022), средняя соленость была ~280 г/л.

В июле 2021 г. в оз. Сасык-Сиваш собраны взрослые особи A. salina, плотность популяции рачков достигала 220 экз./м³ при солености 245 г/л и температуре ~35°С. Пробы отбирали путем фильтрации воды через малую планктонную сеть Джеди с размером ячеи газа 50 мкм. Живых рачков доставляли в лабораторию для дальнейшего анализа. Одновременно с взятием проб в озере измеряли соленость и температуру воды с помощью портативного рефрактометра WZ212 (Kelilong Electron Co. Ltd., Фуань, Китай) и электронного рН-метра PHH-830 (OMEGA Engineering Inc., Норуолк, США) соответственно.

Тотальную ДНК выделяли с помощью набора ДНК-Экстран 2 (Синтол, Россия) согласно инструкциям производителя. Качество выделенных продуктов оценивали на нанофотометре Implen N60 (Germany) и с помощью электрофореза на 1.5%-ном агарозном геле. Фрагмент маркерного митохондриального гена COI амплифицировали с помощью ПЦР набора Screen-Mix (Eurogen, Россия) в объеме 25 мкл с использованием двух праймеров 2COI_Fol-F (5′-ATTCTACGAATCACAAGGATATTGG-3′) и 2COI_Fol-R (5′-TACACTTCAGGATGGCCAAAA) (Munoz, 2008). Протокол амплификации включал следующие стадии: предварительная денатурация 5 мин – 95°C, 34 цикла амплификации 30 с – 95°С, 30 с – 48°С, 45 с – 72°С и финальная элонгация 5 мин – 72°С. Очистку от остаточных продуктов ПЦР-смеси осуществляли методом сорбционной экстракции ДНК набором Colgen (Синтол, Россия). Для проверки однородности размерного состава амплифицированных фрагментов проводили визуализацию с помощью электрофореза на 1.5%-ном агарозном геле, концентрацию полученного продукта контролировали спектрофотометрически на нанофотометре Implen N60. При секвенировании использовали набор реагентов Big Dye Terminator v.3.1 cycle sequencing kit (Thermo Fisher Scientific, США), визуализацию продуктов секвенирования осуществляли при помощи капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе Нанофор 05 (Синтол, Россия) в Центре коллективного пользования “Молекулярная структура вещества” Севастопольского гос. университета. Всего получено и проанализировано восемь нуклеотидных последовательностей фрагмента гена COI мтДНК длиной 559 пн.

Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей проводили вручную в программе Bioedit v.7.2.5 (Hall et al., 2011). В дополнение к полученным оригинальным данным в анализ включали все последовательности гена COI A. salina, доступные в международной базе данных GenBank (NCBI), общее число последовательностей длиной 559 пн ‒ 115 (табл. 1). Выравнивание проводили в программе Mega-X (Kumar, 2018) с помощью алгоритма MUSCLE, гаплотипический анализ – в DnaSP6 (Rozas, 2017). Гаплотипическую сеть реконструировали методом TCS (Templeton, Crandall and Sing, 1992) в программе PopART v.1.7 (Leigh, Bryant, 2015). Карту географического распространения гаплотипов составляли на основе координат, соответствующих исследованным популяциям. Филогенетический анализ для A. salina проводили с помощью байесовских методов в MrBaeys v.3.2 (Ronquist, 2012). Он включал 10 млн итераций, 25% первых исключали из дальнейшего анализа. Топологию результирующего дерева выбирали по лучшей достоверности клад, длину ветвей вычисляли по средним значениям параметров промежуточных деревьев.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В исследованной популяции A salina обнаружено четыре гаплотипа Н1-Н4 (табл. 1, рис. 1). Один из выделенных гаплотипов был найден у пяти особей, три остальных – единожды. Важно отметить, что все четыре гаплотипа отмечены только в популяции из оз. Сасык-Сиваш, следовательно, их можно считать уникальными, и, возможно, эндемичными для п-ова Крым.

Рис. 1.

Карта ареала обитания A. salina и филогенетическое дерево вида. Дерево построено с помощью байесовских методов в MrBaeys v.3.2: цветом выделена клада, сформированная уникальными гаплотипами из различных популяций; на цветовой шкале отображена поддержка узлов. ⚫ – анализируемые популяции (всего 38).

Всего для вида A. salina выявлено 76 гаплотипов (табл. 1), 16 из них – общие для разных популяций, 60 – уникальные, встречающиеся только в одной популяции. Популяционно-генетические параметры свидетельствуют о достаточно высоком разнообразии гаплотипов у A. salina (табл. 2). Для обитающих в Европе особей инвазивного вида A. franciscana характерны более низкие значения гаплотипического разнообразия H_d (0.54) (Eimanifar, 2014), чем для A. salina (0.98) (табл. 2). Для коренных обитателей Евразии также отмечены более высокие значения H_d: A. sinica – 0.86, A. urmiana – 0.90, A. tibetiana – 0.98 (Eimanifar, 2014). Можно предположить, что найденные уникальные гаплотипы A. salina будут обнаружены и в других популяциях вида из гиперсоленых водоемов п-ова Крым. Не вызывает сомнений, что при дальнейших более масштабных исследованиях разнообразие гаплотипов существенно увеличится.

На рис. 1 дана карта ареала обитания A. salina c указанием мест расположения 37 различных локальных популяций, данные по которым приведены в табл. 1. Исследованные в нашей работе особи из двуполых популяций оз. Сасык-Сиваш образовали общую кладу с A. salina из Туниса, Ливии и Кипра (рис. 1: выделенная область на филогенетическом дереве). Анализ данных позволил выделить в структуре гаплотипической сети группу, в которую входят уникальные гаплотипы A. salina из Ливии, Туниса, Египта, Кипра и Крыма, не обнаруженные в западной части средиземноморского региона (рис. 2: пунктирная область). Возможно, места обитания этих уникальных популяций можно отнести к плейстоценовым рефугиумам.

Рис. 2.

Генеалогические связи между COI гаплотипами из популяций A. salina (TCS сеть). Пунктирной линией выделены уникальные гаплотипы из Ливии, Туниса, Египта, Кипра и Крыма. Черные точки – число мутаций; в скобках ‒ число нуклеотидных замен. Жирным курсивом указана популяция озера Сасык-Сиваш (SS).

Выделенная группа популяций характеризуется уникальным генетическим разнообразием. Следует отметить, что западно-средиземноморские популяции с множеством общих гаплотипов находятся в одном миграционном коридоре птиц. Можно считать, что между популяциями существует регулярный обмен генами за счет транспортировки цист мигрирующими птицами (Green et al., 2005). Ранее было убедительно показано, что структура миграционных путей птиц – важный фактор, определяющий филогеграфию Artemia (Munoz et al., 2013). Подобное предположение было сделано и для другого вида ракообразных (копеподы Arctodiaptomus salinus (Daday, 1885)), также имеющего покоящиеся яйца и широко распространенного в Средиземноморско-Черноморском регионе (Anufriieva, Shadrin, 2015).

Появление инвазионных видов Artemia, в первую очередь A. monica (=A. franciscana), может повлечь за собой сокращение крымского ареала A. salina и, следовательно, быстрое и значительное снижение генетического разнообразия. Важно отметить, что высокой адаптируемости A. mo-nica (возможно, и других видов Artemia) в новых условиях обитания способствует наличие различных альтернативных паттернов экспрессии генов (De Vos et al., 2021; Lee et al., 2022). Таким образом, наличие альтернативных вариантов реализации генотипа обеспечивает возможность перехода в новых условиях от одних гомеостатических стратегий к другим, что может повышать инвазивность и адаптацию вида к новым местам обитаниям. Однако, исходя из большого разнообразия и временнóй изменчивости гиперсоленых водоемов в Крыму, высокой адаптивной способности видов Artemia и наличие у них цист, можно с высокой степенью вероятности предположить, что все четыре двуполых вида Artemia будут устойчиво сосуществовать с партеногенетическими популяциями в Крыму, сменяя друг друга. Будет ли при этом снижаться генетическое разнообразие аборигенных популяций A. salina, смогут показать лишь дальнейшие многолетние исследования.

Выводы. Изучение филогенетических связей и филогеографической структуры популяций A. salina, проведенное по митохондриальному маркерному гену COI, позволило выделить две разнородные группы популяций. Для западно-средиземноморских популяций характерно наличие множества общих гаплотипов, что может быть обусловлено их расположением в одном миграционном коридоре птиц. Географически изолированные группы популяций из Ливии, Туниса, Египта, Кипра и Крыма характеризуются уникальными гаплотипами, не встречающимися в западной части средиземноморского региона. В крымской популяции артемии зарегистрированы уникальные, предположительно эндемичные для Крыма, гаплотипы. Появление инвазионных видов Artemia, в первую очередь A. monica (=A. franciscana), может повлечь за собой быстрое сокращение крымского ареала A. salina и вызванное этим значительное снижение генетического разнообразия вида.