1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Цитология
  4. T. 63, № 2, 2021

Цитология, 2021, T. 63, № 2, стр. 147-155

Анализ ядерно-цитоплазматического перераспределения актин-связывающего белка альфа-актинина-4 и сигнального белка RhoA в процессе репликативного старения клеток линии ADH-MSC, выделенных из эпикардиальной жировой ткани человека

Д. Ф. Гончарова 1, А. В. Полянская 1, А. С. Мусорина 2, Г. Г. Полянская 2, Д. Е. Бобков 2, *

1 Кафедра биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета
194064 Санкт-Петербург, Россия

2 Институт цитологии РАН
194064 Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: bobkov@incras.ru

Поступила в редакцию 14.12.2020
После доработки 26.12.2020
Принята к публикации 28.12.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

В работе проведeн молекулярный анализ некоторых механизмов реорганизации актинового цитоскелета в процессе длительного культивирования мезенхимных стволовых клеток человека. С помощью методов иммунофлюоресценции и анализа конфокальных изображений исследовано распределение актин-связывающего белка α-актинина-4 и малой ГТФазы RhoA в мезенхимных стволовых клетках линии ADH-MSC, выделенных из эпикардиальной жировой ткани взрослого человека. Установлено, что в процессе репликативного старения на протяжении 8–17 пассажей в этих клетках происходит перераспределение исследуемых белков из цитоплазмы в ядра клеток, которое сопровождается изменениями в организации актинового цитоскелета. Для оценки организации актинового цитоскелета использовали коэффициент локальной связной фрактальной размерности (LCFD), который характеризует локальные нарушения геометрии неоднородных геометрических объектов и является косвенной мерой оценки структурной целостности такого сложного геометрического объекта, каким является актиновый цитоскелет распластанных клеток. С помощью измерения LCFD конфокальных изображений клеток, окрашенных родамин-фаллоидином, количественно оценивали изменения структурной целостности актинового цитоскелета в процессе репликативного старения. Обнаружено, что с 8-ого по 11 пассаж происходит частичная разборка актинового цитоскелета с последующей сборкой к 17-му пассажу.

Ключевые слова: актиновый цитоскелет, α-актинин-4, RhoA, мезенхимные стволовые клетки, репликативное старение

Актуальной задачей клеточной и молекулярной биологии является получение и сравнительные характеристики МСК человека, выделенных из разных источников. В настоящее время наблюдается тенденция к расширению и углублению исследований по различным характеристикам МСК. Этому посвящено множество работ, перечисленных в недавно вышедшей обзорной статье (Бобков, Полянская, 2020). Эта тенденция отражает значимость таких работ как для понимания функционирования различных клеточных систем, так и для расширения возможностей использования МСК в регенеративной медицине.

Одной из характеристик, свойственной всем неиммортализованным клеточным линиям, включая МСК, является репликативное старение, на завершающей стадии которого, как правило, происходит дегенерация и гибель клеток. Но известны и случаи как длительного существования живых клеток c очень низкой пролиферативной активностью без спонтанного приобретения неограниченного пролиферативного потенциала, так и возможного переключения клеток на другой метаболический путь (Hayflick, 1965; Matsumura et al., 1979; Гаврилов, Гаврилова, 1991).

Репликативное старение МСК человека, наступающее в процессе длительного культивирования клеточных популяций, представляет собой комплексный динамический процесс, индуцированный генетическими и эпигенетическими нарушениями (Бобков, Полянская, 2020). Одной из характеристик, широко не освещенных в литературе, является состояние цитоскелета в процессе репликативного старения. В нашей предыдущей работе, проведенной на клетках линии MSCWJ-1, полученной из Вартонова студня пупочного канатика человека, было показано, что на поздних стадиях репликативного старения в клетках увеличивается структурная целостность акто-миозиновой сократительной системы, увеличивается концентрация малой ГТФазы RhoA в цитоплазме, измененяется характер клеточного движения (миграция) – оно становится более прямолинейным (Bobkov et al., 2020).

Представленная работа является продолжением предыдущих исследований. В работе исследована роль α-актинина-4 и RhoA в организации актинового цитоскелета. Молекулы малыx ГТФаз Rho, к которым относится RhoA, образуют сигнальную сеть, которая получает и обрабатывает информацию от клеточного микроокружения, а затем регулирует перестройки актинового цитоскелета. RhoA, в частности, принимает непосредственное участие в регуляции образования актиновых стресс-фибрилл и сокращения актомиозина (Kim et al., 2018; Aslan, 2019). Роль α-актинина-4 заключается в том, что он связывает актиновые микрофиламенты в пучки и способствует постоянному обновлению актиновых фибрилл, конкурируя с тропомиозином (Kemp, Brieher, 2018).

В работе стояли следующие задачи: 1) длительное культивирование клеток линии ADH-MSC, выделенных из эпикардиальной жировой ткани человека; 2) характеристика процесса репликативного старения с помощью сравнительного анализа доли клеток, проявляющих активность фермента β-галактозидазы на различных пассажах; 3) анализ колоколизации белков RhoA и альфа-актинин-4 как с F-актином, так и с ядрами; 4) измерение локальной связной фрактальной размерности актинового цитоскелета с целью численной оценки его структурной целостности.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Клетки. Клеточная линия мезенхимных стволовых клеток ADH-MSC, выделенная из эпикардиальной жировой ткани человека в процессе аортокоронарного шунтирования, получена и охарактеризована в ЦКП “Коллекции культур клеток позвоночных” ИНЦ РАН (Санкт-Петербург) (Мусорина и др., 2019). Микробиологический анализ подтвердил отсутствие бактериальной, грибковой и микоплазменной контаминации в полученной линии. Линию клеток культивировали, используя ростовую среду, состоящую из 85% среды α-MEM (Биолот, Россия), 15% эмбриональной бычьей сыворотки FBS (HyClone, США), 5 нг/мл фактора роста β-FGF (Sigma-Aldrich, США).

Морфологический анализ. Клетки исследуемой линии в процессе длительного культивирования анализировали с помощью инвертированного микроскопа, оснащeнного объективами с увеличением 20× и 40× (Nicon, Япония).

Репликативное старение клеток. Оценивали активность фермента β-галактозидазы. Клетки ADH-MSC выращивали в чашках Петри диаметром 3.5 см до образования субконфлюента. Затем среду удаляли и окрашивали клетки с помощью набора реактивов (Senescence β-galactosidase staining kit; Cell Signaling, США) согласно инструкции. У клеток, вступающих в фазу репликативного старения, цитоплазма имеет ярко-синюю окраску. Анализ проводили с помощью инвертированного микроскопа (Nicon, Япония) на 9-, 12- и 17-м пассажах. Долю окрашенных клеток (%) определяли путем подсчета более 700 клеток в разных полях зрения на одну временную точку.

Иммунофлюоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия для выявления белков RhoA и α‑актинина-4. Перед иммунофлюоресцентным окрашиванием клетки ADH-MSC, выращенные на стeклах, фиксировали 3%-ным раствором параформальдегида на фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) в течении 10 мин при комнатной температуре. Пермеабилизацию клеток проводили 10 мин в растворе 0.1%-ного Triton-X100 в PBS. Для предотвращения неспецифического связывания антител стекла с клетками выдерживали 20 мин в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина. В качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела, выработанные против синтетического пептида, соответствующего аминокислотному участку 28–38 α-актинина-4 человека (Enzo Biochem, США) и кроличьи поликлональные антитела к аминокислотному участку 177–189 белка RhoA человека (Sigma-Aldrich, США). Вторичными антителами были козлиные антитела, выработанные против антител кролика, конъюгированные с флюоресцентной меткой Alexa Fluor 488 (Invitrogen, США). Время инкубирования клеток с первичными и вторичными антителами – 1 ч. Далее клетки инкубировали 20 мин в PBS, содержащем родамин-фаллоидин (50 мкг/мл), для визуализации актинового цитоскелета (Thermo Fisher Scientific, США). Ядра клеток окрашивали красителем Hoechst33342 в концентрации 1.5 мкг/мл (Thermo Fisher Scientific, США). После каждого этапа окрашивания клетки трижды промывали PBS. Препарат с клетками монтировали на стекло с помощью ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, США).

Изображения окрашенных клеток получали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TSC SP8 (Германия), используя 63-кратный объектив с масляной иммерсией (Leica, Германия). Для возбуждения флуоресценции родамин-фаллоидина и Alexa Fluor 488 использовали HeNe- (543 нм) и аргоновый (488 нм) лазер соответственно. Для возбуждения флуоресценции Hoechst 33 342 использовали диодный лазер (405 нм). Флуоресценцию детектировали с помощью фотоумножителей в следующих спектральных диапазонах: 493–540 нм для Alexa Fluor 488, 552–792 нм для родамин-фаллоидина и 410–500 нм для Hoechst 33342. Ширина оптического среза (пинхол) составляла 100 мкм. Производили раздельное сканирование в трех каналах: Alexa Fluor 488, родамин-фаллоидин, Hoechst 33 342.

Анализ колокализации RhoA и α-актинина-4 с ядром и с актиновым цитоскелетом. Для анализа колокализации использовали изображения с разрешением 1024 × 1024 пикселя. В программе ImageJ 1.52i на изображениях выделяли вручную области интереса с помощью функции ROI (Rueden et al., 2017). С помощью плагина Coloc2 в выбранных ROI рассчитывали непараметрический коэффициент корреляции Кендалла (bTau) в качестве коэффициента колокализации. Был выбран именно коэффициент Кендалла, так как ранее в нашей работе с клетками линии MSCWJ-1 было показано, что этот коэффициент лучше остальных отражает изменения колокализации актин-связывающих белков (Bobkov et al., 2020). В качестве отрицательного контроля вычисляли коэффициент bTau для оценки колокализации сигналов от конъюгированных с флюорохромом Alexa Fluor 488 вторичных антител (без применения первичных) с родамин-фаллоидином или Hoechst 33 342. Для регистрации изображений использовали те же настройки конфокального микроскопа.

Оценка локальной связной фрактальной размерности актинового цитоскелета. Чтобы охарактеризовать морфологию цитоскелета, оценивали коэффициент, называемый локальной связной фрактальной размерностью актинового цитоскелета (local connected fractal dimension – LCFD). Коэффициент LCFD характеризует локальные нарушения геометрии неоднородных геометрических объектов. В отличие от глобальной фрактальной размерности, рассчитываемой для всего изображения, набор значений локальной фрактальной размерности рассчитывается для каждого пикселя, принадлежащего анализируемому объекту (Waliszewski, 2016). Измерение коэффициента LCFD является косвенной мерой связности для количественной оценки такого сложного геометрического объекта, как актиновый цитоскелет любой фибробластоподобной клетки при монослойном культивировании (Qian et al., 2012; Alhussein et al., 2016; Bobkov et al., 2020). Этот коэффициент изменяется в диапазоне от 0 до 2 в зависимости от степени сложности структуры (от количества деталей в структуре). LCFD актинового цитоскелета считали с помощью плагина FracLac в программе ImageJ (Karperien, 2013). Обрабатывали конфокальные изображения в разрешении 1024 × 1024 пикселя, полученные при регистрации сигнала от родамин-фаллоидина, на которых вручную выделяли с помощью функции ROI области интереса, содержащие распластанные клетки.

Методы статистического анализа. Результаты по оценке репликативного старения обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при вероятности нулевой гипотезы Р < 0.05. Сбор информации для статистической обработки остальных результатов происходил с помощью электронных таблиц Office Excel 2016 (Microsoft, США). Учитывали следующие данные для клеток каждого пассажа: коэффициент колокализации (bTau) RhoA c ядром, RhoA с F-актином, α-актинина-4 с ядром и α-актинина-4 с F-актином (для каждого эксперимента число повторов n = 20), а также параметр LCFD. Всю статистическую обработку результатов вели в свободной программной среде R версии 3.6.3 (Team, 2020). Данные, полученные при анализе колокализации, не прошли тест Шапиро−Уилка (Shapiro, Francia, 1972) на нормальность распределения, объeм выборки был небольшим (n < 100), поэтому для выявления достоверных отличий между группами измерений использовали непараметрический метод Вилкоксона (Wilcoxon, 1945). Различия считали достоверными при вероятности нулевой гипотезы Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфология клеток. Проведенная в процессе культивирования оценка морфологии клеток линии ADH-MSC показала однородность клеточных популяций со средними по размеру вытянутыми фибробластоподобными клетками, проявляющими тенденцию к увеличению размеров и распластанности в процессе репликативного старения (данные не представлены).

Репликативное старение. Процесс репликативного старения клеток линии ADH-MSC оценивали по активности β-галактозидазы в клеточных популяциях (табл. 1). Уже на 9-м пассаже обнаружена небольшая доля стареющих клеток, которая существенно увеличивается к 12-му пассажу (P < 0.01). Процесс репликативного старения протекает быстро, и к 17-му пассажу доля стареющих клеток увеличивается в 3.2 раза по сравнению с пассажем 9 (P < 0.01), что свидетельствует о наступлении активного репликативного старения. Эти результаты совпадают с полученными ранее для клеток этой же линии (Мусорина и др., 2019; Воронкина и др., 2020).

Таблица 1.  

Доля клеток (%) с выраженной активностью β-галактозидазы (β-гал) в процессе культивирования клеток ADH-MSC

Пассаж Число проанализированных клеток Доля клеток, окрашенных на β-гал, %
9 743 17.6 ± 1.4
12 726 32.8 ± 1.7
17 1287 56.5 ± 1.4

Примечание. Даны средние значения и их ошибки для доли клеток на каждом пассаже.

Колокализация. Чтобы проследить за динамикой реорганизации сократительного аппарата в процессе репликативного старения клеток линии ADH-MSC, мы использовали метод иммунофлюоресценции. Были получены изображения клеток на 8–17-ом пассажах, окрашенных на белки RhoA и α-актинин-4, актиновый цитоскелет и ядра. Примеры таких изображений представлены на рис. 1. На изображениях можно видеть клетки с характерно окрашенными ядрами (крупные объекты овальной формы; рис. 1а, г), а также с окрашенным актиновым цитоскелетом (нити филаментов, тянущиеся через всю клетку и собранные в пучки в областях, близких к цитоплазматической мембране; рис. 1в, е) и с окрашенными белками RhoA и α-актинином-4 (точечные объекты, концентрирующиеся преимущественно в цитоплазме и в ядрах; рис. 1б, д).

Рис. 1.

Конфокальные изображения клеток линии ADH-MSC, выращенных на стеклах и зафиксированных на 16-ом пассаже. Клетки окрашены красителем Hoechst 33342 для визуализации ядер (а, г), флуоресцентно мечеными антителами против α‑актинина-4 (б) и против малой ГТФазы RhoA (д), а также родамин-фаллоидином для окраски F-актина (в, е). Масштабный отрезок : 25 мкм.

При дальнейшем анализе полученных результатов была построена линейная регрессия для коэффициентов колокализации RhoA и α-актинина-4 с ядром и F-актином клетки с целью выяснения их распределения относительно ядра и актиновых фибрилл в процессе длительного культивирования клеточной линии. В результате было обнаружено, что по мере культивирования с увеличением номера пассажа происходит снижение колокализации с F-актином как α-актинина-4, так и RhoA на 8–17 пассажах (рис. 2в, г; табл. 2). Колокализация α-актинина-4 и RhoA с ядрами, наоборот, увеличивается при увеличении номера пассажа (рис. 2а, б; табл. 2).

Рис. 2.

Зависимость коэффициента колокализации bTau от времени культивирования (номера пассажа) в клетках ADH-MSC в процессе репликативного старения. На диаграммах точками представлены результаты измерений коэффициента колокализации RhoA (а) и α-актинина-4 (б) с ядром, RhoA (в) и α-актинина-4 (г) с F-актином. Номера пассажей считали от выделения клеток из ткани донора. Прямые линии – результат расчета линейной регрессии коэффициентов bTau в зависимости от номера пассажа. Вдоль линий регрессии серая полоса показывает 95%-ые доверительные области. Штриховая линия – уровень bTau = 0.

Таблица 2.  

Параметры линейной регрессии коэффициентов колокализации bTau в зависимости от номера пассажа в процессе репликативного старения клеток линии ADH-MSC

Колокализация Параметр регрессии a Параметр регрессии b R2 P
RhoA с F-актином 0.308 –0.024 0.220 1.407е-12
RhoA с ядром –0.357 0.031 0.265 3.816e-15
α-Актинин-4/F-актин 0.324 –0.015 0.112 7.431e-07
α-Актинин-4/ядро –0.218 0.021 0.294 <2.2e-16

Примечание. Представлены параметры a, b уравнения линейной регрессии y = (a + b)x, где x – номера пассажей, y – коэффициент колокализации bTau. Для каждой линейной регрессии указаны коэффициент детерминации (R2) и уровень значимости P. Экстремально низкие значения P представлены в экспоненциальной нотации.

Значения коэффициентов корреляции bTau в каждом эксперименте и результат непараметрического теста Вилкоксона на значимость отличий средних значений коэффициентов bTau от начального, измеренного на 8-ом пассаже, представлены в табл. 3. Большинство значений bTau для разных пассажей достоверно отличаются от пассажа 8. Средние значения (и стандартное отклонение) отрицательного контроля для коэффициентов колокализации составляли 0.03 ± 0.03 для колокализации с ядром, 0.03 ± 0.07 для колокализации с F-актином (n =10).

Таблица 3.  

Значения коэффициента bTau, вычисленные для колокализации с F-актином или ядром белка RhoA и α-актинина-4 в клетках ADH-MSC, выращенных на стeклах и зафиксированных на различных пассажах

Пассаж RhoA–F-актин RhoA–ядро α-Актинин-4–F-актин α-Актинин-4– ядро
8 0.113 ± 0.044 −0.111 ± 0.078 0.188 ± 0.073 −0.025 ± 0.073
9 0.177 ± 0.084б –0.161 ± 0.094 0.274 ± 0.104б 0.009 ± 0.128
10 0.218 ± 0.084г –0.152 ± 0.087 0.235 ± 0.048а −0.079 ± 0.083а
11 −0.045 ± 0.067г 0.058 ± 0.073г 0.003 ± 0.039г 0.092 ± 0.066г
12 –0.109 ± 0.076г 0.133 ± 0.091г 0.180 ± 0.116 0.005 ± 0.068
13 0.010 ± 0.070г −0.008 ± 0.081г 0.199 ± 0.080 −0.021 ± 0.081
14 − − 0.094 ± 0.046 г 0.049 ± 0.032в
15 − − 0.017 ± 0.101г 0.160 ± 0.084г
16 −0.160 ± 0.078г 0.312 ± 0.082г 0.043 ± 0.110 г 0.187 ± 0.073г
17 0.049 ± 0.036г −0.027 ± 0.043в 0.190 ± 0.083 0.112 ± 0.067г

Примечание к табл. 3 и 4. Представлены средние значения и стандартные отклонения. Значимость отличий от пассажа 8 (тест Вилкоксона на множественную проверку гипотез): аP < 0.05, бP < 0.01, вP < 0.001, гP < 0.0001.

Локальная связная фрактальная размерность цитоскелета. Анализ LCFD актинового цитоскелета при культивировании клеток линии ADH-MSC от 8- до 17-го пассажа свидетельствует об изменении параметра LCFD в процессе репликативного старения (рис. 3). Приведенные в табл. 4 средние значения коэффициента LCFD для пассажей 8–11 свидетельствуют о его постепенном снижении. На 11-м пассаже его значение минимально. После пассажа 11 наблюдается повышение коэффициента LCFD, который к пассажу 14 достигает значения, не отличающегося от пассажа 8, и остаeтся на этом уровне до пассажа 17 (рис. 3). Таким образом, коэффициент LCFD на пассаже 8 значимо отличается от других значений только на пассажах 9–13.

Рис. 3.

Изменение коэффициента локальной связной фрактальной размерности (LCFD) актинового цитоскелета на различных пассажах в процессе репликативного старения клеток линии ADH-MSC. По вертикальной оси представлены значения LCFD, по горизонтальной оси представлены номера пассажей клеточной культуры. Показаны средние значения и стандартные отклонения (вертикальные отрезки) значений LCFD. n – число независимых измерений на каждом пассаже.

Таблица 4.  

Значения коэффициента LCFD F-актина в процессе репликативного старения клеток линии ADH-MS

Пассаж LCFD F-актина
8 1.712 ± 0.005
9 1.675 ± 0.043а
10 1.562 ± 0.066б
11 1.408 ± 0.119б
12 1.640 ± 0.036в
13 1.628 ± 0.054а
14 1.697 ± 0.037
15 1.588 ± 0.118
16 1.585 ± 0.106
17 1.704 ± 0.043

ОБСУЖДЕНИЕ

Тенденция клеток линии ADH-MSC к увеличению размеров и распластанности в процессе репликативного старения была наглядно продемонстрирована ранее (Мусорина и др., 2019).

По результатам исследования колокализации RhoA и α-актинина-4 с ядром и актиновым цитоскелетом можно предположить, что в процессе репликативного старения клеток линии ADH-MSC участники реорганизации цитоскелета RhoA и α-актинин-4 частично выходят из цитоплазмы, перестают взаимодействовать с актиновым цитоскелетом и направляются в ядро. При этом результаты измерений параметра LCFD свидетельствуют о том, что снижение содержания α-актинина-4 в цитоплазме не приводит к уменьшению структурной целостности актинового цитоскелета. Мы предполагаем, что такой эффект может объясняться тем, что на поздних пассажах основную роль в стабилизации пучков актиновых микрофиламентов в клетках этой линии начинают играть другие актин-связывающие белки, например α-актинин-1 или различные изоформы тропомиозинов, что, как следствие, может изменять параметры клеточной подвижности. Однако для подтверждения этого предположения необходимы дополнительные эксперименты.

О роли белков RhoA и α-актинина-4 в цитоплазме известно достаточно много (Ridley, Hall, 1992; Burridge, Wennerberg, 2004; Senger et al., 2019), тогда как функции этих белков в ядре в настоящее время активно изучаются (Хотин и др., 2009; Guilluy et al., 2011; Dubash et al., 2011). Можно предположить, что RhoA и α-актинин-4 в процессе репликативного старения направляются в ядро для регуляции организации ядерного актинового цитоскелета. Известно, что актин является частью ядерного протеома, хотя в ядре он выявляется в значительно меньшем количестве, чем в цитоплазме (Grosse, Vartiainen, 2013). В ядрах клеток самых разных организмов был обнаружен актин как в G-, так и в F-форме. Актин в ядре способен влиять на такие процессы, как регуляция транскрипции, репарация ДНК, регуляция клеточного цикла и апоптоз (Miyamoto et al., 2011; Miyamoto, Gurdon, 2013; Parisis et al., 2017; Kelpsch, Tootle, 2018; Plessner, Grosse, 2019).

Следует отметить, что RhoA и α-актинин-4 могут направляться в ядро для участия в процессах, не связанных с актиновым цитоскелетом. В недавнем исследовании на клетках остеосаркомы было показано, что α-актинин-4 может активировать сигнальный путь транскрипционного фактора NF-κB (Huang et al., 2020). Ранее на раковых клеточных линиях было показано, что RhoA способен связываться c анти-апоптотическим фактором P50 (компонент NF-κB) в ядре и частично в ядрышках (Xu et al., 2013). Позже было выяснено, что ядрышковая локализация RhoA может быть связана с активным синтезом рРНК, ингибирование которого вызывает перераспределение ядрышкового RhoA в нуклеоплазму (Li et al., 2016).

Следует подчеркнуть, что картина изменений колокализации RhoA и α-актинина-4 с ядром в клетках линии ADH-MSC, выявленная в данном исследовании, значительно отличается от тех результатов, которые были получены нами ранее при исследовании репликативного старения клеток линии MSCWJ-1. В клетках MSCWJ-1 мы обнаружили, что на поздних пассажах и RhoA, и α-актинин-4 в значительной мере выходят из ядра и локализуются, в основном, в цитоплазме (Bobkov et al., 2020), а в настоящей работе эти белки, наоборот, к поздним пассажам накапливаются в ядрах. Кроме того, клетки линий MSCWJ-1 и ADH-MSC выделены из разных источников, клетки линии MSCWJ-1 выделены из Вартонова студня пупочного канатика здорового донора, а клетки линии ADH-MSC – из эпикардиальной жировой ткани донора при аортокоронарном шунтировании, т.е. донора с сердечным заболеванием.

Подробный анализ линии ADH-MSC показал, что она существенно отличается по ряду других характеристик от МСК, выделенных из разных других источников, но от здоровых доноров. К таким характеристикам относятся: преждевременное репликативное старение, существенные цитогенетические нарушения, изменение содержания белков ВКМ и активностей металлопротеиназ при репликативном старении. Возможно, причиной таких различий является нездоровое микроокружение, в котором клетки находились еще до перевода в состояние in vitro (Мусорина и др., 2019; Воронкина и др., 2020). Для того, чтобы понять, является ли характер ядерно-цитоплазматического распределения актин-связывающих белков в процессе репликативного старения специфическим признаком конкретной линии, или является признаком линий клеток, выделенных из здорового микроокружения, необходимо проведение исследований линий МСК, полученных из разных источников, но от здоровых доноров.

Результаты измерения параметра LCFD актинового цитоскелета свидетельствуют о том, что в ходе репликативного старения в клетках линии ADH-MSC происходит обратимая реорганизация структур актинового цитоскелета: с 8 по 11 пассаж происходит частичная разборка актинового цитоскелета с последующей сборкой к пассажу 17. Можно предположить, что такая реорганизация актинового цитоскелета может быть связана с сигнальными событиями, сопровождающими изменение активности малых ГТФ-аз и их эффекторов и обусловленные генетическими или эпигенетическими факторами. Для проверки этого предположения необходимы дальнейшие исследования по сравнительному анализу роли малых ГТФ-аз в процессе репликативного старения в различных клеточных линиях МСК.

Список литературы

  1. Бобков Д.Е., Полянская Г.Г. 2020. Клеточные и молекулярные характеристики репликативного старения мезенхимных стволовых клеток человека. Цитология. Т. 62. № 11. С. 782. (Bobkov D.E., Poljanskaya G.G. 2020. Cellular and molecular characteristics of replicative senescence of human mesenchymal stem cells. Tsitologiya. V. 62. P. 782.)

  2. Воронкина И.В., Смагина Л.В., Бильдюг Н.Б., Мусорина А.С., Полянская Г.Г. 2020. Динамика активности матриксных металлопротеиназ и содержания белков внеклеточного матрикса в процессе репликативного старения линий мезенхимных стволовых клеток человека. Цитология. Т. 62. № 3. С. 210. (Voronkina I.V., Smagina L.V., Bildyug N.B., Musorina A.S., Poljanskaya G.G. 2020. Dynamics of matrix metalloproteinases activity and extracellular matrix proteins content of human mesenchymal stem cell lines during replicative aging. Tsitologiya. V. 62. № 3. P. 210 (Cell. Tiss. Biol. V. 14. P. 349).)

  3. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. 1991. Биология продолжительности жизни. М.: Наука. 280 с. (Gavrilov L.A., Gavrilova N.S. 1991. The biology of life span: A quantitative approach. M.: Nauka. 280 pp.)

  4. Мусорина А.С., Зенин В.В., Турилова В.И., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. 2019. Характеристика неиммортализованной линии мезенхимных стволовых клеток, выделенных из эпикардиальной жировой ткани человека. Цитология. Т. 61. № 4. С. 272. (Musorina A.S., Zenin V.V., Turilova V.I., Yakovleva T.K., Poljanskaya G.G. 2019. Characterization of a nonimmortalized mesenchymal stem cell line isolated from human epicardial adipose tissue. Cell Tiss. Biol. (Tsitologiya) V. 13. № 4. P. 247).

  5. Хотин М.Г., Туроверова Л.В., Подольская Е.П., Краснов И.А., Соловьева А.В., Аксенова В.Ю., Магнуссон К.-Э., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2009. Исследование ядерных белковых комплексов α-актинина-4 методами двумерного электрофореза и масс-спектрометрии. Цитология. Т. 51. № 8. С. 684. (Khotin M.G., Turoverova L.V., Podolskaya E.P., Krasnov I.A., Solovyeva A.V., Aksenova V.Y., Magnusson K.E., Pinaev G.P., Tentler D.G. 2009. Analysis of nuclear protein complexes comprising α-actinin-4 by 2D-electrophoresis and mass spectrometry. Cell Tiss. Biol. V. 3. № 5. P.431. https://doi.org/ 519X09050058)https://doi.org/10.1134/S1990

  6. Alhussein G., Shanti A., Farhat I.A.H., Timraz S.B.H., Alwahab N.S.A., Pearson Y.E., Martin M.N., Christoforou N., Teo J.C.M. 2016. A spatiotemporal characterization method for the dynamic cytoskeleton. Cytoskeleton. V. 73. P. 221. https://doi.org/10.1002/cm.21297

  7. Aslan J.E. 2019. Platelet Rho GTPase regulation in physiology and disease. Platelets. V. 30. P. 17. https://doi.org/10.1080/09537104.2018.1475632

  8. Bobkov D., Polyanskaya A., Musorina A., Lomert E., Shabelnikov S., Poljanskaya G. 2020. Replicative senescence in MSCWJ-1 human umbilical cord mesenchymal stem cells is marked by characteristic changes in motility, cytoskeletal organization, and RhoA localization. Mol. Biol. Rep. V. 47. P. 3867. https://doi.org/10.1007/s11033-020-05476-6

  9. Burridge K., Wennerberg K. 2004. Rho and Rac take center stage. Cell. V. 116. P. 167. https://doi.org/ -8674(04)00003-0https://doi.org/10.1016/s0092

  10. Dubash A.D., Guilluy C., Srougi M.C., Boulter E., Burridge K., García-Mata R. 2011. The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals. PLoS One. V. 6. P. e17380. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017380

  11. Grosse R., Vartiainen M.K. 2013. To be or not to be assembled: Progressing into nuclear actin filaments. Nat. Rev. Mol. V. 14. P. 693. https://doi.org/10.1038/nrm3681

  12. Guilluy C., Dubash A.D., García-Mata R. 2011. Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus. Nat. Protoc. V. 6. P. 2050. https://doi.org/10.1038/nprot.2011.411

  13. Hayflick L. 1965. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. V. 37. P. 614.

  14. Huang Q., Li X., Huang Z., Yu F., Wang X., Wang S., He Z., Lin J. 2020. ACTN4 promotes the proliferation, migration, metastasis of osteosarcoma and enhances its invasive ability through the NF-κB pathway. Pathol. Oncol. Res. V. 26. P. 893. https://doi.org/10.1007/s12253-019-00637-w

  15. Karperien A. 2013. FracLac for ImageJ. Charles Sturt University. Colombo. https://doi.org/10.13140/2.1.4775.8402

  16. Kelpsch D.J., Tootle T.L. 2018. Nuclear actin: From discovery to function. Anatomical Record. V. 301. P. 1999. https://doi.org/10.1002/ar.23959

  17. Kemp J.P., Brieher W.M. 2018. The actin filament bundling protein α-actinin-4 actually suppresses actin stress fibers by permitting actin turnover. J. Biol. Chem. V. 293. P. 14 520. https://doi.org/10.1074/jbc.RA118.004345

  18. Kim J.G., Islam R., Cho J.Y., Jeong H., Cap K.C., Park Y., Hossain A.J., Park J.B. 2018. Regulation of RhoA GTPase and various transcription factors in the RhoA pathway. J. Cell. Physiol. V. 233. P. 6381. https://doi.org/10.1002/jcp.26487

  19. Li Y., Hu Y., Che L., Jia J., Chen M. 2016. Nucleolar localization of Small G protein RhoA is associated with active RNA synthesis in human carcinoma HEp-2 cells. Oncol. Lett. V. 11. P. 3605. https://doi.org/10.3892/ol.2016.4450

  20. Matsumura T., Zerrudo Z., Hayflick L. 1979. Senescent human diploid cells in culture: survival, DNA synthesis and morphology. J. Gerontol. V. 34. P. 328.

  21. Miyamoto K., Gurdon J.B. 2013. Transcriptional regulation and nuclear reprogramming: Roles of nuclear actin and actin-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. V. 70. P. 3289. https://doi.org/10.1007/s00018-012-1235-7

  22. Miyamoto K., Pasque V., Jullien J., Gurdon J.B. 2011. Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes Dev. V. 25. P. 946. https://doi.org/10.1101/gad.615211

  23. Parisis N., Krasinska L., Harker B., Urbach S., Rossignol M., Camasses A., Dewar J., Morin N., Fisher D. 2017. Initiation of DNA replication requires actin dynamics and formin activity. EMBO J. V. 36. P. 3212. https://doi.org/10.15252/embj.201796585

  24. Plessner M., Grosse R. 2019. Dynamizing nuclear actin filaments. Curr. Opin. Cell Biol. V. 56. P. 1. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2018.08.005

  25. Qian A.R., Li D., Han J., Gao X., Di S.M., Zhang W., Shang P. 2012. Fractal dimension as a measure of altered actin cytoskeleton in MC3T3-E1 cells under simulated microgravity using 3-D/2-D clinostats. IEEE Trans. Biomed. Eng. V. 59. P. 1374. https:// doi.org/https://doi.org/10.1109/TBME.2012.2187785

  26. Ridley A.J., Hall A. 1992. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. V. 70. P.389. https://doi.org/10.1016/0092-8674(92)90163-7

  27. Rueden C.T., Schindelin J., Hiner M.C., DeZonia B.E., Walter A.E., Arena E.T., Eliceiri K.W. 2017. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. V. 18. P. 1. https://doi.org/10.1186/s12859-017-1934-z

  28. Shapiro S.S., Francia R.S. 1972. An approximate analysis of variance test for normality. J. Am. Stat. Assoc. V. 67. P. 215. https://doi.org/10.1080/01621459.1972.10481232

  29. Senger F., Pitaval A., Ennomani H., Kurzawa L., Blanchoin L., Théry M. 2019. Spatial integration of mechanical forces by alpha-actinin establishes actin network symmetry. J. Cell Sci. V. 132. P. 236604. https://doi.org/10.1242/jcs.236604

  30. Team R.C. 2020. R: A language and environment for statistical computing. R foundation for statistical computing. Vienna, Austria. http://www.r-project.org/index.html

  31. Xu J., Li Y., Yang X., Chen Y., Chen M. 2013. Nuclear translocation of small G protein RhoA via active transportation in gastric cancer cells. Oncol. Rep. V. 30. P. 1878. https://doi.org/10.3892/or.2013.2638

  32. Wilcoxon F. 1945. Individual comparisons by ranking methods. Biometrics Bulletin. V. 1. P. 80. https://doi.org/10.2307/3001968

  33. Waliszewski P. 2016. The quantitative criteria based on the fractal dimensions, entropy, and lacunarity for the spatial distribution of cancer cell nuclei enable identification of low or high aggressive prostate carcinomas. Front. Physiol. V. 7. P. 34. https://doi.org/10.3389/fphys.2016.00034

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Цитология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал