Физиология человека, 2020, T. 46, № 2, стр. 76-83

МЕТОДИКА

Эксперимент с 21-суточной СИ проводили с участием десяти практически здоровых мужчин в возрасте от 24 до 32 лет, получивших допуск врачебно-экспертной комиссии. Взятие проб венозной крови для иммунологических исследований проводили натощак в утренние часы в фоновом периоде (7 и 2 сут), во время экспериментального воздействия (3, 7, 14, 21 сут), и после завершения пребывания в условиях СИ (7 сут).

Концентрацию цитокинов в плазме крови оценивали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием стандартных наборов реактивов для определения IFNα, IFNγ, TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 (АО “ВЕКТОР-БЕСТ”, Россия) и IL12p70 (Affymetrix, США).

Анализ способности моноцитов периферической крови синтезировать цитокины IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p70, TNFα, IFNγ, IFNα, GM-CSF в системе in vitro при стимуляции соответствующими для каждого Toll-подобного рецептора (TLR) лигандами из набора Human TLR1-9 Agonist kit (InvivoGen, США) выполняли с применением коммерческого набора для мультиплексного анализа цитокинов, хемокинов и факторов роста Cyto/Chemo MAG Premix 41 Milliplex (Merck Millipore, Германия). Концентрацию цитокинов определяли в 24-часовых клеточных культурах моноцитов, высеянных в 24-луночные планшеты (Corning Costar, США).

Статистическую обработку результатов эксперимента осуществляли при помощи пакета прикладных программ “Statistica v.10.0 for Microsoft Windows”. Данные исследования представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильной широты (q25–q75). Достоверность полученных результатов оценивали при помощи непараметрического критерия Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования цитокинового профиля на разных стадиях моделирования эффектов микрогравитационного воздействия показали, что уровень цитокинов в плазме крови имел ярко выраженный индивидуальный характер, однако, следует отметить, что на 14 сут происходило значимое повышение TNFα, IL-12p70 и IFNα (рис. 1, А, Б), причем концентрация последнего достоверно превышала фоновые значения на 21 сут иммерсионного воздействия (рис. 1, Б). Интересно отметить, что в отличие от TNFα и IL-12p70, концентрация которых снижалась к 21 сут эксперимента до фоновых значений, содержание IFNα в плазме крови оставалось выше исходных величин (рис. 1, Б). Содержание в плазме крови IL-10 значимо снижалось на 7 сут эксперимента по сравнению с фоном, восстанавливаясь до исходных значений к 14 сут СИ (рис. 1, Б). Концентрация других цитокинов в плазме крови достоверно не изменялась на протяжении всего эксперимента, однако при этом присутствовали выраженные индивидуальные флуктуации, как в сторону увеличения, так и в сторону снижения концентрации по сравнению с фоновыми значениями.

Рис. 1.

Уровень цитокинов в периферической крови добровольцев-испытателей в эксперименте с 21-суточной “сухой” иммерсией без средств профилактики (n = 10). А – изменение концентрации TNFα и IL-12p70; Б – изменение концентрации IFNα и IL-10; а – содержание TNFα; б – IL-12p70; в – IFNα; г – IL-10; * – достоверное различие с –7 сут (p < 0.05). По оси ординат – содержание цитокинов (пг/мл); по оси абсцисс – сутки экспериментального воздействия (–7 – фоновое исследование до эксперимента, 7, 14, 21 – исследование во время эксперимента, +7 – исследование после завершения эксперимента).

Иммунная система человека поддерживается тонким балансом нескольких систем контроля, действующими по принципу антагонистов, где главная роль отведена T-хелперному (Th) звену CD4⁺-лимфоцитов. Различают несколько видов T-хелперов, однако наиболее важными типами Th-клеток являются Th1 и Th2-лимфоциты. Th1 запускают каскад реакций клеточного иммунитета, в то время как Th2 выступают триггерным механизмом активации гуморального иммунного ответа [17, 18].

Th1 синтезируют ряд цитокинов, такие как IFNγ, IL-2, TNFα, TNFβ, IL-12, их эффекторным цитокином является IFNγ, активирующий клеточный иммунитет, в первую очередь, для борьбы с бактериями посредством фагоцитоза и выработке IgM c ингибированием синтеза IgG и IgE [17]. Th2, в свою очередь, продуцируют IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, их главным эффекторным цитокином являeтся IL-10, ингибирующий дифференцировку CD4⁺-лимфоцитов в Th1 клетки [19].

При воздействии негативных эндогенных и экзогенных факторов, баланс Th1/Th2 может смещаться в ту или иную сторону. Избыточный Th1-иммунный ответ приводит, в основном, к развитию ряда аутомиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз, болезнь Крона, псориаз, ревматоидный артрит, в то время как усиление Th2-иммунного ответа приводит к развитию аллергических заболеваний, в первую очередь аллергического дерматита, астмы, аллергического ринита [13, 14].

Для оценки Th1/Th2 баланса используют соотношение главных эффекторных цитокинов Th1 и Th2 – IFNγ и IL-10 [19], позволяющее оценить смещение иммунного ответа в клеточную или гуморальную стадию.

В настоящем исследовании было показано, что сдвиг Th1/Th2 баланса в сторону усиления гуморального ответа наблюдался на 14 сут экспериментального воздействия с последующим восстановлением к 21 сут СИ и сохранением динамики на 7 сут после завершения эксперимента (рис. 2). Полученные данные свидетельствуют о незначительном изменении функционирования иммунной системы, однако потенциально способным приводить к аллергическим проявлениям во время пребывания человека в условиях СИ.

Рис. 2.

Баланс IFNγ/IL-10 в плазме крови у 10 добровольцев-испытателей до, во время и после пребывания в условиях 21-суточной “сухой” иммерсии без средств профилактики. По оси ординат – соотношение IFNγ и IL-10; по оси абсцисс – сутки экспериментального воздействия (–7 – фоновое исследование до эксперимента, 7, 14, 21 – исследование во время эксперимента, +7 – исследование после завершения эксперимента).

Как было указано ранее, цитокины синтезируются не только иммунокомпетентными клетками, но и клетками эндотелия, фибробластами, клетками мышечной ткани [11, 12]. Этот факт лишний раз подчеркивает высокую степень интегрированности иммунной системы в гомеостатические процессы организма, поскольку вырабатываемые иммунокомпетентными клетками цитокины действуют на другие системы организма человека, и наоборот, цитокины, продуцируемые другими типами клеток оказывают влияние на иммунитет. В связи с изложенными выше фактами, оценить вклад клеток иммунной системы в общее количество цитокинов в сыворотке крови в настоящее время не представляется возможным. Для оценки возможности синтеза цитокинов иммунокомпетентными клетками широко используется метод клеточных культур, суть которого заключается в определении синтеза цитокинов клетками адаптивного или врожденного иммунитета при стимулировании специфическими лигандами. В настоящем исследовании проводили оценку способности CD14⁺-моноцитов синтезировать цитокины при стимулировании TLRs соответствующими лигандами (табл. 1). Как и в случае анализа содержания цитокинов в плазме крови, была показана довольно значительная индивидуальная вариабельность результатов, однако, несмотря на выраженные индивидуальные колебания, наблюдались некоторые общие закономерности. Во-первых, стоит отметить, что спонтанный синтез цитокинов CD14⁺ моноцитами человека достоверно снижался на протяжении эксперимента. Эта тенденция характерна для всех цитокинов, однако для IL-12р70, IL-8, IL-6, IL-1β, TNFα снижение было статистически достоверным (табл. 1). Спонтанная продукция цитокинов в культуре моноцитов свидетельствует о том, что клетки уже были активированы in vivo. Можно было бы предположить, что во время иммерсии обследуемые находились в условиях карантина, во время которого контакты с экзогенной микрофлорой в значительной степени сокращались, в то время как в фоновом периоде неконтролируемые условия повседневной жизни включали контакт с широким спектром антигенов. Однако для некоторых цитокинов (IL-6, IL-1β, IL-8) достоверное снижение наблюдалось уже за 2 сут до начала СИ, когда еще не было условий ограниченного контакта с экзогенной микрофлорой. Это может быть связано с активацией клеток врожденного иммунитета эндогенными лигандами TLRs [20]. Для других цитокинов наблюдалась лишь тенденция к снижению спонтанной продукции цитокинов. Статистически значимых различий данных, полученных в иммерсии по сравнению со вторым фоном, взятым за двое суток до начала воздействия, обнаружено не было. Представляется вероятным влияние общего стресса, связанного с ожиданием серьезного воздействия [21], на иммунную систему, когда нейрогуморальные факторы оказывают существенное ингибирующее влияние на клеточный и гуморальный компоненты иммунитета [22]. Снижение спонтанного синтеза во время СИ может быть обусловлено комплексом описанных выше факторов в сочетании непосредственно с воздействием моделируемых эффектов микрогравитации на иммунную систему.

При индуцированном синтезе цитокинов в ответ на стимуляцию ключевых сигнальных образ-распознающих рецепторов семейства Toll-like соответствующими лигандами был обнаружен ряд интересных особенностей. Во-первых, как и в случае спонтанного синтеза, была выявлена значительная индивидуальная вариабельность значений. Во-вторых, показано, что достоверные изменения продукции цитокинов наблюдаются только в случае снижения их количества по сравнению с первым фоном. В-третьих, при стимуляции TLR4 и TLR5 значимого изменения синтеза цитокинов найдено не было, при этом наибольшее количество изменений в продукции всех цитокинов наблюдается при стимулировании TLR2. В некоторых случаях отмечалось повышение продукции отдельных цитокинов, например IL-8 при стимулировании TLR4 или IL-6 при стимулировании TLR5, однако такое повышение не имело статистически значимую достоверность (табл. 1).

Поскольку способность к синтезу цитокинов является одним из ключевых показателей, характеризующих состояние иммунной системы [7], можно сделать вывод о том, что пребывание в условиях СИ оказывает в целом негативное влияние на активационный потенциал моноцитов. Механизм подобных изменений в настоящее время остается неизвестным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в данной работе результаты показывают, что пребывание практически здорового человека в условиях СИ связано с появлением ряда негативных изменений в функционировании системы иммунитета. Стоит обратить внимание на значительную вариабельность результатов, которая указывает на индивидуальную предрасположенность к развитию нарушений иммунологической реактивности при воздействии на организм человека моделируемых эффектов микрогравитации.

Дальнейшее накопление данных в этой области, их систематизация, тщательный анализ и сопоставление с данными, отражающими состояние не только иммунной, но и других систем, в первую очередь, нейроэндокринной, позволит сформировать представление о механизмах влияния экстремальных факторов окружающей среды на молекулярно-клеточном уровне. Это может способствовать развитию принципиально новых перспективных комплексных методов профилактики и коррекции дисбаланса в иммунной системе человека, что чрезвычайно важно не только для успешного осуществления межпланетных полетов, но и в целом для создания эффективных мер помощи лицам, находящимся в экстремальных условиях среды обитания, оказывающих существенное воздействие на систему иммунитета.

Этические нормы. Все исследования проведены в соответствии с принципами биомедицинской этики, сформулированными в Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующих обновлениях, и одобрены комиссией по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН (Москва).

Информированное согласие. Каждый участник исследования представил добровольное письменное информированное согласие, подписанное им после разъяснения ему потенциальных рисков и преимуществ, а также характера предстоящего исследования.

Финансирование работы. Работа выполнена при поддержке РНФ (грант № 18-75-10 086).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.