Цитология, 2022, T. 64, № 4, стр. 390-395

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Клетки. Мезенхимные стволовые клетки, выделенные из костного мозга 5–6 недельного эмбриона человека (FetMSC) получены из Центра коллективного пользования ИНЦ РАН (Санкт-Петербург) “Коллекция культур клеток позвоночных” (Соглашение № 075-15-2021-683) (Крылова и др., 2012). Перед экспериментами клетки высевали на покровные стекла, помещенные в чашки Петри, плотность составляла 10⁴ клеток/см². В качестве питательной среды использовали DМЕМ/F12 (Биолот, Россия), содержащую 10% сыворотки плодов коровы (HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, смесь пенициллина (50 Ед/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) (Биолот, Россия). Клетки культивировали в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 90%-ной влажности, смену среды проводили каждые 2–3 сут, эксперименты проводили на клетках, достигших субконфлюентности.

Обработка модификаторами актинового цитоскелета. В работе использовали хорошо изученный модификатор актинового цитоскелета токсин биологического происхождения Lat B (Spector et al., 1989). Lat B растворяли в DMSO (25 мг/мл). Механизм действия Lat B на актиновый цитоскелет клетки известен: связываясь с мономерами актина в стехиометрии 1 : 1 он ингибирует его полимеризацию, что препятствует образованию новых актиновых филаментов. Обработку клеток Lat B в концентрации 10 или 1000 нМ в среде культивирования проводили в течение 30 мин в СО₂-инкубаторе; в качестве контроля использовали клетки без обработки или клетки после действия 1 мкМ диметилсульфоксида (DMSO, растворителя для Lat B). Во второй серии экспериментов клетки обрабатывали ПНП в концентрации 10 или 1000 нМ в течение 24 ч в СО₂-инкубаторе; контрольными служили клетки без обработки (растворитель для ПНП − дистиллированная вода).

Выявление F-актина в клетках FetMSC. После культивирования с исследуемыми веществами клетки фиксировали 10 мин при 25°С 5%-ным раствором формальдегида в однократном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS). Затем проводили пермеабилизацию клеточной мембраны с помощью 0.5%-ного раствора Triton Х-100 (10 мин в PBS). Для флуоресцентного мечения F-актина образцы инкубировали с фаллоидином, конъюгированным с родамином (TRITC-phalloidin, 1 мкг/мл; Sigma-Aldrich, Германия) в течение 15 мин при 37°С. Ядра окрашивали с помощью красителя Hoechst 33342 (Sigma, США; 2 мкг/мл в PBS). Далее покровные стекла крепили к предметному стеклу, используя среду Vectashield Mounting Media (Vector Labs, США), препятствующую “выгоранию” образцов. Микрофотографии получали с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus FV3000 (Оlympus Сorporation, Япония), укомплектованного лазерами с длиной волны возбуждения 561 и 350 нм (для выявления родамин-фаллоидина и красителя Hoechst 33 342 соответственно). Параметры мощности лазеров, апертурной диафрагмы, свойства регистрирующих фотоумножителей были постоянными при визуализации всех препаратов.

Измерение относительной интенсивности флуоресценции (ИФ) и фрактальной размерности Минковского. Использовали программу ImageJ (NIH, США). Предварительно в меню Analyze → Set measurements устанавливали измерение “среднее значение серого” (Mean gray value). Далее в микрофотографии выделяли слой, содержащий изображение F-актина, и переводили его в 8-битный формат, содержащий только оттенки серого (функция Image → Type → 8-bit). После этого с помощью курсора выделяли область клетки “свободное выделение” (Freehand selection) и получали значение ИФ выделенного участка с помощью функции Analyze → Measure. Данные заносили в таблицу Microsoft Excel (Microsoft Ofiice, США), итоговые значения ИФ представлены средними из 10 измерений (n) и их стандартной ошибки, достоверность различий оценивали с помощью дисперсионного анализа с уровнем значимости Р < 0.05.

Измерение ФРМ проводили с помощью плагина FracLac (NIH, США). Предварительно в плагине устанавливали тип измерений Box-counting. Далее с помощью функции Image → Color → Split Channels в микрофотографии выделяли канал, содержащий изображение F-актина. После этого полученное изображение переводили в черно-белый формат с помощью функции Process → Binary → Make Binary и возвращали “скелет” фигуры с помощью Process → → Binary → Skeletonize. Затем с помощью курсора (Freehand selection) выделяли область клетки и в плагине FracLac проводили расчет ФРМ с помощью функции Scan. Полученные данные вносили в таблицу Exсel, итоговые значения ФРМ представлены средними из 10 измерений (n = 10) и их стандартной ошибки, достоверность различий оценивали с помощью дисперсионного анализа с уровнем значимости Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Окрашивание F-актина в клетках FetMSC после действия Lat B. Известно, что фаллоидин специфично связывается с F-актином, поэтому качественная и количественная оценка окрашенных нитей актина может отражать сборку или разборку актинового цитоскелета (Cooper, 1987). Мы окрашивали F-актин клеток FetMSC родамин-фаллоидином в контроле (рис. 1а), и в образцах, обработанных 1000 нМ DMSO (растворителем Lat B; рис. 1б) и Lat B в концентрации 50 нМ (рис. 1в) и 1000 нМ (рис. 1г). В контрольных условиях, как и в присутствии DMSO или 50 нМ Lat B все клетки имеют фибробластоподобную морфологию и выраженные стресс-фибриллы, что типично для меземхимных стволовых клеток. Как и следовало ожидать, после обработки клеток 1000 нМ Lat B мы не наблюдали выраженных стресс фибрилл, а само окрашивание было дисперсным и не имело четко выраженной организации. Полученные результаты согласуются с описанным ранее в литературе действием Lat B: при малых концентрациях (менее 50 нМ) вещество не оказывает влияния на актиновые структуры, а при концентрациях 500 нМ и выше ингибирует сборку актиновых фибрилл в клетке (Wakatsuki et al., 2001), что приводит к паттерну флуоресцентного окрашивания, схожему с наблюдаемым нами в FetMSC. Процессы формирования нитей актина в клетке динамичны, а именно включают в себя постоянную сборку нити с одного конца и ее разборку с другого; по этой причине ингибирование сборки нитей при инкубации Lat B вызывает ее последующую разборку (Spector et al., 1989).

Рис. 1.

Флуоресценция F-актина (красный цвет) клеток FetMSC, окрашенных родамин-фаллоидином в контроле (а) и после 30-минутного действия Lat B в концентрации 50 нМ (в) и 1000 нМ (г). б – После 30-минутного действия 1000 нМ DMSO (растворителя Lat B). Ядра окрашены Hoechst (синий цвет). Масштабная линейка: 50 мкм.

Численная оценка разборки F-актина после действия Lat B. Оценку (в каждой крупе было по 10 клеток) проводили двумя методами: с помощью вычисления ИФ или ФРМ (рис. 2 и табл. 1). Применяя дисперсионный анализ, мы не выявили отличий между контрольной группой клеток и группой, обработанной 1000 нМ DMSO ни по параметру ИФ, ни по параметру ФРМ, что указывает на отсутствие влияния растворителя DMSO на F-актин FetMSC. Кроме того, не было выявлено различий между контрольной группой и группой, обработанной 10 нМ Lat B. Мы предполагаем, что этой концентрации вещества, по-видимому, недостаточно для детектируемого ингибирования полимеризации актина и разрушения цитоскелета за 30 мин действия. Наши результаты согласуются с данными из литературы. Так, показано, что при воздействии Lat B в концентрации 10 нМ на клетки линии NIH/3T3 в течение 30 мин перед фиксацией не выявлено значимых различий в структуре F-актина по сравнению с контролем ни с помощью визуального анализа микрофотографий, ни с помощью сравнения значений ИФ (Liu et al., 2020). Другие авторы также не наблюдали изменений свойств клеток при воздействии Lat B в концентрациях ниже 50 нМ (Wakatsuki et al., 2001). Мы обнаружили достоверные различия средних значений ИФ и ФРМ между контрольной группой и группой, обработанной 1000 нМ Lat B, что совпадает с визуальной оценкой микрофотографий окрашенного F‑актина (рис. 1).

Рис. 2.

Интенсивность флуоресценции (ИФ) (а) и фрактальная размерность Минковского (ФРМ) (б) F-актина в контроле и при действии Lat B в разной концентрации. Представлены средние значения и стандартная ошибка среднего. Отличия от контроля (К) достоверны при *Р < 0.05 или **Р < 5 × 10⁻⁷.

Таким образом, наблюдаемые изменения структуры F-актина были подтверждены при численной оценке как с помощью измерений ИФ, так и при расчете ФРМ, при этом уровни достоверной значимости различий составили P < 0.05 для ИФ и Р < 5 × 10^–7 для ФРМ, которые свидетельствуют о том, что оценка значений ФРМ является более чувствительным показателем, чем ИФ в данной серии экспериментов.

Оценка изменений структуры F-актина в FetMSC после действия ПНП. В настоящей работе, как и ранее (Ревитцер и др., 2019), мы наблюдали сборку F‑актина при воздействии ПНП в концентрации 10 нМ в течение 24 ч перед фиксацией (рис. 3а–в). Эти результаты подтверждаются анализом литературы: показано, что добавление 10 нМ ПНП в культуральную среду эндотелиальных клеток аорты вызывает сборку F-актина (Kook et al., 2003; Chen et al., 2008). В то же время мы не обнаружили различий организации F-актина между контрольными клетками и клетками, обработанными 1000 нМ ПНП, что тоже согласуется с нашими предыдущими результатами (Ревитцер и др., 2019). Этот факт вызывает особый интерес, а анализ литературы позволяет обнаружить, что существует несколько примеров веществ, которые оказывают действие только в малых концентрациях, а при ее повышении эффекта нет. Среди таких веществ можно выделить трансформирующий фактор роста β1 (Pepper et al., 1993) и бортезамиб (Veschini et al., 2007). Подобный тип влияния называется U‑образным (u-shape) или bell-образным (bell-shape) (Reynolds et al., 2010).

Рис. 3.

Флуоресцентное окрашивание F-актина клеток FetMSC в контроле и после 24-часового действия ПНП. а – Контроль (К); б – 10нМ ПНП; в – 1000 нМ ПНП; г – ФРМ изображений F-актина, приведены средние значения и стандартная ошибка среднего, различия достоверны при *Р < 0.05. Масштабная линейка: 100 мкм.

Численная оценка перестроек F-актина после действия ПНП. Мы оценили ФРМ F-актина для клеток, обработанных ПНП в различных концентрациях в течение 24 ч перед фиксацией и окрашиванием (рис. 3, табл. 1). В табл. 1 показано сопоставление значений ФРМ, полученных в настоящей работе, со значениями ИФ, рассчитанными нами ранее (Ревитцер и др., 2019). Выявленные в настоящей работе значения ФРМ составили для контрольной группы 1.45 ± 0. 05 отн. ед.; для клеток, обработанных 10 или 1000 нМ ПНП, 1.56 ± 0.05 и 1.43 ± 0.04 отн. ед. соответственно.

Применяя дисперсионный анализ, мы выявили различия значений как ФРМ, так и в ИФ между контрольной группой и группой клеток, обработанных 10 нМ ПНП. Однако мы не выявили различий между контролем и группой клеток, обработанных ПНП в большей концентрации (1000 нМ). Уровни значимости составили P < 0.05 как для ИФ, так и для ФРМ, что указывает на схожий уровень чувствительности используемых методов и оценок в данной серии экспериментов. Полученные результаты согласуются с визуальной оценкой микрофотографий и данными, опубликованными ранее (Ревитцер и др., 2019), в том числе показывающими изменение подвижности FetMSC при воздействии только 10 нМ ПНП.

Качественная оценка изменений F-актина не всегда является надежным методом, так как во многом зависит от личного мнения исследователя, осуществляющего эту оценку. Чтобы обеспечить объективность оценки результатов экспериментов, следует прибегнуть к количественным методам. В настоящей работе были рассмотрены два метода квантификации: измерение относительной ИФ и ФРМ. Оба метода показали себя способными выявлять и подтверждать изменения организации F-актина при действии биологически активных веществ (Lat B и ПНП), причем в случае с Lat B достоверность измеряемых значений различий была существенно выше в случае ФРМ, чем ИФ. В настоящее время чаще оценивают ИФ, чем ФРМ для квантификации изменений, что можно связать с простотой регистрации в ходе расчета ИФ. Однако необходимо заметить, что ФРМ, в отличие от ИФ, позволяет учитывать не саму интенсивность свечения флуоресцентных изображений F-актина, а именно форму и расположение актиновых фибрилл. Таким образом, разные принципы получения численных значений делают ФРМ и ИФ взаимодополняющими методами при квантификации изображений F-актина.