Ботанический журнал, 2019, T. 104, № 10, стр. 1610-1621

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Материалом для исследования послужили зрелые пыльцевые зерна, полученные с гербарных образцов, хранящихся в Гербарии Ботанического института им. В Л. Комарова (LE). Микроспоры и пыльцевые зерна P. veris также были взяты с живых растений из коллекции открытого грунта ботанического сада Петра Великого Ботанического института им. В Л. Комарова РАН.

В работе использовали методы световой (СМ), сканирующей (СЭМ) и трансмиссионной (ТЭМ) электронной микроскопии.

Для светооптического исследования применяли классический ацетолизный метод (Erdtman, 1952). Световые микрофотографии получены на микроскопе Carl Zeiss Jenaval, с помощью цифровой фотокамеры Canon EOS 20D.

Детали строения поверхности пыльцевых зерен уточняли на сканирующем электронном микроскопе JEOL JSM-6390 в центре коллективного пользования Ботанического института им. В.Л. Комарова. Для исследования необработанную пыльцу извлекали из пыльников и закрепляли на специальном столике с помощью двусторонней липкой ленты, затем напыляли сплавом золота и палладия в вакуумной установке.

Описания проводили по общепринятой схеме. Учитывали тип и число апертур, форму и очертания пыльцевых зерен, размеры полярной оси и экваториального диаметра, особенности строения борозд и межапертурных участков, толщину экзины и характер скульптуры (Kupriyanova, Aleshina, 1967, 1972). Измерения проводили с помощью окулярмикрометра. В каждом образце измеряли не менее 15 пыльцевых зерен.

Ультраструктуру оболочки изучали на ультратонких срезах с помощью трансмиссионного микроскопа Hitachi-600 и Libra 120 в центре коллективного пользования Ботанического института им. В.Л. Комарова и Jeol JEM 1400 Ресурсного центра “Развитие молекулярных и клеточных технологий” Санкт-Петербургского государственного университета. Пыльники, содержащие пыльцевые зерна, фиксировали в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере pH 6.8–7.2 при +4°С в течение 16–10 часов, затем в 1%-ном растворе OsO₄ на том же буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Материал обезвоживали ацетоном с нарастающей концентрацией и заключали в эпоксидную смолу эпон EmBed 812 (EMS, США) с помощью автоматического процессора AMW (Leica, Австрия). Ультратонкие срезы изготавливали на ультратомах LKB и Leica EM UC7. Срезы на сеточках контрастировали уранилацетатом (20 мин) и цитратом свинца (10 мин).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный палиноморфологический анализ показал, что пыльцевые зерна всех изученных видов радиально симметричные, равнополярные, многобороздные.

По общепринятой классификации размеров пыльцевые зерна изученных видов Primula можно отнести к мелким (до 25 мкм) и средним (25–50 мкм) (Erdtman, 1952). Самые мелкие пыльцевые зерна характерны для длинностолбиковой формы P. nutans (полярная ось 11.6–12.5 мкм, экваториальный диаметр 12.7–13.5 мкм), самые крупные – у короткостолбиковой формы P. cordifolia (полярная ось 28.1–29.2 мкм, экваториальный диаметр 28.7–30.1 мкм). Вариабельность размеров в одном образце незначительна и не превышает 2 мкм (табл. 1).

Для гетеростильных видов сем. Primulaceae характерен диморфизм пыльцы, выраженный в размерах пыльцевых зерен. При этом короткостолбиковые растения продуцируют пыльцевые зерна заметно крупнее, по сравнению с длинностолбиковыми формами того же вида. Размеры пыльцы у разных форм гетеростильного вида примулы могут различаться в 1.5 раза (Morozowska, Idzikowska, 2004; Grigoryeva et al., 2018). Однако у изученных нами видов с многобороздной пыльцой эта разница в размерах пыльцы короткостолбиковых и длинностолбиковых форм не столь значительна. Так у P. nutans разница в размерах между самыми мелкими пыльцевыми зернами у длинностолбиковой формы и самыми крупными зернами у короткостолбиковой формы составляет всего 4.2 мкм, у P. pallasii – 4 мкм, у P. macrocalyx – 3.8 мкм.

Форма пыльцевых зерен эллипсоидальная (табл. I , 2) или почти сфероидальная (табл. I , 11). Очертания с полюса почти округлые, округлоугловатые или слабо многолопастные, с экватора почти округлые или эллиптические.

Таблица I . Морфология пыльцы видов рода Primula (СЭМ).

1–3 – P. heterochroma (длинностолбиковая форма); 4, 7 – P. macrocalyx (короткостолбиковая форма); 5, 6 – P. ruprechtii (длинностолбиковая форма); 8, 9 – P. amoena (длинностолбиковая форма); 10–2 – P. sibthorpii (длинностолбиковая форма). 1, 4, 8, 10 – общий вид пыльцевого зерна с полюса; 2, 5, 7, 11 – общий вид пыльцевого зерна с экватора; 3, 6, 9, 12 – скульптура поверхности.

Масштабные линейки, мкм: 1–12 – 1.

Plate I . Pollen morphology of Primula species (SEM).

1–3 – P. heterochroma (long-styled morph); 4, 7 –P. macrocalyx (short-styled morph); 5, 6 – P. ruprechtii (long-styled morph); 8, 9 – P. amoena (long-styled morph); 10–12 – P. sibthorpii (long-styled morph). 1, 4, 8, 10 – polar view of pollen grain; 2, 5, 7, 11 – equatorial view of pollen grain; 3, 6, 9, 12 – detail of ornamentation.

Scale bars, μm: 1–12 – 1.

Борозды неширокие, недлинные, часто слегка извилистые, с заостренными или слегка закругленными концами и мембраной с редкими некрупными гранулами. Число борозд у разных видов варьирует от 6 до 9. Пыльцевые зерна с максимальным числом борозд (9) обнаружены у короткостолбиковых форм P. macrocalyx. В литературе имеются сведения о том, что для многобороздных пыльцевых зерен некоторых примул кроме разницы в размерах существуют различия в размерах скульптурных элементов и числе борозд (Morozowska, Idzikowska, 2004; Mačukanović Jocić et al., 2010). Считается, что более мелкие пыльцевые зерна длинностолбиковых цветков имеют меньшее число борозд по сравнению с пыльцой короткостолбиковых форм одного и того же вида. Так у P. macrocalyx в препаратах, полученных из длинностолбиковых цветков, преобладают 6-бороздные пыльцевые зерна, тогда как у короткостолбиковых цветков преобладает 9-бороздная пыльца. Следует отметить, что число борозд у многобороздной пыльцы примул часто сильно варьирует в пределах одного цветка от 5 до 8, поэтому трудно установить закономерность между числом борозд и формой цветка (Grigoryeva et al., 2018). У гетеростильных P. pallasii и P. nutans диморфизм пыльцы по числу борозд не обнаружен. Для обеих изученных форм цветков P. pallasii характерна 6-бороздная пыльца, а для P. nutans 5-бороздная пыльца.

Скульптура у пыльцы всех изученных видов сетчатая. Можно выделить 2 варианта сетчатой скульптуры:

1. Скульптура мелкосетчатая (табл. II , 3, 6, 9, 12).

Таблица II . Морфология пыльцы видов рода Primula (СЭМ).

1, 2 – P. elatior (короткостолбиковая форма); 3, 4 – P. juliae (короткостолбиковая форма); 5, 6 – P. veris (короткостолбиковая форма); 1, 5 – общий вид пыльцевого зерна с экватора; 3 – общий вид пыльцевого зерна с полюса. 2, 4, 6 – скульптура поверхности.

Масштабные линейки, мкм: 1, 3, 5 – 10; 2, 4, 6 – 1.

Plate II . Pollen morphology of Primula species (SEM).

1, 2 – P. elatior (short-styled morph); 3, 4 – P. juliae (short-styled morph); 5, 6 – P. veris (short-styled morph). 1, 5 – equatorial view of pollen grain; 3 – polar view of pollen grain; 2, 4, 6 – detail of ornamentation.

Scale bars, μm: 1, 3, 5 – 10; 2, 4, 6 – 1.

При исследовании на светооптическом уровне не просматривается. Данные СЭМ показывают, что просветы ячей меньше или равны расстоянию между ними. Просветы менее 0.5 мкм по максимальной оси, округло-угловатые или узкие вытянутые. Этот вариант встречается у P. sibthorpii (табл. I , 3), P. heterochroma (табл. I , 12) и у P. ruprechtii (табл. I , 6).

2. Скульптура крупносетчатая (табл. II , 2, 4, 6).

Ячеи довольно крупные, скульптура хорошо различима при исследовании с помощью СМ. Просветы ячей заметно больше ширины стенок. Исследование с помощью СЭМ показало, что очертания просветов ячей округлые, округло-угловатые или извитые, довольно крупные от 0.5 до 1.6 мкм по максимальной оси, с преобладанием крупных просветов. Размер ячей на мезокольпиумах несколько больше чем на полюсах.

Стенки ячей слегка изогнутые, неширокие, 0.3–0.5 мкм шириной.

В эту группу можно отнести пыльцу P. cordifolia, P. elatior, P. juliae, P. nutans и P. veris.

Самая крупная сетка характерна для пыльцевых зерен P. cordifolia.

У пыльцевых зерен P. cordifolia, P. elatior и P. nutans стенки ячей гладкие. На поверхности стенок ячей пыльцы P. juliae, P. paxiana и P. veris есть дополнительная орнаментация в виде мелких довольно частых гранул (табл. II , 4, 6). У пыльцевых зерен P. paxiana и P. veris гранулы настолько мелкие, что их возможно рассмотреть только при больших увеличениях СЭМ (не менее 20 000), тогда как обычно для изучения скульптуры пользуются увеличением ×10 000.

Следует отметить, что граница между выделенными группами условная, поскольку некоторые виды имеют переходный характер скульптуры.

Некоторые исследователи отмечают, что у гетеростильного вида P. vulgaris Huds. пыльцевые зерна с разных типов цветков заметно различаются размерами ячей сетчатой скульптуры. Так, ячеи на поверхности пыльцы короткостолбиковых форм заметно крупнее таковых у длинностолбиковых форм (Mačukanović Jocić et al., 2010). Нам удалось исследовать пыльцу трех гетеростильных примул (P. macrocalyx, P. nutans и P. pallasii) с обеих форм цветков. У них не было обнаружено существенных различий в скульптуре, размеры просветов и толщина стенок ячей у пыльцевых зерен длинностолбиковых и короткостолбиковых форм также не различаются. Видимо, диморфизм скульптур пыльцы у разных форм гетеростильных видов этого рода видоспецифичен и не является общей чертой всех гетеростильных представителей с многобороздной пыльцой. Как известно, для большинства гетеростильных видов рода Linum (Linaceae) характерен диморфизм пыльцы, выраженный в разных скульптурах у пыльцевых зерен длинно- и короткостолбиковых цветков. Однако среди гетеростильных льнов есть виды, у которых диморфизм пыльцы отсутствует и пыльцевые зерна короткостолбиковых и длинностолбиковых цветков имеют одинаковую скульптуру (Grigoryeva, 1989).

Ультраструктура спородермы многобороздной пыльцы нами изучена с помощью трансмиссионного электронного микроскопа у P. elatior и P. veris (табл. III , 7, 8). Для них характерна очень тонкая оболочка, около 1 мкм толщиной. Спородерма имеет сходное строение. На ультратонких срезах отчетливо видны экзина и интина. В экзине по электронной плотности различаются эктэкзина (более светлая) и эндэкзина (более темная). Эктэкзина тектатно-колумеллятного типа. Колумеллы (столбики) часто неровные, около 0.2 мкм высотой и около 0.1 мкм в диаметре, с расширенными головками. Столбики располагаются плотно друг к другу, расстояние между ними не более 0.1 мкм. Головки колумелл сливаются, образуя довольно толстый наружный слой тектум (покров), около 0.2–0.3 мкм толщиной. Тектум прерывистый, характерный для пыльцы с сетчатой скульптурой поверхности. Подстилающий слой очень тонкий, не более 0.04 мкм толщиной, прерывистый. Он различим только в случаях, когда срез проходит строго перпендикулярно оболочке. На “косых” срезах подстилающий слой не виден, что, по-видимому, и позволило сделать ошибочный вывод об отсутствии подстилающего слоя в оболочках многобороздной пыльцы среди видов Primula (Nowicke, Skvarla, 1977). Прерывистый подстилающий слой был обнаружен у многобороздной пыльцы P. sibirica из секции Farinosae (Grigoryeva et al., 2018). Расположенная под подстилающим слоем эндэкзина отличается от эктэкзины большей электронной плотностью, и на срезах выглядит более темной по сравнению с эктэкзиной. Представлена редкими, часто плохо различимыми ламеллами, плотно прилегающими к эктэкзине, и гомогенным прерывистым слоем, с максимальной толщиной не более 0.2 мкм. Интина мелко фибриллярная, довольно толстая, 0.4 мкм толщиной, без утолщений в области апертур. Мембрана борозд образована за счет интины и очень тонкого плохо различимого слоя спорополленина эктэкзины.

Таблица III . Вариабельность пыльцевых зерен Primula paxiana. Ультраструктура спородермы P. veris.

1–6 – P. paxiana. 7, 8 – P. veris. 1 – типичное пыльцевое зерно; 2–6 – атипичные пыльцевые зерна; 7, 8 – ультратонкие срезы оболочки; 7 – межапертурный участок; 8 – предапертурный участок.

Масштабные линейки, мкм: 1–8 – 1.

Plate III . Variability of pollen grains in Primula paxiana. Sporoderm ornamentation in P. veris.

1–6 – P. paxiana. 7, 8 – P. veris. 1 – typical pollen grain; 2–6 – atypical pollen grains; 7, 8 – ultra-thin sections of sporoderm; 7 – interaperture part; 8 – pre-aperture part.

Scale bars, μm: 1–8 – 1.

Внутривидовая изменчивость. Размеры и форма пыльцевого зерна внутри видов изменяются незначительно. Также консервативными признаками являются тип апертур (борозды у изученных видов) и скульптура, тогда как признаки борозд не стабильны. Даже в одном цветке встречаются пыльцевые зерна, которые различаются числом, расположением, характером слияния борозд. У типичных зерен все борозды б. м. одинаковой длины и не сливаются концами. У атипичных зерен длина борозд может варьировать. Встречаются пыльцевые зерна, у которых сливаются концы соседних борозд (табл. III , 3, 5), могут сливаться только 2 борозды или несколько. У некоторых зерен процесс слияния концов борозд лишь намечается (табл. III , 2, 4). У типичных зерен борозды ровные или слегка извилистые, тогда как у нетипичных зерен борозды имеют разнообразные изгибы и различаются длиной. У большинства изученных видов атипичные зерна встречаются редко и составляют менее 1% от общего числа в образце. Однако у P. macrocalyx, P. megaseifolia и P. paxiana доля пыльцевых зерен с разнообразными отклонениями по числу и расположению апертур может достигать 30–40%. Показано, что наличие нетипичных фертильных пыльцевых зерен и их количество характеризует отдельный образец и не является видоспецифичным признаком (Pozhidaev, 1993, 1995).

Причины появления в одном образце (а часто и в одном цветке) пыльцевых зерен с другим числом и расположением апертур по сравнению с основным типом пока не ясны, хотя в настоящее время ведутся работы по выявлению генов, влияющих на число апертур у разных мутантов Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Dobritsa, Coerper, 2012; Prieu et al., 2016).

Для некоторых видов рода Viola (Violaceae) характерно наличие в одном цветке пыльцы с разным числом апертур. Было показано, что преобладание тех или других зерен у одного и того же вида зависит от места произрастания (в горах или на равнине). Пыльца фиалок с большим числом апертур прорастает быстрее, но при этом и быстрее теряет жизнеспособность. Пыльца с меньшим числом апертур прорастает медленнее, но дольше сохраняет способность к прорастанию (Dajoz et al, 1991, 1993; Mignot et al., 1994; Till-Bottraud et al., 1999). Вероятно, разное число апертур у пыльцевых зерен одного растения расширяет его репродуктивные возможности.

Таким образом, многобороздные пыльцевые зерна исследованных видов из секций Carolinella, Cortusoides, Primula, Juliae и Sikkimensis обладают сходными чертами, при этом виды из одной и той же секции могут различаться особенностями скульптуры, числом борозд, размерами пыльцевых зерен и толщиной экзины. Такие признаки, как форма пыльцевого зерна, размеры, число борозд и характер скульптуры могут быть важными дополнительными характеристиками отдельных видов Primula с многобороздной пыльцой, но не секций этого рода.