Ботанический журнал, 2021, T. 106, № 11, стр. 1085-1100

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Визуальные симптомы токсичности появились на 10–12 день. Они проявлялись в уменьшении прироста, усыхании, хлорозах и некрозах хвои, укорочении главного и боковых корней. Ранее нами были показаны особенности влияния Ni, Cu и Cd в концентрациях 1 и 5 мМ на ростовые и морфологические признаки растений Pinus sylvestris (⁵⁵Drozdova et al., 2014). В этих опытах было установлено, что под действием Cd рост стебля и хвои замедлялся на 20% по сравнению с контролем при концентрации металла 1 мМ и на 30% – при концентрации 5 мМ. Медь в низкой концентрации практически не влияла на рост стебля, а в высокой концентрации замедляла его рост на 30–35%. Токсическое влияние Cu в обеих концентрациях в большей степени затрагивало накопление биомассы хвои, которая была на 35–40% меньше, чем в контроле. Никель в низкой концентрации не влиял на прирост стебля и хвои, а в высокой концентрации замедлял прирост стебля на 5–10% и на 20% снижал биомассу хвои. Настоящее исследование в целом подтвердило полученные ранее данные. На 9-е сутки эксперимента наиболее выраженным – на 30% по сравнению с контролем было снижение сухой биомассы надземной части сеянцев Pinus sylvestris при действии Cd в концентрации 5 мМ. Никель в концентрации 1 мМ не вызывал сколько-нибудь значимого снижения биомассы сеянцев, с увеличением концентрации до 5 мМ наблюдалось ее снижение на 25%. Воздействие Cu в концентрациях 1 и 5 мМ приводило к снижению аккумуляции биомассы сеянцев от 20 до 23% от контроля.

Метаболомный профайлинг растений позволил идентифицировать соединения следующих классов: карбоновые кислоты алифатического ряда, в том числе кислоты цикла Кребса, аминокислоты, сахарокислоты, жирные кислоты; сахароспирты, моно- и дисахара, циклические кислоты (шикимовая кислота, хинная кислота, кумаровая кислота, феруловая кислота), флавоноиды (катехины, изорамнетин), терпены (в том числе абиетиновая кислота и фитол), стеролы. Некоторые соединения не были идентифицированы, но учитывались при построении статистических моделей. Результаты метаболомного профайлинга представлены в виде тепловой карты на рис. 1.

Рис. 1.

Тепловая карта метаболитов, обнаруженных в экстрактах растений Pinus sylvestris под действием металлов (Ni – неидентифицированные метаболиты, Rt – время удерживания; F – furanose, P – pyranose).

Fig. 1. Heat map of metabolites found in extracts of Pinus sylvestris plants under the influence of metals (Ni – unidentified metabolites, Rt – retention time; F – furanose, P – pyranose).

На рисунке видно, что добавление металлов в питательный раствор влияет на концентрационные изменения множества метаболитов. Кроме того, метаболомный профиль растения претерпевает динамические изменения в процессе роста растений. Сочетание этих изменений приводит к изменению структуры метаболитной сети в целом.

Состояние метаболитной сети растений было смоделировано с использованием метода главных компонент (МГК) в виде точек в фазовом пространстве, которое построено в координатах, выражающих число молекул каждого структурного типа, обнаруженных в данный момент времени в пробе. Согласно результатам МГК-анализа, различия в структуре метаболитной сети контрольных растений и растений, выращенных в присутствии металлов, выражающиеся в кластеризации метаболомов опытных образцов, заметны только на 6-е сутки после воздействия. На 3-и сутки различия не проявляются (рис. 1, 2). На 9-е сутки заметно четкое расхождение в пространстве главных компонент метаболомов растений, выращенных в присутствии того или иного металла, т.е. проявляется специфическое действие металлов. Таким образом, различия между метаболомом контрольных и опытных растений проявляются раньше, чем между растениями, выращенными в присутствии разных металлов. При этом скорость формирования ответной реакции на уровне метаболома не имеет прямой зависимости от концентрации вносимых Cu, Ni и Cd.

Рис. 2.

PCA анализ растений Pinus sylvestris после внесения тяжелых металлов Cu, Ni и Cd в концентрации 1 мМ: а – 3‑и сутки, полученная модель объясняет 42.8% общей дисперсии (PC1 – 26.5%; PC2 – 16.3%); б – 6-е сутки, полученная модель объясняет 42% общей дисперсии (PC1 – 23.1%; PC2 – 18.9%); в – 9-е сутки, полученная модель объясняет 45.3% общей дисперсии (PC1 – 31.3%; PC2 – 14%).

Fig. 2. PCA analysis of Pinus sylvestris plants after the addition of heavy metals Cu, Ni and Cd at a concentration of 1 mM: а – 3rd day, the resulting model explains 42.8% of the total variance (PC1 – 26.5%; PC2 – 16.3%); б – 6th day, the resulting model explains 42% of the total variance (PC1 – 23.1%; PC2 – 18.9%); в – 9th day, the resulting model explains 45.3% of the total variance (PC1 – 31.3%; PC2 – 14%).

Рис. 2.

Окончание.

Рис. 3.

PCA анализ растений Pinus sylvestris после внесения тяжелых металлов Cu, Ni и Cd в концентрации 5 мМ: а – 3‑и сутки, полученная модель объясняет 42.7% общей дисперсии (PC1 – 25.5%; PC2 – 17.2%); б – 6-е сутки, полученная модель объясняет 42.1% общей дисперсии (PC1 – 28.6%; PC2 – 16.5%); в – 9-е сутки, полученная модель объясняет 46.5% общей дисперсии (PC1 – 25.6%; PC2 – 20.9%).

Fig. 3. PCA analysis of Pinus sylvestris plants after the addition of heavy metals Cu, Ni and Cd at a concentration of 5 mM: а – 3rd day, the resulting model explains 42.7% of the total variance (PC1 – 25.5%; PC2 – 17.2%); б – 6th day, the resulting model explains 42.1% of the total variance (PC1 – 28.6%; PC2 – 16.5%); в – 9th day, the resulting model explains 46.5% of the total variance (PC1 – 25.6%; PC2 – 20.9%).

Рис. 3.

Окончание.

Как видно на рис. 1, концентрации многих соединений сильно варьируют даже в пределах одной экспериментальной группы. Такие различия являются проявлением индивидуальных особенностей метаболомного профиля отдельных растений. Эти различия, безусловно, вносят вклад в структуру метаболитной сети растений. Таким образом, визуализированные динамические изменения метаболитной матрицы растений обусловлены в основном не набором определенных соединений, а, скорее всего, являются проявлением изменения ее корреляционной структуры. Тем не менее статистический анализ позволяет выявить нагрузки переменных, т.е. коэффициенты значимости для отдельных метаболитов. Для главных компонент (ГК) 1 и 2 на 6‑е сутки роста при обеих концентрациях металлов коэффициенты значимости были наибольшими для шикимовой, хинной и глицериновой кислот. При концентрации металлов 5 мМ, а также при более длительном воздействии металлов большую значимость приобретали жирные кислоты и сукцинат (табл. 1). Под действием металлов в концентрации 5 мМ на 9-е сутки изменения метаболома были также связаны с некоторыми аминокислотами (пролин и серин) и многоатомными спиртами (мио-инозитол и ононитол), фитолом и катехином.

При количественном анализе конкретных соединений также заметно, что особенности влияния Cd и Cu на накопление метаболитов часто сходны, а действие Ni проявляется иначе. Влияние Cu и Cd связано практически с одинаковым набором метаболитов, а именно в первую очередь с хинной и шикимовой кислотами, янтарной кислотой и жирными кислотами. Влияние же Ni в большей степени затрагивает метаболизм аминокислот (пролина и серина), углеводов (глюкоза, галактоза) и в меньшей степени хинной и шикимовой кислот.

Как было отмечено выше, концентрации многих метаболитов часто сильно различаются между образцами даже в пределах одной экспериментальной группы. Однако для некоторых соединений различия средних значений концентраций между опытными группами достоверно на уровне значимости 95% (р = 0.05). К таким соединениям относятся хинная, шикимовая, янтарная кислоты и аминокислота пролина, концентрационные изменения которых под действием металлов обсуждаются ниже.

На рисунках 4 и 5 показаны изменения концентраций хинной и шикимовой кислот под действием металлов. На 3-и сутки появляется тенденция к увеличению концентраций в тканях растений этих кислот относительно контроля под действием 1 мМ Cd и Cu и тенденция к уменьшению содержания этих кислот при концентрации металлов 5 мМ. Значимые различия проявляются, начиная с 6-х суток после внесения металлов.

Рис. 4.

Изменение содержания шикимовой кислоты в растениях Pinus sylvestris под действием металлов: а – 1 мМ; б – 5 мМ.

Fig. 4. Change in the shikimic acid content in Pinus sylvestris plants under the influence of metals: а – 1 mM; б – 5 mM.

Key: концентрация, мкг/г сухой биомассы – concentration, μg/g dry biomass; контроль – control; 3-и сутки – 3th day; 6-е сутки – 6th day; 9-е сутки – 9th day.

Рис. 5.

Изменение содержания хинной кислоты в растениях Pinus sylvestris под действием металлов: а – 1 мМ; б – 5 мМ.

Fig. 5. Change in the quinic acid content in Pinus sylvestris plants under the influence of metals: а – 1 mM; б – 5 mM.

Key: концентрация, мкг/г сухой биомассы – concentration, μg/g dry biomass; контроль – control; 3-и сутки – 3th day; 6-е сутки – 6th day; 9-е сутки – 9th day.

Действие Ni на метаболом сосны в низкой концентрации (1 мM), в отличие от действия Cd и Cu, практически не связано с увеличением концентрации хинной и шикимовой кислот, а в высокой концентрации Ni стимулирует накопление этих кислот на 3-и сутки, но далее их содержание снижается.

Шикимовая и хинная кислота является промежуточными продуктами шикиматного пути, участвующего в биосинтезе фенольных соединений. По литературным данным, повышенное количество фенольных соединений в тканях растений наблюдали при воздействии различных стрессовых факторов. Это можно рассматривать как общую реакцию адаптации растений к стрессовым условиям и как стратегию запасания углеродных скелетов, в периоды, когда рост растений ограничен. Как именно стресс-индуцированный биосинтез фенольных соединений обуславливает адаптацию к стрессу является дискуссионным вопросом. Предполагается, что количество фенольных соединений возрастает в том случае, если фотосинтез ингибирован в меньшей степени, чем рост (Caretto et al., 2015).

Содержание янтарной кислоты колебалось в зависимости от времени воздействия, вида металла и его концентрации (рис. 6). Под действием Cd и Cu в обеих концентрациях содержание сукцината возрастало относительно контроля. Под действием Cu эти различия проявлялись на 6-е сутки, а под действием Cd – на 9-е сутки после внесения металла. Ni не оказывал достоверно значимого влияния на накопление в растениях сукцината.

Рис. 6.

Изменение содержания янтарной кислоты в растениях Pinus sylvestris под действием металлов: а – 1 мМ; б – 5 мМ.

Fig. 6. Change in the succinic acid content in Pinus sylvestris plantsunder the influence of metals: а – 1 mM; б – 5 mM.

Key: концентрация, мкг/г сухой биомассы – concentration, μg/g dry biomass; контроль – control; 3-и сутки – 3th day; 6-е сутки – 6th day; 9-е сутки – 9th day.

Повышенное накопление низкомолекулярных органических кислот под действием тяжелых металлов является широко распространенным явлением, характерным для растений (Xie et al., 2014; Osmolovskaya et al., 2018). Способность кислот, таких как цитрат, малат, оксалат, малонат, аконитат и тартарат образовывать прочные связи с ионами тяжелых металлов приводит к их детоксикации (Anjum et al., 2015). В листьях амаранта Amarantus cruentus и A. caudatus наблюдается индуцируемое кадмием повышение содержания малата, цитрата и оксалата. Содержание сукцината возрастет только у A. cruentus, и, напротив, снижается у A. caudatus (⁶⁶Osmolovskaya et al., 2019). Результаты нашего эксперимента свидетельствуют об изменении содержания только кислот в свободной форме и не позволяют сделать выводы о роли кислот в детоксикации металлов. Тем не менее, наблюдаемые изменения концентрации сукцината под действием меди и кадмия указывают на специфическое влияние этих металлов на углеродный метаболизм P. sylvestris.

Начиная с 6-х суток под действием металлов в растениях происходило накопление аминокислоты пролин. Cd и Cu способствовали увеличению содержания пролина в концентрации 5 мМ, а Ni – в концентрации 1 мМ (рис. 7). Повышение уровня пролина в ответ на воздействие тяжелых металлов описано для многих видов растений (Balestrasse et al., 2005; Sharma, Dietz, 2006; Sun et al., 2007; Abdel-Latif, 2008), в том числе для Pinus sylvestris (Kandziora-Ciupa et al., 2016). У растений пролин составляет <5% от общего пула свободных аминокислот при нормальных условиях и 80% от общего пула аминокислот при стрессе (Kumar et al., 2010). Пролин играет важную роль в защите клеток от повреждения, вызванного АФК (Kartashov et al., 2008; Ivanov et al., 2013). Было высказано предположение, что эта аминокислота действует как акцептор радикалов или участвует в хелатировании ионов металлов (Andrade et al. 2009).

Рис. 7.

Изменение содержания пролина в растениях Pinus sylvestris под действием металлов: а – 1 мМ; б – 5 мМ.

Fig. 7. Change in the proline content in Pinus sylvestris plants under the influence of metals: а – 1 mM; б – 5 mM. Key:концентрация, мкг/г сухой биомассы – concentration, μg/g dry biomass; контроль – control; 3-и сутки – 3th day; 6-е сутки – 6th day; 9-е сутки – 9th day.

При анализе закономерностей концентрационных изменений других соединений (рис. 1) на уровне тенденций наши данные позволили выявить уменьшение содержания свободных жирных кислот (пальмитиновой, линолевой, линоленовой, стеариновой) при действии всех металлов в обеих концентрациях. Влияние тяжелых металлов затрагивает метаболизм липидов и жирных кислот (Morsy et al., 2012). Детальный же анализ изменения метаболизма липидов и жирных кислот требует специальных методологических подходов.

Под действием металлов существенно менялось содержание полиолов. Арабитол присутствовал только в контрольных образцах и в некоторых растениях, выращенных при действии Cd в концентрации 5 мМ. Содержание ононитола и мио-инозитола возрастало под действием всех металлов, но только на 9-е сутки воздействия. Увеличение содержание мио-инозитола под действием металлов описано на примере некоторых растений (Osmolovskaya et al., 2019) и, по-видимому, связано с общим нарушением углеродного обмена у растений.

Для многих других соединений, в том числе неидентифицированных, не прослеживалось четких закономерностей концентрационных изменений под действием тяжелых металлов.

Изменения в метаболизме растений непосредственно связаны с поступлением и накоплением металлов в растениях (табл. 2). При концентрации металлов 5 мМ динамика их накопления была различна. Наиболее резкое увеличение концентрации Cd и Cu в вегетативной части растений наблюдается на 6-й день после внесения металлов: количество Cu возрастает более чем в 5 раз, а Cd в 20 раз по сравнению с 3-ми сутками. На 9-е сутки концентрация Cu и Cd возрастает лишь в 1.5–2.5 раза по сравнению с 6-ми сутками. Ni, напротив, накапливался более интенсивно на 9-е сутки, по сравнению с 6-ми. К 9-му дню эксперимента в наименьшей концентрации накапливается Cu, а в наибольшей Cd.

При внесении металлов в концентрации 1 мМ их поступление в ткани растения происходит более равномерно и в значительно меньших количествах. При данной концентрации наиболее интенсивно в вегетативную часть растения поступает Ni, а наименее интенсивно Cu.

Полученные результаты показывают, что ГХ-МС анализ с последующей обработкой метаболитной матрицы методами мультивариантной статистики позволяет выявить значительную часть метаболомных изменений, происходящих под действием тяжелых металлов. Визуализированные динамические изменения метаболома растений обусловлены в основном не изменениями метаболизма отдельных веществ, а являются проявлением изменения корреляционной структуры метаболитной сети. Формирование ответных реакций на уровне метаболома заметно на 6‑е сутки после воздействия металлов, как в высокой, так и в низкой концентрации и, по-видимому, не имеет прямой зависимости с количеством поступивших в растение металлов. Визуальные же симптомы токсичности появились на 10–12 день. Таким образом, метаболомный анализ позволяет зафиксировать биохимические изменения, возникающие на 4–6 дней раньше, чем визуальные симптомы токсичности. При этом контрольная группа растений обособляется раньше, а специфическое влияние отдельных металлов на метаболом растений заметно только на 9-е сутки. Первичные изменения метаболома под действием металлов являются скорее общими реакциями на стрессовое воздействие, а далее имеют место адаптивные изменения метаболизма в ответ на конкретные стрессовые факторы.

По-видимому, действие металлов затрагивает сходные пути метаболизма, что проявляется в общих закономерностях изменения концентраций определенных метаболитов. Тем не менее, следует отметить некоторую специфичность метаболомного ответа у растений в условиях токсического влияния отдельных тяжелых металлов. Влияние Cu и Cd проявлялось сходным образом на изменение концентраций хинной кислоты, шикимовой кислоты, янтарной кислоты и пролина, а влияние Ni заметно отличалось. Динамика поступления Ni в ткани растений также имела особенности: при высокой концентрации Ni медленнее поступает в ткани растения, чем Cu и Cd. Содержание Cu и Cd уже на 6-е сутки достигает значительных величин, что оказывает токсическое действие. Ni при дозе 5 мМ достигает таких концентраций только на 9-е сутки.

Сравнительный анализ дозозависимой специфичности влияния металлов показал, что, оба фактора (природа металла и его концентрация) вносят равнозначный вклад в кластеризацию метаболомов растений. Ответные же реакции растений на действие металлов, проявляющиеся в изменении концентраций отдельных метаболитов, существенно отличаются в зависимости от вносимой концентрации металлов (1 или 5 мМ). Выявленные различия могут являться косвенным свидетельством того, что при концентрации 1 мМ происходят адаптационные процессы, а при более высокой концентрации металлов – 5 мМ в растениях проявляются уже токсические реакции.