Цитология, 2021, T. 63, № 3, стр. 260-271

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Получение клеток. В эксперименте использовали клетки, полученные из мечевидных хрящей двух беспородных белых крыс-самцов (масса 300 г, возраст 4 мес.). Хрящ отделяли от грудины, удаляли все мягкие ткани, измельчали ножницами на кусочки толщиной 3–4 мм, дважды промывали стерильным фосфатным буфером и помещали в стакан с 0.15%-ным раствором коллагеназы в среде DMEM. Фрагменты ткани инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение ~20 ч (MCO-5AC, Sanyo, Япония). После инкубации для окончательного разделения клеток раствор перемешивали 30 мин на магнитной мешалке (Biosan, Латвия), затем клетки осаждали в течение 5 мин при 400 g (центрифуга ELMI CM-6M, Латвия). Для отмывания от фермента клеточный осадок ресуспендировали в среде, дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция) и центрифугировали в том же режиме. Процедуру повторяли дважды. После этого клетки ресуспендировали в среде с сывороткой, отбирали 200 мкл суспензии, окрашивали 0.4%-ным раствором трипанового синего в фосфатном буфере и подсчитывали количество живых клеток.

Культивирование клеток. Клеточную суспензию (~450 000 мл^–1) переносили в культуральный флакон с площадью поверхности 25 см² (Corning, США), добавляли среду с 10% сыворотки, пенициллином-стрептомицином (по 50 ЕД/мкг/мл), глютамином (649 мкг/мл), помещали в СО₂-инкубатор для прикрепления. Через 48 ч производили замену среды на свежую. Культивировали до образования монослоя (примерно 7 сут), после чего переносили в новые флаконы. Для эксперимента использовали клетки 2-го пассажа.

Подготовка биочернил. Биочернила готовили на основе стерильного ателоколлагена свиньи I типа в соответствии с описанной методикой (Osidak et al., 2019). В день эксперимента клетки снимали с пластика раствором трипсина−ЭДТА, после окрашивания трипановым синим подсчитывали в камере Горяева (Минимед, Россия) количество живых клеток, центрифугировали (400 g, 5 мин) и ресуспендировали в 0.25 мл среды без сыворотки. Клеточную суспензию в объеме 0.25 мл смешивали с 0.25 мл буферного раствора для коллагена и охлаждали при 4°С в течение 10 мин. Этот раствор смешивали с 0.5 мл раствора коллагена, получив таким образом биочернила с концентрацией коллагена 4%. До печати биочернила держали при 4°C. Конечная концентрация клеток составляла 20 млн мл^–1.

Параметры печати. Для создания скаффолдов был использован 3D-биопринтер Rokit Invivo (Южная Корея) с ПО версии 1.68. Слайсинг модели проводили в программе NewCreatorK версии 1.57.63. Гидрогель находился в шприце с внутренним диаметром 8.24 мм. Подача материала осуществлялась через иглу 21G (внутренний диаметр 514 мкм) длиной 0.5 дюймов типа “Luer-Lock”. Печать осуществляли в стерильные чашки Петри диаметром 60 мм (Corning, США). Высота слоя составляла 386 мкм – 75% от диаметра сопла (Аргучинская и др., 2019). Для получения стабильного филамента печать проводили с увеличенным в 1.5 раза выходом материала с пропорционально (до уровня 66%) сниженной плотностью заполнения и концентрическим алгоритмом печати. Выход материала на первом слое увеличивался на 30% для учета погрешности определения нулевого уровня. Скорость печати составляла 5 мм/с. Температура диспенсера была установлена на уровне 4°C, температура печатного столика соответствовала комнатной. Перед печатью проводили стерилизацию внутреннего пространства принтера с помощью встроенной УФ-лампы с длиной волны 254 нм. В каждой чашке размещали по три печатных конструкции размером 4 × 4 × 4 мм.

Инкубирование после печати. После окончания печати чашки заливали теплой питательной средой в количестве, полностью покрывающем печатные конструкции. Состав среды: DMEM с содержанием глюкозы 4.5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ЕД/мкг/мл пенициллина-стрептомицина, 649 мкг/мл глютамина, 100 нг/мл фактора роста фибробластов, 100 нг/мл инсулиноподобного фактора роста I типа, 10 нг/мл трансформирующего фактора роста β1. Каркасы инкубировали в стандартных для культур клеток условиях. Среду меняли два раза в неделю.

Эксперименты на животных. Через 1 ч после печати два скаффолда были имплантированы двум беспородным белым крысам-самцам. Все операции с животными осуществляли с применением ингаляционного эфирного наркоза. Животным выстригали шерсть в области холки, операционное поле обрабатывали 70%-ным раствором этанола. Делали разрез ножницами и с помощью скальпеля формировали под кожей карман, в который помещали имплантат. При зашивании раны края кармана стягивали, место вживления имплантата помечали цветной нитью шовного материала. Шов обрабатывали 3%-ным раствором перекиси водорода. Второй шов накладывали на кожу, повторно обрабатывали перекисью водорода. Для лучшей фиксации сверху наносили медицинский клей. Для обезболивания вокруг операционного поля в холку в трех местах вводили по 0.1 мл 0.5%-ного раствора новокаина. В течение эксперимента крыс содержали изолированно друг от друга в одиночных клетках со свободным доступом к воде и пище. Место операции визуально осматривали ежедневно. Животных подвергли эвтаназии через 2 и 6 нед. после имплантации, отбирали материал для гистологического исследования.

Гистологические и иммуногистохимические исследования. Гистологическому исследованию подвергали напечатанные конструкции через 1 ч, 2 и 4 нед. после печати. Материал, полученный в экспериментах с животными, исследовали через 2 и 6 нед. после имплантации. Коллагеновые каркасы и фрагменты тканей фиксировали 24 ч в кислой жидкости Буэна. После отмывки в 70%-ном этаноле выполняли стандартную гистологическую проводку образцов с их последующим заключением в парафиновую среду. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм, полученные на микротоме (Leica RM2235, Германия), помещали на силанизированные стекла (S3003, Dako, Дания). Для гистологических исследований депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином и альциановым синим по Моури. После обезвоживания в спиртах и просветления в ксилоле препараты заключали в канадский бальзам.

Иммуногистохимические исследования на серийных срезах проводили с использованием поликлональных кроличьих антител к ядерному антигену пролиферирующих клеток – PCNA (1 : 100) и моноклональных кроличьих антител к маркеру эндотелия – адгезионной молекулы тромбоцитов/эндотелиальных клеток-1 – PECAM-1 (1 : 250). Для иммуновизуализации кроличьих антител применяли козьи антитела к кроличьим IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена (1 : 1000). Растворы для иммуногистохимии готовили на фосфатно-солевом буфере.

Выявление антигенов на гистологических срезах выполнено согласно основным требованиям для иммунопероксидазных методов. Предварительно все антитела и наборы были протестированы на позитивном контроле экспериментального материала. Оптимальные условия иммуноокрашивания определяли по соотношению интенсивности иммуноположительной реакции к “фону”. Согласно протоколу иммуногистохимических исследований, до нанесения первичных антител к PCNA и CD31 депарафинированные срезы, погруженные в цитратный буфер (рН 6.0), прогревали в микроволновой печи (5 мин, 720 Вт). Эндогенную пероксидазу блокировали в 3%-ном растворе перекиси водорода. В блокирующий буфер добавляли 2% нормальной сыворотки животных-доноров вторых антител, 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.1% Тритона Х-100. В растворе первичных антител препараты инкубировали в течение ночи во влажной камере при 4°С. После отмывки препаратов в фосфатно-солевом буфере на срезы наносили вторичные антитела на 1 час при комнатной температуре. Субстратную пероксидазу выявляли с использованием диаминобензидина (Liquid DAB+, DAKO, К3468). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.

Гистологические препараты изучали в микроскопе Leica DM 1000 (Германия) с камерой Leica ICC50 HD (Германия).

Использованные реактивы. Альциановый синий (8GX), инсулиноподобный фактор роста I типа (IGF-1), сыворотка козья, трансформирующий фактор роста β1, тринитрофенол (для приготовления жидкости Буэна, 1.3%), тритон X-100 (Sigma-Aldrich, США); ацетон, ксилол (орто) (ЧДА), перекись водорода (3%), хлороформ (ХЧ) (Россия); бычий сывороточный альбумин (Santa Cruz, США); гематоксилин Майера, парафиновая среда (Гистомикс), формалин (для приготовления жидкости Буэна, 40%), эозин (1%-ный спиртовой раствор) (БиоВитрум, Россия); глютамин, коллагеназа II типа (Clostridium histolyticum, 315 ед/мг), пенициллин-стрептомицин, среда DMEM (содержание глюкозы 4.5 г/л), раствор трипсина–ЭДТА, трипановый синий, фактор роста фибробластов (ООО НПП “ПанЭко”, Россия); диаминобензидин (Dako, Дания); канадский бальзам (Merck, Германия); козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (ab205718), моноклональные кроличьи антитела к CD31/PECAM-1 (ab182981) (Abcam, Великобритания); комплект ателоколлагена свиньи I типа с буферным раствором (80 мг/мл, ИМТЕК, Россия); медицинский клей БФ-6 (МПЗ, Россия); новокаин (ОАО “Дальхимфарм”, Россия); поликлональные кроличьи антитела к PCNA (PA5-27214, Invitrogen, США); фосфатно-солевой буфер (рН 7.4, ЭКОсервис, Россия); шовный материал (Monocryl poliglecaprone 25, Ethicon, США−Бельгия); эмбриональная телячья сыворотка (Biosera, Франция); этанол медицинский (95%, ЗАО “РФК”, Россия); эфир для наркоза (Химмед, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты исследований in vitro. При первичной изоляции клеток из хрящевой ткани животных с помощью фермента коллагеназы общее их количество было невелико (~775 тыс.), что, вероятно, объясняется возрастом доноров. Выход живых клеток при описанном способе изоляции составил 86.4%. Клетки нулевого пассажа имели характерную для хондроцитов кубическую форму и зернистую цитоплазму, образовывали плотный монослой на 7 сут культивирования. Жизнеспособность клеток 2-го пассажа, которые использовали в эксперименте, до смешивания с коллагеном составляла 99.9%.

Состояние клеток в составе коллагеновой конструкции через 1 ч после печати, в течение которого она находилась в питательной среде в СО₂-инкубаторе, представлено на рис. 1: коллаген окрашен в розовый цвет, клетки имеют базофильную окраску. Распределение клеток по объему скаффолда неравномерно. Клетки концентрировались большей частью у воздушных пузырей внутри конструкции и вблизи свободных поверхностей скаффолда. Через 1 сут нахождения в инкубаторе и в следующие несколько дней наблюдали массовую миграцию клеток из коллагеновых каркасов и прикрепление их ко дну чашек (рис. 2). В дальнейшем ее темпы снижались. Для того, чтобы предотвратить истощение питательной среды клетками, мигрировавшими из коллагеновых конструкций, скаффолды были перенесены в новые чашки Петри.

Рис. 1.

Распределение хондроцитов в коллагеновых конструкциях через 1 ч после печати. Окрашивание гематоксилином и эозином. Увел. об.: 2.5×.

Рис. 2.

Миграция хондроцитов из коллагеновых каркасов на дно чашек Петри через 1 сут после печати. Фазовый контраст. Увел. об.: 10×.

Со второй недели наблюдали уменьшение размеров, деформацию и, в некоторых случаях, частичное разрушение скаффолдов. На рис. 3а представлена микрофотография срезов разных каркасов через 14 сут после печати. Здесь видна неравномерная окраска коллагена, присутствуют более светлые (рыхлые) и темные (плотные) участки. Вероятно, плотность коллагена изменилась вследствие разрушения, а также действия клеточных протеолитических ферментов. В более плотных участках воздушные пузыри отсутствовали. Клетки сосредоточены в более рыхлых участках (рис. 3б). Много клеток располагалось на поверхности конструкций (рис. 3в). PCNA-положительная реакция ядер наблюдалась только в отдельных клетках (рис. 3г), что, на наш взгляд, свидетельствует о том, что основная часть клеток находилась в состоянии покоя. В следующие 14 сут большая часть клеток, заключенных в коллаген, погибла.

Рис. 3.

Хондроциты в составе тканеинженерных коллагеновых конструкций через 14 сут после печати. а–в – Окрашивание гематоксилином и эозином, г – иммуноокрашивание на PCNA. Увел. об.: а – 2.5×, б – 20×, в – 10×, г – 40×.

На срезах, сделанных через 28 сут после печати, можно видеть, что конструкции уменьшились в размерах и деформировались (рис. 4а), присутствовал клеточный детрит (рис. 4б). На микрофотографиях отчетливо видно, что через 4 нед. в коллагене сохранились только отдельные живые клетки (рис. 4в, г).

Рис. 4.

Коллагеновые конструкции через 28 сут после печати. Окрашивание гематоксилином и эозином. Стрелками показаны живые клетки; звездочки – клеточный детрит. Увел. об.: а – 2.5×, б – 10×, в, г – 40×.

Результаты исследований in vivo. Гистологическое исследование показало, что через 2 нед. в отдельных участках зоны введения имплантата животным присутствовал клеточный детрит, состоявший из фрагментов каркаса, погибших полиморфноядерных лейкоцитов и некротизированных подкожных мышечных волокон (рис. 5а, б). Вокруг скаффолда формировалась капсула из соединительной ткани, которая прорастала в коллаген, разделяя его на отдельные фрагменты (рис. 6). Вокруг кровеносных сосудов располагались макрофаги, по-видимому, вовлеченные в процесс рассасывания органического каркаса, и гранулемы инородных тел (рис. 7). Гранулематозные узелки, окруженные кровеносными сосудами, содержали большое количество клеточных элементов, концентрически располагавшихся вокруг фрагментов деградирующего матрикса. При иммуногистохимическом окрашивании на CD-31 в зонах рассасывания скаффолда выявлялись многочисленные формирующиеся мелкие кровеносные сосуды (рис. 8). Положительная реакция ядер на PCNA наблюдалась в клетках соединительной ткани, эндотелии сосудов и в клеточных элементах гранулем (рис. 9). В окружающей соединительной ткани отмечалось присутствие клеточных элементов с округлыми ядрами и узким ободком цитоплазмы (возможно, хондроцитов). Таким образом, результаты патоморфологического исследования свидетельствуют о том, что через 2 нед. после имплантации скаффолда под кожу крыс наблюдается гранулематозное воспаление с разрушением органического матрикса макрофагами и гигантскими клетками.

Рис. 5.

Место введения скаффолда через 2 нед. после его имплантации под кожу холки крысы. Звездочками показаны области с признаками воспалительной реакции в зоне имплантации. Окрашивание гематоксилином и эозином. Увел. об.: а – 2.5, б – 5×.

Рис. 6.

Формирование соединительнотканной капсулы на границе с подкожной жировой клетчаткой (отмечено стрелками). Окрашивание гематоксилином и эозином. Увел. об.: 2.5×.

Рис. 7.

Зона рассасывания скаффолда. а – Макрофаги и гранулемы инородных тел в зоне элиминации имплантата; б – фрагмент а при большем увеличении. СК – Скаффолд, ГИТ – гранулема инородных тел, стрелками показаны макрофаги. Окрашивание гематоксилином и эозином. Увел. об.: а – 20×, б – 40×.

Рис. 8.

Васкуляризация зоны рассасывания скаффолда. а – Ангиогенез на границе скаффолда, б – ангиогенез в области формирования гранулем инородных тел (ГИТ) с многоядерными клетками рассасывания. Стрелками показана иммуногистохимическая реакция эндотелия сосудов с антителами к CD31. Увел. об.: 20×.

Рис. 9.

Иммуногистохимическая реакция ядер клеток с антителами к PCNA в зоне рассасывания скаффолда. Увел. об.: 20×.

Через 6 нед. в зоне введения имплантата под эпидермисом сформировалась соединительная ткань (рис. 10а), в которой, рядом с кровеносными сосудами, обнаруживались макрофаги и группы мелких клеток с округлыми ядрами, по морфологическим критериям соответствующие молодым хондроцитам (рис. 10б, в). Цитоплазма этих клеток дала положительную реакцию на гликозаминогликаны при окрашивании альциановым синим (рис. 10г). В то же время данные свидетельства формирования хрящевой ткани можно считать косвенными и требующими дальнейшего подтверждения.

Рис. 10.

Зона имплантации скаффолда под кожу холки крысы через 6 недель. а – В верхнем левом углу виден фрагмент шовной нити в месте имплантации; б, в – в окружающих тканях видны группы мелких клеток с округлыми ядрами, по морфологическим критериям соответствующие молодым хондроцитам, г – группа клеток с положительной реакцией на гликозаминогликаны в подкожной соединительной ткани крысы (показаны стрелками) в зоне рассасывания органического матрикса. а–в – Окрашивание гематоксилином и эозином, г – окрашивание альциановым синим. Увел. об.: а – 10×, б–г – 40×.

ОБСУЖДЕНИЕ

Трехмерная (3D) культура хондроцитов считается предпочтительной для регенерации хрящевой ткани (Okubo et al., 2019). Сочетание 3D условий культивирования с добавлением факторов роста позволяет сохранить специфический фенотип хондроцитов (Nguyen et al., 2017; Okubo et al., 2019), обеспечивая синтез и накопление молекул внеклеточного матрикса – протеогликанов и коллагенов, которые могут быть потеряны в условиях in vitro (Grogan et al., 2003; Бекетов и др., 2019). Трехмерные условия культивирования создаются, в основном, с помощью каркасов из различных материалов, которые служат для прикрепления, жизнедеятельности и пролиферации клеточных элементов. Жизнеспособность клеток в искусственных тканях зависит от того, насколько эффективно они снабжаются кислородом и питательными веществами. Ограниченный поток метаболитов в тканевых конструкциях – одна из проблем всей тканевой инженерии (Brown et al., 2007). В статических условиях культивирования основным способом переноса веществ в гидрогелях является диффузия. Предполагается, что кислород постоянно поступает в периферические зоны тканеинженерной конструкции: он растворяется в питательной среде, при этом его концентрация пропорциональна парциальному давлению газа и коэффициенту растворимости (Brown et al., 2007). Поскольку в искусственных тканях диффузия кислорода часто происходит медленнее, чем его потребление, кислород является лимитирующим фактором в выживании клеток в конструкциях толще 100–200 мкм (Malda et al., 2004). На доступность кислорода кроме длины пути диффузии влияет плотность клеточной массы, так как способность кислорода диффундировать через клетки значительно меньше, чем через воду (Radisic et al., 2005; Brown et al., 2007). В каркасах с достаточно большой объемной долей клеток затрудненная диффузия метаболитов будет дополняться их повышенным потреблением. Поэтому в статических клеточных конструкциях, где питательные вещества распространяются только путем диффузии, неизбежно возникают области, в которых преобладает пролиферация клеток, – это наружная поверхность скаффолда (Lewis et al., 2005).

Результаты, полученные в нашем исследовании, являются хорошей иллюстрацией всему вышесказанному. Уже через 1 ч нахождения тканеинженерных конструкций в статических условиях инкубатора произошло перемещение клеток к наружным поверхностям скаффолда и воздушным пузырям. В течение следующих нескольких дней наблюдали массовый выход клеток за пределы коллагеновой конструкции и прикрепление их ко дну культуральной посуды. О гетерогенном распределении клеток внутри тканеинженерных каркасов сообщают и другие авторы. Так, Левис с соавторами (Lewis et al., 2005) наблюдали увеличение плотности бычьих хондроцитов в периферических слоях пористого каркаса из терефталата/полибутилентерефталата в течение первых 14 сут. культивирования. В литературе также сообщается (Radisic et al., 2005), что концентрация кислорода и жизнеспособность сердечных миоцитов крыс снижались линейно и плотность живых клеток уменьшалась экспоненциально с ростом расстояния от поверхности конструкции (коллагеновая губка диаметром 6 мм и толщиной 1.5 мм).

Хрящ – аваскулярная ткань и относительно медленная диффузия веществ в глубину конструкции не считается преобладающей проблемой в инженерии хряща (Grogan et al., 2003). Однако в искусственных каркасах используется высокая плотность клеток для получения более “функциональной” ткани, так как она имеет решающее значение для установления межклеточных контактов и осуществления тканевых функций (Radisic et al., 2005; Brown et al., 2007; Cigan et al., 2016). При биопечати высокая плотность клеток необходима также для достижения хорошей выживаемости после печати (Nguyen et al., 2017). Таким образом, в диффузно-ограниченных конструкциях возникает противоречие между высокой плотностью клеток и достаточным содержанием кислорода. Это становится особенно важным в свете выводов, сделанных Окубо с соавторами (Okubo et al., 2019). По их мнению, эффективность хондрогенеза напрямую зависела от плотности клеток в скаффолдах (чем выше, тем лучше) и фактор высокой жизнеспособности клеток являлся более важным с точки зрения формирования ткани, чем попытки стимулировать хондрогенез.

В соответствии с представленными данными при культивировании скаффолда в течение 4 нед. произошло его частичное разрушение и сжатие. Одной из причин, вызвавшей разрушение коллагена, могло быть выделение клетками протеолитических ферментов (Zhang et al., 2019). Деформация и сжатие конструкций из натуральных материалов, например, внеклеточного матрикса хряща или коллагена вследствие жизнедеятельности клеток также описаны в литературе (Liu et al., 2008; Rowland et al., 2013). Клеточно-опосредованное сжатие пористого материала может уменьшить диффузию кислорода и питательных веществ к центру, и, как следствие, объем, доступный для клеточной пролиферации (Rowland et al., 2013), что также не способствует формированию полноценной ткани. Дробник с соавторами (Drobnik et al., 2019) исследовали долговечность трехмерных губчатых пористых каркасов на основе коллагена I типа с нервными эмбриональными крысиными клетками или без клеток после имплантации в головной мозг крысам. Было показано, что имплантаты оставались структурно не поврежденными в течение 4 нед., но индуцировали гранулематозное воспаление, включающее накопление многоядерных макрофагов, мононуклеарных воспалительных клеток и образование кровеносных сосудов. Авторы предположили, что иммунные реакции, включая воспаление, окислительный стресс и низкий уровень трофических факторов могут вызывать гибель клеток внутри инженерных конструкций после имплантации. Мы наблюдали сходную картину воспаления после подкожной имплантации коллагеновых каркасов крысам. Но в нашем исследовании каркасы полностью рассосались в течение 4–6 нед., вероятно, по причине того, что состояли из немодифицированного коллагена. Обнаружение кровеносных сосудов, прорастающих в каркас, является положительным фактором, так как васкуляризация считается критически важным событием в тканевой инженерии (Murphy et al., 2020). Несмотря на то, что жизнеспособные клетки, по морфологическим критериям соответствующие молодым хондроцитам, сохранились, полноценного формирования хрящевой ткани не произошло. Вероятно, это также связано как с быстрым рассасыванием коллагенового скаффолда, так и небольшим количеством выживших клеток. Оставшиеся клетки не успели сформировать собственный матрикс, характерный для хрящевой ткани.

Для клинического применения трансплантаты должны быть объемными (не плоскими) и содержать физиологическую плотность метаболически активных дифференцированных клеток (Radisic et al., 2005). В тканеинженерных конструкциях, толщина которых составляет несколько мм, снабжение клеток питательными веществами и особенно кислородом является критической проблемой. Ограничение диффузии питательных веществ приводит к пространственно неоднородным свойствам искусственной ткани (Bian et al., 2009). Как показывает анализ литературы, более высокая жизнеспособность клеток достигается в менее плотных гелях, в которых лучше осуществляется диффузия (Nguyen et al., 2017; Okubo et al., 2019). Однако в трехмерной биопечати плотность материала должна обеспечивать возможность получения стабильной конструкции заданной формы, иначе все преимущества технологии будут сведены к нулю. Это противоречие может быть разрешено с помощью включения дополнительных каналов и пор, например, из вспомогательных материалов (sacrificial hydrogel), которые удаляются из готовых изделий (Levato et al., 2017), или с использованием динамических систем культивирования – биореакторов. В то же время существует мнение, что перфузионные системы могут не подходить для получения хрящевой ткани, так как способны удалять специфические метаболиты (коллаген) и приводить к апоптозу клеток (Grogan et al., 2003). Результаты нашего исследования показали, что собственной пористости использованного 4%-ного коллагенового геля было недостаточно для снабжения инкорпорированных клеток кислородом и питательными веществами и сохранения их жизнеспособности в течение длительного времени в условиях in vitro. Вторым недостатком материала была его быстрая (в течение месяца) деградация в организме животных. Это в свою очередь не позволило необходимое время поддерживать условия для формирования хрящевой ткани в месте имплантации. Таким образом, в дальнейших исследованиях целесообразно использовать модифицированные варианты коллагена или другие полимеры, в том числе синтетические, характеризующиеся более длительным сроком деградации.