Цитология, 2022, T. 64, № 4, стр. 404-408

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объект и приготовление препаратов. Выделенные препараты фрагментов кожно-мускульного мешка дождевого червя Lumbricus terrestris закрепляли с помощью иголок на дне чашек Петри, залитых смолой Sylgard, и перфузировали раствором Древеса–Пакса (состав (мМ): 77 NaCl, 4 KCl, 43 Na₂SO₄, 6 CaCl₂, 2 триса и 167 сахарозы; pH 7.4) около 30 мин при комнатной температуре (22 ± 1°С). Далее в течение 30 мин препараты фиксировали в 2%-ном растворе p-формальдегида, отмывали 3 раза по 30 мин в фосфатно-солевом буфере (ФБ, состав (мМ): 137 NaCl, 2.7 KCl, 4.3 Na₂SO₄, 1.4 KH₂PO₄, pH 7.2). Мышцы последовательно инкубировали: 30 мин в 0.5%-ном растворе Triton X-100; 15 мин в растворе, содержащем 5% козьей сыворотки, 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0.5% Triton X-100; 15 мин в растворе 1% БСА и 0.5% Triton X-100 (раствор А). Все эти растворы были приготовлены на основе ФБ.

Окрашивание препаратов. Препараты инкубировали в течение 12 ч при температуре 4°С в растворе А с поликлональными антителами к мускариновым АХ-рецепторам подтипов M1, M2, M3, M4, M5 (1 : 200) и синаптофизину (1 : 200). Препараты отмывали в растворе А 3 раза по 30 мин и инкубировали 1 ч при комнатной температуре с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с Alexa 488 или 647 (1 : 800) в растворе А. Окрашивание постсинаптических никотиновых АХ-рецепторов производили с помощью тетраметилродамин-α-бунгаротоксина (TMR-α-Б, 20 мкг/мл; время инкубации 30 мин). Для подтверждения специфичности связывания поликлональных антител с соответствующими белками проводили контрольные эксперименты. Для негативного контроля препарат инкубировали с вторичными антителами без предшествующей инкубации с первичными антителами. Для позитивного контроля производили инкубацию препарата с первичными антителами в присутствии иммуногенного пептида, на который вырабатывались первичные антитела. Отсутствие окрашивания в контрольных экспериментах указывает на специфичность связывания антител с соответствующими пептидами.

Микроскопия. После отмывки в ФБ, препараты помещали в раствор ФБ с глицерином (1 : 1) и размещали на предметном стекле для проведения микроскопического исследования на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 MP (Leica Microsystems, США). Использовали масляный иммерсионный объектив 63×/1.4. Для возбуждения эмиссии флуорофоров применялся аргоновый и гелий-неоновый лазеры. Длины волн возбуждения для флуорофоров: Alexa 488 – 488 нм, TMR – 543 нм, Alexa 647 – 633 нм. Анализ полученных конфокальных изображений проводили в программе ImageJ (NIH, США).

Реактивы. В работе использовали p-формальдегид, трис, Тритон X-100, нормальную козью сыворотку, БСА, TMR-α-Б, глицерин (Sigma-Aldrich); первичные поликлональные антитела и соответствующие им иммуногенные пептиды (Santa Cruz Biotechnologies, США); антитела вторичные Alexa 488 и Alexa 647 (Invitrogen, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для локализации двигательных нервных окончаний использовали окрашивание на синаптофизин – интегральный мембранный гликопротеин синаптических везикул (Valtorta et al., 2004; Kwon, Chapman, 2011), а для маркирования никотиновых АХ-рецепторов постсинаптической мембраны – TMR-α-Б (Krause, Wernig, 1985; Nurullin et al., 2011).

Иммуногистохимическое окрашивание фрагментов соматической мускулатуры дождевого червя с целью выявления АХ-рецепторов М1-подтипа носит диффузный характер, встречаясь по всей поверхности мембран соматических клеток (рис. 1а), сочетаясь с наличием ограниченных мест более интенсивного окрашивания (рис. 1а). При этом необходимо отметить, что данные зоны не перекрываются с районами окрашивания, маркированными на присутствие белка синаптофизина (рис. 1а, б, г). В то же время окрашивание на АХ-рецепторы М1-подтипа совпадает с локальным окрашиванием TMR-α-Б никотиновых АХ-рецепторов (рис. 1а, в, д). Полученные данные позволяют считать, что мускариновые АХ-рецепторы М1-подтипа присутствуют как в синаптических, так и во внесинаптических зонах мембран соматических мышечных клеток. Наличие АХ-рецепторов М1-подтипа в двигательных нервных окончаниях не подтверждается.

Рис. 1.

Флуоресцентное тройное окрашивание препарата соматических мышечных волокон дождевого червя Lumbricus terrestris. а – Окрашивание антителами к М1-мускариновому АХ-рецептору; б – окрашивание антителами к пресинаптическому белку синаптофизину; в – окрашивание TMR-α-Б никотиновых АХ-рецепторов. Здесь и на рис. 2–5: г – программно-обработанное изображение, полученное при совмещении изображений а и б (мускариновый рецептор и синаптофизин), демонстрирующее только совпадающие при наложении изображений светлые пиксели; д – программно-обработанное изображение, полученное при совмещении изображений а и в (мускариновый рецептор и TMR-α-Б), показывающее только совпадающие при наложении изображений светлые пиксели. При наложении двух изображений, светлые пиксели, присутствующие только на одном из изображений, на итоговых изображениях не учитывались. Таким образом, можно увидеть места совпадения окрашивания на указанные маркеры. Масштабная линейка на рис. 1–5: 10 мкм.

Иммуногистохимическое определение АХ-рецепторов подтипа М2 показало неоднородное окрашивание всей поверхности мембран соматических мышечных клеток (рис. 2а). При этом участки с выявленным присутствием синаптофизина (рис. 2а, б, г) и TMR-α-Б (рис. 2а, в, д) совпадали с наличием метки на АХ-рецепторы М2-подтипа. Полученные результаты показывают присутствие в соматических мышечных клетках мускариновых АХ-рецепторов М2-подтипа, причем последние присутствуют как на постсинаптической мембране, так и, возможно, в двигательных нервных окончаниях.

Рис. 2.

Присутствие М2-мускариновых АХ-рецепторов при флуоресцентном тройном окрашивании препарата соматических мышечных волокон дождевого червя. а – Окрашивание антителами к М2-мускариновому АХ-рецептору; б – окрашивание антителами к пресинаптическому белку синаптофизину; в – окрашивание никотиновых рецепторов к АХ при помощи TMR-α-Б. г, д: см. подпись к рис. 1.

Идентификация АХ-рецепторов подтипа М3 выявила их неравномерное окрашивание по всей поверхности мышечных клеток (рис. 3а). В ряде районов окрашивание на М3-рецепторы перекрывалось с зонами выявления белка синаптофизина (рис. 3а, б, г), а также постсинаптических никотиновых АХ-рецепторов (рис. 3а, в, д). Можно думать, что АХ-рецепторы подтипа М3 присутствуют как в двигательных нервных окончаниях, так и во вне- и постсинаптических регионах мембраны мышечных клеток кожно-мускульного мешка.

Рис. 3.

Выявление М3-мускариновых АХ-рецепторов при тройном флуоресцентном окрашивании препарата соматических мышечных волокон дождевого червя. а – Окрашивание антителами к М3-мускариновому АХ-рецептору; б – окрашивание антителами к пресинаптическому белку синаптофизину; в – окрашивание никотиновых рецепторов к АХ при помощи TMR-α-Б. г, д: см. подпись к рис. 1.

Иммунофлуоресцентная идентификация мускариновых АХ-рецепторов подтипа М4 показала их присутствие в экстрасинаптической зоне мембран мышечных клеток (рис. 4а). При этом М4-рецепторы четко фиксировались в областях окрашивания на синаптофизин (рис. 4а, б, г) и никотиновые АХ-рецепторы (рис. 4а, в, д). Полученные результаты позволяют считать, что рецепторы М4-подтипа присутствуют как на пре-, так и на постсинаптических мембранах нервно-мышечных синапсов.

Рис. 4.

Наличие М4-мускариновых АХ-рецепторов при тройном флуоресцентном окрашивании препарата соматических мышечных волокон дождевого червя. а – Окрашивание антителами к М4-мускариновому АХ-рецептору; б – окрашивание антителами к пресинаптическому белку синаптофизину; в – окрашивание никотиновых рецепторов к АХ при помощи TMR-α-Б. г, д: см. подпись к рис. 1.

Мускариновые АХ-рецепторы М5-подтипа обнаруживаются в виде протяженных структур свечения (рис. 5а), которое в некоторых районах сопряжено одновременно с окрашиванием на белок синаптофизин (рис. 5а, б, г) и никотиновые АХ-рецепторы (рис. 5а, в, д). При этом окрашивание на М5-рецепторы наблюдается и в экстрасинаптических зонах (рис. 5а). Также отмечается окрашивание на АХ-рецепторы М5-подтипа, совпадающее только с зонами выявления TMR-α-Б (рис. 5а, в, д). Таким образом, мускариновые АХ-рецепторы М5-подтипа широко представлены на вне-, пре- и постсинаптических мембранах мышечных клеток. Можно предполагать, что существуют два типа синапсов. Первые – имеют на пресинаптической мембране рецепторы типа М5, тогда как вторые – нет. Либо это одни и те же двигательные терминали, но находящиеся на разных стадиях своего формирования. Однако данные гипотезы требуют экспериментального подтверждения.

Рис. 5.

Обнаружение М5 мускариновых АХ-рецепторов при флуоресцентном тройном окрашивании препарата соматических мышечных волокон дождевого червя. а – Окрашивание антителами к М5-мускариновому АХ-рецептору; б – окрашивание антителами к пресинаптическому белку синаптофизину; в – окрашивание никотиновых рецепторов к АХ при помощи TMR-α-Б. г, д: см. подпись к рис. 1.

Проведенные исследования позволяют сделать следующее заключение. Мембраны соматических мышечных клеток кожно-мускульного мешка дождевого червя Lumbricus terrestris содержат семейство мускариновых АХ-рецепторов подтипов М1–М5. При этом мускариновые АХ-рецепторы всех подтипов присутствуют как во внесинаптических зонах, имея при этом неоднородный характер распределения, так и в мембранах концевых пластинок двигательных нервно-мышечных холинергических синапсов, тогда как никотиновые АХ-рецепторы локализуются исключительно в зоне нервно-мышечного контакта (Нуруллин, Волков, 2020). АХ-рецепторы подтипов М2, М3, М4 и М5, за исключением подтипа М1, определяются и в нервных двигательных терминалях.