Цитология, 2022, T. 64, № 1, стр. 96-102

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Животные. Все эксперименты проводили на белых крысах-самцах линии Wistar массой 180–200 г. Использовано 29 животных. Они содержались в помещении вивария (Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН) при свободном доступе к воде и пище с 12-часовым циклом ночь/день. Эксперименты с животными проводили в соответствии с рекомендациями по этике, предложенными Директивой Совета Европейских сообществ (86/609 EEC).

Приготовление срезов. Исследования проведены на тангенциальных срезах обонятельной коры головного мозга крыс-самцов толщиной 400–500 мкм. Срезы мозга включают нейроны пириформной коры, глутаматергические синапсы и проводящие нервные волокна латерального обонятельного тракта (ЛОТ). Приготовление срезов происходило следующим образом. Крыс декапитировали при помощи гильотины (Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН). Хирургическими инструментами извлекали головной мозг и помещали его на фильтровальную бумагу, покрывающую металлический столик, охлажденный до 4°C. При помощи специального резака (Митюшов и др., 1986; Мокрушин, 1997) готовили срезы обонятельной коры мозга. Кисточкой срез переносили во флакон с искусственной цереброспинальной аэрированной жидкостью (состав см. ниже) объемом 1 мл. Длительность всей процедуры приготовления среза от момента декапитации до его помещения в среду составляла 1–1.5 мин.

После помещения среза во флакон газовую атмосферу над жидкостью со срезом в течение 1 мин продувания заменяли на кислород. Флакон со срезом устанавливали в аппарат Варбурга (Германия) с частотой качаний 120 в 1 мин при температуре 37°C в месте нахождения среза до его перемещения в регистрирующую камеру электрофизиологической установки (Мокрушин, Боровиков, 2017). Искусственный церебральный раствор для поддержания жизнедеятельности срезов и последующего их замораживания имел следующий состав (мМ): 124.0 NaCl; 5.0 KCl; 2.6 CaCl₂; 1.24 KH₂PO₄; 1.2 MgSO₄; 3.0 NaHCO₃; 10.0 глюкозы; рН 7.3 при 37°С.

Определение активности NMDAR. В ответ на электрическую стимуляцию ЛОТ в нормотермических условиях внеклеточно регистрируются фокальные потенциалы (ФП), которые отражают суммарную активность нейронов пириформной коры и волокон ЛОТ. Без стимуляции ЛОТ спонтанная активность в срезах не регистрируется. ФП является многокомпонентным потенциалом и состоит из пресинаптического компонента, который отражает активность проводящих волокон ЛОТ – суммарный потенциал действия ЛОТ (ПД-ЛОТ), и постсинаптических компонентов, которые отражают активацию глутаматергических ионотропных механизмов – AMPAR и NMDAR (рис. 1). В настоящей работе изучали изменения только активности NMDAR. Эти потенциалы были идентифицированы ранее (Мокрушин, 1997; Mokrushin, Pavlinova, 2013). Выявление NMDA-компонента в ФП в нормотермических условиях производили при воздействии специфического антагониста D-APV (50 мкМ) (рис. 1).

Рис. 1.

Потенциалы, регистрируемые в нейронах срезов обонятельной коры крыс в ответ на электрическую стимуляцию латерального обонятельного тракта (ЛОТ). На потенциалах даны обозначения всех компонентов. Артефакт стимуляции отражает нанесение электрического стимулирующего импульса; пресинаптический суммарный потенциал действия (ПД-ЛОТ) – активацию проводящих волокон ЛОТ; постсинаптические компоненты: ранний AMPA-потенциал и поздний NMDA-потенциал. Проанализированы изменения только NMDA-потенциалов. Потенциалы зарегистрированы до (серая линия) и после (черная линия) криосохранения (КС) (30 сут при –10°C). Вертикальная серая стрелка – амплитуда NMDA-потенциалов в точке 8 мс от артефакта стимуляции. На вставке в увеличенном масштабе показаны амплитуды NMDA-потенциалов до и после КС. Черные штриховые горизонтальные линии – амплитуды NMDA-потенциалов до и после КС. Калибровка указана.

Измерение pH среды. Измерение рН замораживающей среды осуществляли с помощью pH-метра Seven Compact S220 (Mettler Toledo, США). Значения рН определяли с точностью до 0.1. Температуру среды со срезами до и после замораживания при регистрации NMDA-потенциалов измеряли с помощью прибора “Измеритель пид-регулятор ТРМ12” (Россия). Модификацию pH замораживающей среды и регистрацию NMDA-потенциалов до и после криосохранения проводили в параллельных экспериментах. Одновременное измерение этих параметров на срезах приводило к неконтролируемому искажению данных как pH, так и NMDA-потенциалов.

Протокол криосохранения срезов заключался в следующем. Искусственный цереброспинальный раствор с ионным составом (описан выше) приготавливали на гибридной буферной системе: карбонатный буфер (NaHCO₃), фосфатный буфер (KH₂PO₄) и Трис-HCl.

В срезах до замораживания регистрировали амплитуды NMDA-потенциалов (мкВ) стеклянными микроэлектродами, заполненными 1 M NaCl, с сопротивлением 1–5 МОм. Эти потенциалы регистрировали в ответ на одиночные электрические импульсы (ЭСУ-1, Россия) ЛОТ прямоугольной формы, длительностью 0.1 мс, интенсивностью 1–3 В и частотой 0.003 Гц при 37°С в течение 20 мин. Регистрацию проводили в проточной камере электрофизиологической установки (Мокрушин, Боровиков, 2017) с использованием усилителя (НТО, Россия). Потенциалы оцифровывали на аналого-цифровом приборе (Е 20–10, Россия) и обрабатывали с помощью компьютерной программы “Анализ электрической активности нейронов” (Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Россия). Полученные значения амплитуд NMDA-потенциалов (мкВ) рассматривали как контрольные перед замораживанием и принимали за 100%. Затем срезы замораживали при медленной скорости (0.1°С/мин) до –10°С и хранили в морозильнике термостата “ThermoStat plus” (Eppendorf, Германия). Через 30 сут криосохранения срезы отогревали до 37°С с такой же скоростью, при этом солевой состав среды не менялся. Вновь регистрировали NMDA-потенциалы (мкВ) и выражали в % по отношению к значениям до замораживания.

Химические реактивы предоставлены компанией Химреактив (Россия).

Статистическую обработку изменения амплитуд NMDA-потенциалов проводили с использованием непараметрического параметра Вилкоксона–Манна–Уитни (U-критерия). Цифровые данные выражали как среднее значение и его стандартная ошибка. Уровень статистической значимости составлял р ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для устранения нарушений функций NMDAR при криосохранении и последующем отогревании были исследованы эффекты гибридной буферной системы, состоящей из трех компонентов: карбоната (NaHCO₃), фосфата (KH₂PO₄) и Трис-HCl в замораживающей среде для криосохранения срезов мозга. Солевой состав среды до и после криосохранения и последующего отогревания не изменялся.

На рис. 1 представлены ФП, записанные после 30 сут криосохранения и последующего отогревания до температуры 37°C в среде такого же состава, как при замораживании. Амплитуда NMDA-потенциала (рис. 1, вставка) уменьшалась после отогревания и составляла 28 ± 7 против 130 ± 11 мкВ до замораживания (р ≤ 0.05, U = 7, n = 12). Среднее снижение амплитуд NMDA-потенциалов составило 78% по сравнению с амплитудой до криосохранения. При исследовании ранее эти потенциалы отсутствовали, что указывает на ингибированиe активности NMDAR (Mokrushin, 2016; Мокрушин, Боровиков, 2017). Следовательно, усиление буферной емкости замораживающей среды при помощи Трис-HCl, который играет ключевую роль в долгосрочном поддержании кислотно-щелочного баланса в срезах мозга, не способствует полному восстановлению активности NMDAR после криосохранения.

Для выяснения причин снижения активности NMDAR после криосохранения и отогревания мы исследовали изменение внеклеточного pH замораживающей среды. Результаты выявили, что после продолжительного криосохранения (–10°C при медленной скорости замораживания – 0.1°C/мин) и последующего отогревания с той же скоростью происходит закисление pH среды при отогревании до значений pH 6.5–6.7. Мы полагали, что такое снижение рН среды приводит к редукции амплитуд NMDA-потенциалов. Действительно при этих значениях рН амплитуда NMDA-потенциалов снижалась. Так, до замораживания амплитуда NMDA-потенциала составляла 140 мкВ, а при отогревании снижалась и становилась равной 36 мкВ (р ≥ 0.05, U = 11, n = 12), то есть редукция NMDA-потенциалов составляла 75% по отношению к значениям до замораживания. Отметим, что при этом солевой состав замораживающей среды не менялся.

Для проверки изменения активности NMDAR и устранения криоповреждения их функций мы исследовали эффекты замораживающих сред с различными значениями pН. Эксперименты проводили в следующей последовательности. Перед замораживанием срезы содержали в средах с различными значениями pН. В каждой среде измеряли амплитуды NMDA-потенциалов при 37°C (рис. 2). Было выявлено, что амплитуда NMDA-потенциала возрастала с увеличением pН среды перед криосохранением. Важно отметить, что амплитуда NMDA-потенциалов при pН 7.6–7.7 в среде после отогревания статистически не отличалась от значений до криосохранения (рис. 2). Следовательно, интервал значений pН среды 7.6–7.7 является оптимальными для длительного криосохранения и последующего отогревания срезов.

Рис. 2.

Амплитуда NMDA-потенциалов до криосохранения (КС) при 37°С в зависимости от значения рН замораживающей среды. n = 5 (при рН 6.7 и 7.7); n = 7 (рН 6.9); n = 12 (рН 7.3); n = 9 (рН 7.6). Амплитуда NMDA-потенциалов выражена в % от значения до КС, принятого за 100% (горизонтальная штриховая линия). Различия амплитуд NMDA-потенциалов по сравнению с значениями до КС определяли с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона–Манна–Уитни, р ≤ 0.05 (*).

Однако необходимо учитывать, что срезы до замораживания находятся в среде, у которой pН 7.3 (оптимальный для функционирования NMDAR), поэтому для защиты активности NMDAR мы использовали метод увеличения значения pH до 7.6–7.7 при достижении температуры 20–22°С в процессе замораживания срезов от 37°С.

Используя прием смены замораживающей среды, мы обнаружили, что амплитуда NMDA-потенциалов составляла 131 ± 9 мкВ, а после криосохранения и последующего отогревания была 121 ± 10 мкВ (рис. 3). Статистически эти значения не отличалась от значений до криосохранения (р ≥ 0.05, U = 29, n = 12).

Рис. 3.

Потенциалы, регистрируемые в нейронах срезов обонятельной коры в ответ на электрическую стимуляцию ЛОТ и NMDA-потенциалы до и после КС при изменении рН замораживающей среды с 7.3 до 7.6–7.7 в интервале 22–24°С в процессе КС (слева). Справа показаны NMDA-потенциалы в увеличенном масштабе; горизонтальные черные штриховые линии – амплитуды NMDA-потенциалов до и после КС. Вертикальная серая стрелка – амплитуда NMDA-потенциалов.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе мы изучали действие кислотно-щелочных характеристик замораживающей среды на сохранение активности NMDAR при длительном криосохранении. На функционирование NMDAR влияет множество факторов, к которым относятся скорость замораживания/отогревания, состав замораживающей среды и наличие в ней криопротекторов. В настоящей работе было обнаружено, что после криосохранения срезов значение рН замораживающей среды снижалось ниже оптимального уровня сохранения активности NMDAR.

Известно, что активность NMDAR избирательно ингибируется протонами при нормотермических значениях pH. Протоны снижают частоту открытия NMDA-каналов, и это приводит к редуцированию амплитуды NMDA-потенциалов (Traynelis, Cull-Candy, 1990). Кроме того, обнаружено, что протонный сенсор находится в N-концевом домене (NTD) субъединицы GluN2A рецептора NMDAR и аллостерически связан с воротами канала. В результате, протоны подавляют активность субъединиц GluN1–GluN2A рецептора NMDAR (Zhang et al., 2018). Очевидно, что такой механизм также вовлекается в ингибирование активности NMDAR после криосохранения и последующего отогревания.

Принимая во внимание приведенные выше данные о протонной регуляции активности NMDAR и значительное закисление рН замораживающей среды после криосохранения срезов, мы увеличили ее буферную емкость. Это было достигнуто применением гибридной буферной системы замораживающего раствора при неизменном солевом составе среды. В результате исследований было получено повышение активности NMDAR после криосохранения, однако достичь полного восстановления активности NMDAR этим приемом не удалось. С целью сохранения активности NMDAR после криосохранения мы применили дополнительный способ для минимизации ингибирования активности NMDAR, вызываемого протонами – увеличили pH замораживающей среды для срезов с 7.3 до 7.6–7.7 с помощью добавления в среду 0.1 н раствора NaOH объемом 0.3 мл и контролировании рН.

Замену замораживающей среды со значением pH 7.6–7.7 производили в процессе замораживания срезов в интервалах положительных температур 20–22°С в начале процесса замораживания. Этот способ основан на результатах наших предыдущих исследований, что в этом диапазоне температур NMDAR становились нечувствительными к воздействиям гипоксии (Мокрушин, 2016). В результате было выявлено, что активность NMDAR после криосохранения оставалась на уровне, равной активности до замораживания. Следовательно, использование гибридной буферной системы и повышение значения рН до 7.6–7.7 при замораживании срезов были оптимальными условиями для восстановления активности NMDAR при отогревании после длительного криосохранения (–10°С, 30 сут).

Рассматривая способы защиты активности NMDAR в процессе криосохранения и последующего отогревания необходимо отметить другие механизмы. Прежде всего, это вовлечение астроглиального механизма, который способствует защите внеклеточной среды от увеличения концентрации протонов. Эксперименты in vivo и in vitro показали, что астроциты поддерживают локальный гомеостаз внеклеточного pH в ткани мозга от перегрузок протонами при помощи высвобождения бикарбоната глиальными клетками (Theparambil et al., 2020). Однако в настоящей работе, как мы полагаем, в процессе криосохранения астроглиальный механизм в срезах обонятельной коры, по-видимому, ингибируется и не способствует сохранению активности NMDAR.

Другой возможный способ защиты активности NMDAR – применение криопротекторов. Однако выявлено, что традиционно используемые криопротекторы оказывают побочное негативное воздействие на активность нейронов (Пичугин, 2013). Полагаем, что это связано с применением препаратов, не имеющих эндогенного происхождения. При поиске эндогенных протекторов обнаружено, что эндогенный дипептид L-карнозин способствовал сохранения активности NMDAR при криосохранении срезов обонятельной коры мозга. Защитный эффект L-карнозина усиливался с увеличением концентрации эндогенного дипептида (Mokrushin, Pavlinova, 2016). Можно надеяться, что L-карнозин самостоятельно или в комбинации с другими веществами может быть использован в качестве нетоксичного криопротектора для длительного криосохранения.

Таким образом, нами предложен новый метод протекции активности NMDAR после длительного криосохранения. Метод не использует криопротекторы, вызывающие блокаду активности NMDAR. Мы полагаем, что этот метод криосохранения можно использовать для создания криобанка нервной ткани.