1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Цитология
  4. T. 63, № 6, 2021

Цитология, 2021, T. 63, № 6, стр. 605-610

Кариотип и нуклеотидная последовательность гена COI Chironomus sororius Wülker, 1973 (Diptera, Chironomidae) из дельты р. Печора

В. В. Большаков 1, *, Е. Б. Фефилова 2, Е. А. Мовергоз 1

1 Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН
152742 пос. Борок, Россия

2 Институт биологии Коми научного центра УрО РАН
167982 Сыктывкар, Россия

* E-mail: victorb@ibiw.ru

Поступила в редакцию 22.06.2021
После доработки 13.07.2021
Принята к публикации 19.07.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Впервые в Европейской части России и за Северным полярным кругом, в дельте р. Печора обнаружена личинка комара-звонца Chironomus sororius Wülker 1973. В результате анализа кариотипа обнаружено 9 инверсионных вариантов плеч хромосом: sorA1, sorB2, sorB3, sorC2, sorD1, sorE1, sorF1, sorF2 и sorG1. B-хромосом не обнаружено. Получена нуклеотидная последовательность участка гена COI длиной 584 нуклеотида. Байесовский анализ показал, что вид относится к группе видов Chironomus aberratus, и наиболее близок с Ch. sororius из Западной Сибири (г. Новосибирск). Минимальные генетические дистанции (p-distance) получены также при сравнении с Ch. sororius (1%) из г. Новосибирск, что значительно меньше предложенного порога (3%) разграничивающего виды Chironomus. При анализе двух последовательностей COI из GenBank неидентифицированных видов Chironomus из Канады, генетические дистанции оказались выше порогового значения (3.8 и 7.8%), и, вероятно, они также относятся к данной группе видов.

Ключевые слова: Diptera, Chironomidae, Chironomus sororius, COI, ДНК-баркодинг, кариотип, р. Печора

Вид Chironomus sororius Wülker 1973 был описан из популяций Шварцвальда в Германии и южной Финляндии (Wülker, 1973), позднее был обнаружен в водоемах Швеции, Чехословакии и Норвегии (Wülker, 1991). В России вид ранее был найден в Сибири: г. Новосибирск (недалеко от Академгородка, СНТ “Кристалл” и “Цитолог”); в Республике Алтай, вероятно, река Шебелик, около города Шебалино (в источнике (Kiknadze et al., 2016) указана р. Шарлик, но она находится далеко от указанного города, и ее длина всего 18 км); р. Большой Ильгумень, близ г. Онгудай; оз. Озёрское, Усть-Канский р-н; р. Енисей близ г. Кызыл. Вид относится к группе видов Chironomus aberratus, в которую входят: Ch. fraternus Wülker 1991, Ch. beljaninae Wülker 1991, Ch. jonmartini Lindeberg 1979, Ch. aberratus Keyl 1961 и Ch. sororius. Группа Chironomus aberratus, остается до сих пор слабо изученной (Wülker, 1973, 1991; Ракишева и др., 2001; Kiknadze et al., 2016; Petrova, Zhirov, 2017).

Личинка Ch. sororius была обнаружена нами в дельте р. Печора в одной пробе с Ch. sp. Ya3 Kiknadze, Istomina et Salova 1996 (Bolshakov, Fefilova, 2020), и так же является первой находкой для Европейской части России. При наличии лишь одной особи и ограниченного количества материала первоначально определение вида вызвало у нас некоторые трудности. Ранее (2008 и 2010 гг.) при изучении водоемов в устьевом районе р. Печора (Большой и Малый Гусинец) только по морфологическим признакам до вида были определены 33 вида комаров-звонцов, из которых к роду Chironomus относились: Ch. dorsalis Meigen 1818, Ch. agilis Shobanov, Djomin 1988, Ch. magnificus Shobanov 2000, Ch. albimaculatus Shobanov, Wülker, Kiknadze 1991, при этом часть диагностирована только до рода (Черевичко и др., 2011). Известно, что у хирономид, особенно в роде Chironomus, видовая идентификация по морфологическим признакам личинки сильно затруднена, а порой и невозможна (Кикнадзе и др., 1996). Метод выведения до имаго в условиях экспедиции недоступен. Другим, удобным и относительно точным, методом для установления видовой принадлежности у Chironomus является цитогенетический анализ. Однако и при его использовании иногда возникают трудности, особенно если кариотипы принадлежат близкородственным или слабо изученным видам, в этом случае только высокое качество кариологического препарата позволяет увидеть мельчайшие различия между кариотипами. В нашем случае качество полученного кариологического препарата не позволило нам точно диагностировать вид выращенной личинки, мы лишь установили, что она относится к группе видов Chironomus aberratus. Поэтому для дальнейшего уточнения ее таксономического статуса мы выбрали метод баркодинга, основным преимуществом которого является возможность использования на всех стадиях развития организма. Используя стандартный набор праймеров для амплификации фрагмента ДНК митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы С (COI) (Folmer et al., 1994; Hebert et al., 2003) нами была получена видоспецифичная нуклеотидная последовательность ДНК. К сожалению, в базах данных генетической информации GenBank и BOLD содержится только одна запись о нуклеотидной последовательности COI Ch. sororius – AF192198.1. Сравнив полученную нами последовательность с другими последовательностями, отобранными для анализа, мы установили, что обнаруженная личинка относится к группе видов Chironomus aberratus, а наиболее близким видом является Ch. sororius, для которого не было превышено пороговое значение (3%), разграничивающее виды рода Chironomus (Proulx et al., 2013). По другим 4-м видам группы Chironomus aberratus никакой информации в базах данных нет.

В настоящей статье приводится описание кариотипа и результаты анализа нуклеотидной последовательности участка гена COI Ch. sororius из дельты р. Печора.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Материалом для работы послужила одна личинка Chironomus sororius, найденная в августе 2016 г. в водоеме на острове в протоке Большой Гусинец дельты реки Печора одновременно с Ch. sp. Ya3 Kiknadze, Istomina et Salova 1996 (Bolshakov, Fefilova, 2020). Координаты точки сбора: N 68°10′282″; E 53°39′368″. Водоем представлял собой небольшое озерко, зарастающее осокой водной – Carex aquatilis Wahlend, и сообщающееся с рекой в период половодья, площадью около 200 × 20 м2, глубиной около 1 м. В период сбора материала температура воды составляла 17.5°C, pH 8.04. Проба донного субстрата (смесь ила с песком) из водоема хранилась без фиксации, герметично упакованная в пакет, в холодильнике при 4°С до января 2017 г. Обнаруженные при разборе пробы личинки (длиной 3–5 мм) доращивались в лаборатории на искусственном субстрате, как было описано ранее (Bolshakov, 2015; Bolshakov, Fefilova, 2020), в результате для анализа оказались пригодны несколько личинок, в их числе и личинка Chironomus sororius.

Изготовление давленных препаратов политенных хромосом проводили по стандартной этилорсеиновой методике (Демин, 1989). Фотографирование хромосом проводили на микроскопе “Микромед-6C” (“ЛОМО”, Санкт-Петербург), оснащенным видеоокуляром “ToupCam5.1” (Китай) и объективами с увеличением 40× и 100×. Для видовой идентификации по кариотипу использовали цитофотокарты (Keyl, 1962; Dévai et al., 1989; Kiknadze et al., 2016).

Из личинки, фиксированной в этаноле (95%), выделяли ДНК с помощью набора реагентов на магнитных частицах “М-сорб-ООМ” (Синтол, Москва) согласно протоколу производителя. Для баркодинга использовали регион гена COI (Folmer et al., 1994): праймеры LCO1490: 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' и HCO2198: 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3') (Евроген, Москва).

Реакцию ПЦР проводили в объеме 25 мкл (1× буфер, 1.5 мкМ MgCl2, 0.5 мМ каждого из праймеров, 0.2 мкМ каждого нуклеотида, 1 μМ образца ДНК, 1 а.е. Taq полимеразы (Евроген, Москва)). Цикл ПЦР: 94°С – 3 мин, 30 циклов (94°С – 15 с, 50°С – 45 с, 72°С – 60 с), 72°С – 8 мин. Очищали ДНК этанолом и 3М ацетатом аммония, и далее секвенировали в обоих направлениях на секвенаторе Applied Biosystems 3500 (Thermo Scientific, США).

Для выравнивания полученных последовательностей ДНК использовали алгоритм MUSCLE из пакета программ MEGA6 (Tamura et al., 2013). Генетические дистанции (p-distance) рассчитывали также в программе MEGA6. Построение филогенетических деревьев по методу Байеса проводили в программе MrBayes v.3.2.6 (Ronquist, Huelsenbeck, 2003; Ronquist et al., 2012) с параметрами, предложенными в работе Кармокова (Karmokov, 2019; Bolshakov, Prokin, 2021). Визуализацию и редактирование полученных филогенетических деревьев осуществляли в программе FigTree v.1.4.3 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).

Для филогенетического анализа использовали последовательности ДНК из базы данных GenBank. Однако последовательности представителей группы Chironomus aberratus, кроме Ch. sororius – AF192198.1, в свободном доступе отсутствуют. Кроме этого, в GenBank были найдены последовательности неопределенных до вида хирономид из водоемов Канады, относящиеся, вероятно, к данной группе: KR670353.1 (Chironomus sp. BOLD-2016 voucher CHU06-COL-371) и KR963693.1 (Chironomus sp. BOLD-2016 voucher BIOUG18205-D04).

Номера доступа к использованным последовательностям в базах дaнных: Chironomus acutiventris Wülker, Ryser, Scholl 1983 – AF192200.1, Ch. annularius Meigen, 1818 – AF192189.1, Ch. aprilinus Meigen, 1830 – KC250746.1, Ch. balatonicus Devai, Wülker, Scholl, 1983 – JN016826.1, Ch. bernensis Wülker et Klötzli, 1973 – AF192188.1, Ch. borokensis Kerkis, Filippova, Schobanov, Gunderina, Kiknadze, 1988 – AB740261, Ch. cingulatus Meigen, 1830 – AF192191.1, Ch. commutatus Keyl, 1960 – AF192187.1, Ch. curabilis Belyanina, Sigareva, Loginova, 1990 – JN016810.1, Ch. dilutus Shobanov, Kiknadze, Butler, 1999 – KF278335.1, Ch. entis Shobanov, 1989 – KM571024.1, Ch. heterodentatus Konstantinov, 1956 – AF192199.1, Ch. heteropilicornis Wülker, 1996 – MK795772.1, Ch. luridus Strenzke, 1959 – AF192203.1, Ch. maturus Johannsen, 1908 – DQ648204.1, Ch. melanescens Keyl, 1961 – MG145351.1, Ch. nipponensis Tokunaga, 1940 – LC096172.1, Ch. novosibiricus Kiknadze, Siirin, Kerkis, 1993 – AF192197.1, Ch. nuditarsis Keyl, 1961 – KY225345.1, Ch. obtusidens Goetghebuer, 1921 – CHMNO207-15 (http://www.boldsystems.org/index. php/Public_RecordView?processid=CHMNO207-15); Ch. piger Strenzke, 1959 – AF192202.1, Ch. pilicornis Fabricius, 1787 – BSCHI736-17, Ch. plumosus Linnaeus, 1758 – KF278217.1, Ch. riparius Meigen, 1804 – KR756187.1, Ch. sokolovae Istomina, Kiknadze, Siirin, 1999 – MW471100, Ch. tentans Fabricius, 1805 – AF110157.1, Ch. tuvanicus Kiknadze, Siirin et Wulker, 1993 – AF192196.1, Ch. whitseli Sublette, Sublette, 1974 – KR683438.1. В качестве вида внешней группы использовали Drosophila melanogaster Meigen, 1830 – HQ551913.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кариотип Ch. sororius из дельты р. Печора. Диплоидный набор 2n = 8, комбинация хромосомных плеч AB, CD, EF и G – соответствует цитокомплексу “thummi”. Хромосомы AB и CD – метацентрические, EF – субметацентрческая, G – телоцентрическая, в нашем случае гомологи всегда не спарены (рис. 1.). B-хромосомы отсутствуют. Ядрышко и два кольца Бальбиани расположены в плече G. Также одно кольцо Бальбиани расположено в плече B. Кариотип Ch. sororius сходен с кариотипом Ch. aberratus (Wülker, 1973), последовательности в плечах A, D, E и F идентичны, отличается фиксированными инверсиями в плечах B, C и G. Кроме этого, центромерные районы у Ch. sororius значительно крупнее Ch. aberratus, но меньше, чем у Ch. melanotus Keyl 1961.

Рис. 1.

Кариотип Ch. sororius из дельты р. Печора. Стрелки указывают на центромеры, sorA1.1, sorB2.3 – сочетания инверсионных вариантов плеч хромосом, BR – кольца Бальбиани, N – ядрышко.

В плече A обнаружена одна последовательность sorA1=abeA1 (Keyl, 1962; Wülker, 1973; Kiknadze et al., 2016).

sorA1 1a-2c 10a-12c 4a-9e 2d-3i 13a-19f C.

В плече B две последовательности sorB2 и sorB3, на настоящий момент не картированы.

В плече C последовательность sorC2=abeC1 (Kiknadze et al., 2016).

sorC2 1a-6b 11c-8a 15e-11d 6gh 17a-16a 7d-a 6f-c 17b-22g C.

В плече D последовательность sorD1=abeD1 (Wülker, 1973; Kiknadze et al., 2016).

sorD1 1a-3g 11a-18f 7d-4a 10e-7e 18g-24g C.

В плече E одна последовательность sorE1=abeE1 (Wülker, 1973; Kiknadze et al., 2016).

sorE1 1a-3e 5a-10b 4h-3f 10c-13g C.

В плече F две последовательности sorF1=abeF1 и sorF2 (Wülker, 1973; Kiknadze et al., 2016).

sorF1 1a-10d 17d-11a 18a-23f C.

sorF2 1a-2f 8f-3a 9a-10d 17d-11a 18a-23f C.

В плече G одна последовательность sorG1, на настоящий момент не картирована.

Первоначально, при идентификации вида как Ch. sororius у нас возникли сложности, обусловленные низким качеством цитологического препарата и высоким сходством последовательностей дисков политенных хромосом у близкородственных видов. В результате цитогенетического анализа было обнаружено 9 последовательностей дисков гомологичных (политенных) хромосом: sorA1=abeA1, sorB2, sorB3, sorC2=abeC1, sorD1=abeD1, sorE1=abeE1, sorF1=abeF1, sorF2 и sorG1. Несмотря на суровые условия обитания и удаленность от мест других находок, значительных особенностей в кариотипе, а также новых последовательностей не обнаружено.

К сожалению, количества изученных личинок недостаточно для оценки цитогенетической структуры популяции.

Молекулярно-генетический анализ участка гена COI и филогенетический анализ. В результате молекулярно-генетического анализа был прочитан участок гена COI длиной 584 нуклеотида, и размещен в базе данных GenBank под номером MZ324811. Минимальные генетические дистанции (p-distance), рассчитанные в программе MEGA6, указывают на высокое сходство изучаемой нами личинки из дельты р. Печора с видом Ch. sororius из г. Новосибирск – 1%, что значительно выше 3%-ного порога, принятого при разграничении видов Chironomus (Polukonova et al., 2009; Proulx et al., 2013; Karmokov, 2019; Bolshakov, Prokin, 2021). Проведенный на основании сравнения последовательностей COI филогенетический анализ по методу Байеса (рис. 2) показывает объединение родственных видов в кластеры (группы): aberratus, riihimakiensis, lacunarius, plumosus, obtusidens, и piger, ранее выделенные по морфологическим и цитогенетическим признакам. Обнаруженная нами личинка с высоким уровнем достоверности относится к группе Chironomus aberratus и является видом Ch. sororius (99%).

Рис. 2.

Филогенетическое дерево Chironomus полученное на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов COI, построенное по методу Байеса. Числа в узлах показывают уровень поддержки.

При анализе двух последовательностей участка гена COI из GenBank неидентифицированных видов Chironomus (из Канады) генетические дистанции оказались выше 3% порогового значения, и составили 3.8% и 7.8% для Chironomus sp. (KR963693.1) и Chironomus sp. (KR670353.1) соответственно; высокие значения prob. в узлах веток на филогенетическом дереве указывают, что эти последовательности, вероятно, также относятся к группе видов Chironomus aberratus.

Таким образом, при неоднозначной интерпретации данных морфологического и цитогенетического анализа, мы успешно применили метод баркодинга фрагмента гена COI, для идентификации единственной найденной личинки Ch. sororius из устья р. Печора, которая оказалась первой находкой для Европейской части России.

Список литературы

  1. Демин С.Ю. 1989. Изменчивость степени конденсированности политенных хромосом в клетках разных органов личинок Chironomus plumosus из природы. Автореф. дис. … канд. биол. наук. Л. 25 с. (Demin S.Yu. 1989. The variability of the degree of condensation of polytene chromosomes in the cells of various organs of larvae Chironomus plumosus of nature]. Avtoref. kand. dis. Leningrad. 25 p.)

  2. Кикнадзе И.И., Истомина А.Г., Гундерина Л.И., Салова Т.А., Айманова К.Г., Саввинов Д.Д. 1996. Кариофонды хирономид криолитозоны Якутии. Триба Chironomini. Новосибирск: Наука. 166 с. (Kiknadze I.I., Istomina A.G., Gunderina L.I., Salova T.A., Aymanova K.G., Savvinov D.D. 1996. Kariofondy khironomid kriolitozony Yakutii. Triba Chironomini. Novosibirsk: Nauka. 166 p.)

  3. Ракишева А.Ж., Петрова Н.А., Михайлова П.В. 2001. Морфология личинки и особенности кариотипа Chironomus jonmartini из краевой южной популяции (Казахстан). Энтомологическое обозрение. Т. 80. № 2. С. 512. (Rakisheva A.Zh., Petrova N.A., Mikhaylova P.V. 2001. Morfologiya lichinki i osobennosti kariotipa Chironomus jonmartini iz kraevoy yuzhnoy populyatsii (Kazakhstan). Entomologicheskoe Obozrenie. V. 80. № 2. P. 512.)

  4. Черевичко А.В., Мельник М.М., Прокин А.А., Глотов А.С. 2011. Современное состояние зоопланктона и макрозообентоса низовий р. Печора (Ненецкий АО). Вода: химия и экология. № 9. С. 53. (Cherevichko A.V., Mel’nik M.M., Prokin A.A., Glotov A.S. 2011. Sovremennoe sostoyanie zooplanktona i makrozoobentosa nizoviy r. Pechora (Nenetskiy AO). Voda: khimiya i ekologiya. № 9. P. 53.)

  5. Bolshakov V.V. 2015. On techniques of maintenance of Chironomus dilutus larvae (Diptera, Chironomidae) on Bacto agar. Entomol. Rev. V. 95. P. 811.

  6. Bolshakov V.V., Fefilova E.B. 2020. Karyotype characteristics and the composition of hemoglobins in Chironomus sp. Ya3 (Diptera, Chironomidae) from the Pechora delta. Entomol. Rev. V. 100. P. 1. https://doi.org/10.1134/S0013873820010017

  7. Bolshakov V.V., Prokin A.A. 2021. Karyotype and COI sequences of Chironomus sokolovae Istomina, Kiknadze et Siirin, 1999 (Diptera, Chironomidae) from the bay of Orkhon River, Mongolia. Comp. Cytogen. V. 15. P. 149. https://doi.org/10.3897/compcytogen.v15.i2.66549

  8. Dévai Gy., Miskolczi M., Wülker W. 1989. Standardization of chromosome arms B, C and D in Chironomus (Diptera, Chironomidae). Acta Biologica Debricina. Supplementum Oecologica Hungarica. V. 2. P. 79.

  9. Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R. 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology. V. 3. P. 294.

  10. Hebert P., Cywinska A., Shelley L. Ball S.T., de Waard J.R. 2003. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society London B: Biological Sciences. V. 270. P. 313. https://doi.org/10.1098/rspb.2002.2218

  11. Karmokov M.K. 2019. Karyotype characteristics, chromosomal polymorphism and gene COI sequences of Chironomus heteropilicornis Wülker, 1996 (Diptera, Chironomidae) from the South Caucasus. Comparative Cytogenetics. V. 13. P. 339. https://doi.org/10.3897/CompCytogen.v13i4.35572

  12. Keyl H.-G. 1962. Chromosomenevolution bei Chironomus. II. Chromosomenumbauten und phylogenetische Beziehungen der Arten. Chromosoma. V. 13. P. 464.https://doi.org/10.1007/BF00327342

  13. Kiknadze I.I., Istomina A.G., Golygina V.V., Gunderina L.I. 2016. Karyotypes of Palearctic and Holarctic species of the genus Chironomus [Electronic resource] / [Russian Academy of Sciences, Siberian Branch, Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics. Novosibirsk: Academic Publishing House “GEO”. 489 p. https://elibrary.ru/item.asp?id=27246690

  14. Petrova N.A., Zhirov S.V. 2017. Karyotype characteristics of Chironomus fraternus Wülker and Ch. beljaninae Wülker (Diptera, Chironomidae) from Northern Russia. Entomol. Rev. V. 97. P. 730. https://doi.org/10.1134/S0013873817060033

  15. Polukonova N.V., Djomin A.G., Mugue N.S., Shaikevich A.E. 2009. Comparison of Chironomus usenicus and Chironomus curabilis with species of the group plumosus (Diptera) inferred from the mitochondrial DNA Gene COI and by the polytene chromosomes banding pattern. Russ. J. Genet. V. 45. P. 899. https://doi.org/10.1134/S102279540908002X

  16. Ronquist F., Huelsenbeck J.P. 2003. MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics. V. 19. P. 1572.

  17. Ronquist F., Teslenko M., van der Mark P., Ayres D.L., Darling A., Hohna S., Larget B., Liu L., Suchard M.A., Huelsenbeck J.P. 2012. MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic in-ference and model choice across a large model space. Systematic Biology. V. 61. P. 539. https://doi.org/10.1093/sysbio/sys029

  18. Proulx I., Martin J., Carew M., Hare L. 2013. Using various lines of evidence to identify Chironomus species (Diptera: Chironomidae) in eastern Canadian lakes. Zootaxa. V. 3741. P. 401. https://doi.org/10.11646/zootaxa.3741.4.1

  19. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. V. 30. P. 2725. https://doi.org/10.1093/molbev/mst197

  20. Wülker W.F. 1973. Revision der Gattung Chironomus Meig. III. Europäische Arten des thummi-Komplexes. Archiv für Hydrobiologie. V. 72. P. 356.

  21. Wülker W.F. 1991. Chironomus fraternus sp. n. and C. beljaninae sp. n., sympatric sister species of the aberratus group in Fennoscandian reservoirs. Entomol. Fennica. V. 2. P. 97.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Цитология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал