Цитология, 2023, T. 65, № 1, стр. 28-38

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Животные. Работа проведена на крысах линии Вистар (аутбредная линия) из ЦКП “Биоколлекция Института физиологии им. И.П. Павлова РАН для исследования интегративных механизмов деятельности нервной и висцеральных систем”. Использовали самцов крыс в возрасте 3-х мес. и весом 250–280 г. с соблюдением рекомендаций по этике работы с животными, утвержденными правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям Комиссии по гуманному обращению с животными Института Физиологии им. И.П. Павлова РАН. Животных содержали в пластиковых клетках (по 5 животных в клетку) на стандартной диете (гранулированный комбикорм) при свободном доступе к воде и пище и 12-часовом режиме смены дня и ночи.

Экспериментальные группы животных. Было сформировано 3 группы животных: 1) с ПТСР-подобным состоянием, 2) с ДПС и 3) контрольная группа (интактные самцы). В каждую группу вошли 5 животных. Самцов группы 1 подвергали стрессу с использованием парадигмы “стресс–рестресс” (модель ПТСР). Вначале применяли комбинированное стрессовое воздействие, состоящее из 2-часовой иммобилизации в узких пластиковых пеналах, 20-минутного плавания в стеклянных цилиндрах диаметром 40 см и глубиной 60 см, заполненных водой при температуре 24 ± 2°С, и далее после небольшой паузы эфирный стресс в течение 1 мин. Далее через 7 сут самцов подвергали повторному стрессу (рестрессу) в виде 30-минутной иммобилизации с целью развития стойкого ПТСР-подобного состояния (Пивина и др., 2015). Критерием включения в группу было снижение уровня кортикостерона в крови на 10-е сут после рестресса по сравнению с контрольной группой. У самцов группы 2 вырабатывали ДПС в парадигме “выученная беспомощность” (Czén et al., 2016). Самцов подвергали неизбегаемому и неконтролируемому электрокожному раздражению в клетке с токопроводящим полом размером 30 × 18 × × 20 см. Удары электрического тока (1 мА, 50 Гц) длительностью 15 с подавались 60 раз в течение 1 ч с длительностью интервала между ударами током от 15 до 54 с. Критерием включения в группу служило повышение уровня кортикостерона в крови на 10-е сут после действия стресса. Контрольных самцов (n = 5) оставляли интактными.

Оценка уровня кортикостерона. Кровь для анализа на содержание кортикостерона отбирали на 10-е сутки после рестресса или неизбегаемого электрокожного раздражения из хвостовой вены у животных всех групп. Образцы крови центрифугировали 10 минут при 2500 об./мин, полученную плазму хранили при −20°С. Уровень кортикостерона определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов в соответствии с инструкцией производителя (ХЕМА, Россия) и анализатора Multickan FS (Thermo Fisher Scientific, Финляндия).

Для статистического анализа содержания кортикостерона в крови использовали однофакторный ANOVA и последующие парные post-hoc сравнения (тест Тьюки) значений для каждой группы животных. Статистически значимыми считали различия при p < 0.05.

Получение сперматозоидов. Через 48 сут после стрессовых процедур (период, необходимый для полного цикла созревания сперматозоидов) самцов всех групп подвергали действию диэтилового эфира в течение 3 мин, а затем декапитировали.

Сразу после забоя у самцов извлекали оба каудальных эпидидимуса, которые помещали в нагретый до 37°С стерильный сосуд с 1 мл 1-кратного PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина. Эпидидимисы надрезали и инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С, позволяя подвижным сперматозоидам свободно всплыть. С целью исключения загрязнения образцов соматическими клетками жидкость, полученную после инкубации эпидидимисов и содержащую сперматозоиды, подвергали очистке в градиенте суспензии силиконовых частиц SupraSperm System и среды для подготовки сперматозоидов Sperm Preparation®Medium (оба производства ORIGIO, Дания) согласно инструкции производителя. Чистоту препаратов и число полученных сперматозоидов оценивали в камере Горяева под световым микроскопом после окраски 1%-ным водным раствором эозина. Число выделенных подвижных сперматозоидов составило 5.5 ± 0.5 млн на образец, а статистически значимых различий по этому показателю между группами самцов не было.

NGS-секвенирование. Полученные сперматозоиды помещали в Trizol (ThermoFisher) и хранили при −70°С до выделения РНК. Тотальную РНК выделяли стандартным методом (гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции), качество выделенной РНК (RIN) оценивали на Tapestation (Agilent, США). Для приготовления и очистки библиотек кДНК использовали кит QIAseq miRNA Library Kit (Qiagen, Германия) согласно инструкции производителя. Для приготовления библиотек использовали 200 нг тотальной РНК от каждого образца. Секвенирование было проведено на платформе Illimina Hi-Seq по протоколу, рекомендованному для малых РНК (однонапревленное секвенирование, длина прочтения 50 п.н., глубина секвенирования 1–5 млн прочтений на образец). Приготовление библиотек и секвенирование нового поколения (NGS) было проведено одновременно для всех образцов.

Для каждого образца было получено от 2623091 до 3881243 прочтений, после биоинформатической фильтрации по качеству количество прочтений на образец в среднем составило 1 600 000. После выравнивания в среднем 32.5% прочтений были аннотированы как известные малые РНК разных классов (микроРНК, piwiРНК, тРНК), еще 30.5% прочтений были охарактеризованы как фрагменты рРНК и мРНК. Оставшиеся прочтения были аннотированы как картированные не охарактеризованные фрагменты. Для анализа дифференциальной экспрессии использовали матрицу количества чтений на ген без нормализации. Для оценки дифференциальной экспрессии коротких РНК использовали пакет DESeq2 R (Love et al., 2014). Оценку дифференциальной экспрессии в DESeq2 проводили только для микроРНК и piwiРНК с суммарным числом считываний ≥15 по всем образцам. Заключение о дифференциальной экспрессии микроРНК и piwiРНК производили, если абсолютное значение log2-кратного изменения (log2 fold change) было >0.5, а значение р, с учетом поправки на множественные сравнения, было <0.05.

Реактивы. Использовали силиконовые частицы SupraSperm System, среду для подготовки сперматозоидов Sperm Preparation®Medium (ORIGIO, Дания), Тризол (ThermoFisher, США), набор для приготовления и очистки библиотек кДНК QIAseq miRNA Library Kit (Qiagen, Германия), ИФА-набор для определения кортикостерона в сыворотке крови (ХЕМА, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

На рис. 1 представлено содержание кортикостерона в плазме крови контрольных самцов, самцов с моделированным ПТСР или моделированной депрессией на 10-е сут после действия стресса. Однофакторный ANOVA показал статистически значимое влияние фактора группа животных на уровень кортикостерона (F_{2, 14} = 23.3, p < 0.0001). Дополнительный анализ post-hoc выявил, что у самцов с моделированным ПТСР наблюдается сниженный уровень кортикостерона в крови, тогда как у самцов с моделированнной депрессией, напротив, уровень кортикостерона повышается по сравнению с контрольными самцами, что соответствует ПТСР-подобному или ДПС соответственно.

Рис. 1.

Содержание кортикостерона (СК, нмоль/л) в крови самцов крыс контрольной группы (К), самцов с моделированным ПТСР (1) и самцов с моделированной депрессией (2) через 10 сут после стрессорного воздействия. Различия с контрольной группой достоверны при *P < 0.001 (тест Тьюки).

В трех группах животных (модель ПТСР, модель депрессии, контрольная группа) было проведено NGS-секвенирование коротких РНК, выделенных из сперматозоидов. После фильтрации по качеству в каждом образце было обнаружено в среднем 1600000 прочтений, из которых 14% были аннотированы как микроРНК, 7.5% – как piwiРНК, 26% – как фрагменты рРНК, 11% – как фрагменты тРНК, 4.5% – как фрагменты мРНК, что в целом соответствует данным литературы о содержании коротких РНК в сперматозоидах (Peng et al., 2012; Short et al., 2016). Всего в образцах было обнаружено 335 видов piwiРНК и 635 микроРНК. В результате дальнейшего анализа нам удалось выявить сходные изменения экспрессии микро- и piwiРНК во всех образцах группы с моделированным ПТСР по сравнению с контрольной группой (р < 0.05). Дифференциальная экспрессия была выявлена для 27 piwiРНК (экспрессия 8 piwiРНК была понижена, 19 – повышена) и для 77 микроРНК (повышена экспрессия у 32 микроРНК и понижена – у 45 микроРНК) (рис. 2). Список коротких РНК, экспрессия которых в наибольшей степени изменена в сперматозоидах самцов с сформированным ПТСР-подобным состоянием, представлен в табл. 1.

Рис. 2.

Тепловая карта дифференциально экспрессирующихся коротких некодирующих РНК у крыс экспериментальных и контрольной групп. В верхнем левом углу показана цветовая шкала дифференциальной экспрессии. Животные: X1–X5 – животные с ПТСР-подобным состоянием, X6–X10 – группа с депрессивно-подобным состоянием, X11–X15 – группа контроля. Хорошо видно, что группа с моделированной депрессией неоднородна: животные X6, X7 и X8 по паттерну экспрессии похожи на группу с ПТСР, а X9 и X10 – на группу контроля.

Различия между группой животных с ДПС и контрольной группой оказались крайне незначительными. Достоверные отличия были выявлены только для двух piwiРНК (rno_piR_019288 и rno_piR_016741), экспрессия которых была повышена в группе ДПС. В целом образцы, полученные от животных этой группы, оказались неоднородными – экспрессия коротких РНК в трех образцах (Х6, Х7 и Х8) была схожа с наблюдаемой в группе самцов с ПТСР, а еще два образца (Х9 и Х10) демонстрировали паттерн экспрессии, сходный с группой контроля (рис. 2). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженном влиянии ПТСР-подобного состояния самцов на паттерн экспрессии коротких РНК в сперматозоидах по сравнению с контрольной группой, и отсутствии однозначного влияния ДПС на этот показатель.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время накоплено большое количество экспериментальных и эпидемиологических данных, указывающих на влияние отцовского стресса на физиологические функции и поведение потомков. На лабораторных грызунах в ряде экспериментов, использующих различные модели стрессовых воздействий, было установлено, что у потомков стрессированных самцов усиливается ДПС и тревожное поведение (Franklin et al., 2010; Dietz et al., 2011). Отметим, что в этих исследованиях самцов подвергали действию стрессов, которые у лабораторных грызунов формируют депрессивно-подобное состояние, проявляющееся не только в соответствующих изменениях поведения, но и в повышенной секреции глюкокортикоидов, что также характерно для больных депрессией (Czén et al., 2016).

Экспериментальные исследования на человеке не проводятся по очевидным причинам, однако в эпидемиологических исследованиях также была обнаружена связь между стрессом отца и физиологическими и психологическими особенностями потомства. Показано, что в семьях больных ПТСР наблюдается усиление ПТСР-подобных симптомов у их потомков, хотя такие потомки воздействию какого-либо травматического стресса не подвергались. (Yehuda et al., 2007a, 2007b). Таким образом, можно считать доказанным то, что психопатология отца, связанная со стрессовым воздействием, оказывает специфическое влияние на потомков.

В настоящее время в качестве основного механизма передачи эффектов отцовского стресса потомкам рассматривается эпигенетическая модификация генома в сперматозоидах, связанная с метилированием ДНК, модификацией гистонов и экспрессией некодирующих РНК, в том числе микро- и piwiРНК (Rodgers et al., 2015; Morgan et al., 2019, 2020; Xavier et al., 2019). Такие модификации с большей вероятностью могут происходить только в зреющих сперматозоидах на стадиях от сперматогониев до сперматид (Ly et al., 2015). В настоящей работе мы сосредоточились на анализе влияния модельной психопатологии отца на содержание в сперме коротких РНК, играющих важнейшую роль в регуляции экспрессии генов и обеспечивающих нормальный сперматогенез.

МикроРНК играют критическую роль в регуляции экспрессии большого числа генов, действуя в основном на пост-транскрипционном уровне, хотя не исключена возможность их воздействия на структуру хроматина, и, следовательно, транскрипционную активность генов. В настоящий момент у человека аннотировано 2656, у мыши – 1978 и у крысы (R. norvegicus) – 764 микроРНК (http://www.mirdb.org/ statistics.html). МикроРНК регулируют ключевые процессы в эмбриональном развитии и дифференцировке; продукты некоторых генов, регулируемых микроРНК, играют важную роль в процессах сперматогенеза. Дисрегуляция продукции микроРНК в процессе созревания сперматозоидов рассматривается как одна из причин мужского бесплодия (Kamalidehghan et al., 2020). Кроме того, нормальный паттерн экспрессии микроРНК в сперме имеет особое значение в контроле транскриптомного гомеостаза зиготы (Yuan et al., 2016; Guo et al., 2017). Важно, что измененный паттерн экспрессии микроРНК в сперме может быть передан потомству (Godia et al., 2018).

Другой класс малых некодирующих РНК, обильно представленный в сперматозоидах – это piwiРНК. Данный тип РНК обнаруживаются преимущественно в клетках зародышевой линии и в сперматозоидах; они несколько длиннее, чем микроРНК (26–32 нуклеотида). Биогенез piwiРНК до конца не изучен. Основная функция, которую выполняет этот класс молекул, действуя совместно с белками PIWI, по которым они получили свое название – это посттранскрипционный сайленсинг транспозонов (Czech et al., 2108; Ozata et al., 2019). Считается, что piwiРНК могут выполнять какие-то регуляторные функции, однако точные механизмы этого остаются неизвестными.

Выраженные статистически значимые отличия содержания в сперме микро- и piwiРНК мы обнаружили у самцов с моделированным ПТСР при сравнении их с группой контроля. Дифференциальная экспрессия была выявлена для 27 piwiРНК и для 77 микроРНК. В наибольшей степени (более чем в 3 раза) была повышена экспрессия микроРНК rno-miR-375-3p, rno-miR-106b-3p, rno-let-7a-5p, rno-let-7d-5p; среди микроРНК с наиболее значимым снижением экспрессии можно выделить rno-miR-539-3p, rno-miR-142-5p, rno-miR-207, rno-miR-503-3p (см. табл. 1). Различия между группой ДПС и контрольной группой были крайне незначительными. Достоверные отличия были выявлены только для двух piwiРНК (rno_piR_019288 и rno_piR_016741), экспрессия которых была повышена в группе ДПС. Стоит заметить, что результаты этой группы оказались весьма неоднородными (рис. 2). Два образца (Х9 и Х10) по паттерну экспрессии коротких РНК напоминали образцы группы контроля, а остальные три образца были похожи на группу с моделированным ПТСР.

Нельзя исключить того, что при действии стресса в парадигме выученной беспомощности не все самцы развивают классическое ДПС, и без дополнительного контроля не только уровня кортикостерона в крови, но и какого-то еще признака из ДПС, например, изменений поведения стрессированных самцов, нам не удалось создать однородную группу экспериментальных животных. С другой стороны, мы показали ранее, что эффекты отцовской психопатологии значительно менее выражены в группе с ДПС, и возможно, что при стрессовом воздействии такого рода изменение экспрессии коротких РНК в сперме может иметь вероятностный характер. В целом, ПТСР-подобное состояние самцов оказывает несомненное воздействие на паттерн экспрессии коротких РНК в сперматозоидах, в то время как влияние ДПС отца на этот показатель нуждается в уточнении.

Ранее в ряде исследований других авторов были предприняты попытки оценить влияние стресса самцов на содержание в сперматозоидах некоторых микроРНК. Так, в одном из исследований, (Rogers et al., 2013), с использованием метода ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ПЦР-РВ-ОТ) авторы обнаружили в сперме самцов мышей, подвергнутых хроническому умеренному стрессу в период сперматогенеза, повышение содержания 9 микроРНК (miR29-а, miR30-a, miR30c, miR32, miR193, miR204, miR375, miR532-3p, miR698). В другой работе, в которой изучали последствия хронического введения самцам мышей кортикостерона, показано увеличение в сперме содержания других микроРНК (miR98, miR144, miR190b) (Short et al., 2016). В иссследовании с помощью NGS экспрессии микроРНК в сперме взрослых мышей, подвергнутых длительному отъему от матери, авторы обнаружили повышение в ней miR-200b-3p, miR-672-5p, miR-375-3р, miR-375-5р, miR-46-5p (Gapp et al., 2014).

Следует отметить, что эти исследования были проведены на мышах, геном которых аннотирован гораздо лучше, чем у крыс, а авторы использовали различные системы анализа экспрессии коротких РНК (ПЦР-РВ-ОТ и NGS). Тем не менее, мы обнаружили частичное совпадение полученных нами результатов с этими данными из литературы. Так, по нашим данным, в наибольшей степени в сперме самцов с ПТСР-подобным состоянием увеличена экспрессия miR-375-5р, что было выявлено и в упомянутых выше работах (Rogers et al., 2013; Gapp et al., 2014). Повышение экспрессии miR-30 (в нашей работе, прежде всего, rno-miR-30d-5p) тоже было отмечено другими авторами (Rogers et al., 2013). Таким образом, несмотря на различия модельных объектов, используемых типов стрессовых воздействий и других деталей, изменение экспрессии некоторых микроРНК при отцовском стрессе может носить универсальный характер.

Список некоторых из предполагаемых генов-мишеней для микроРНК, экспрессия которых изменяется в сперматозоидах самцов с моделированным ПТСР, представлен в табл. 2. Анализируя возможные мишени, мы выделили две группы генов, которые, с нашей точки зрения, представляют особый интерес. Это, во-первых, гены, продукты которых участвуют в метилировании ДНК (Dnmt3a), модификациях гистонов через метилирование и деацетилирование (Setd5, Hdac1, Mllt10) и в регуляции РНК-интерференции (Tnrc6b, Mtdh). Для нашего исследования эти гены представляют значительный интерес, потому что все они вовлечены в гипотетические механизмы передачи отцовских эффектов потомству, а установленные в гаметах или в раннем эмбрионе эпигенетические метки, влияющие на их работу, способны привести к очень широкому спектру последствий.

Другую группу, выделенную нами, составили гены, связанные с функционированием инсулиноподобного фактора роста 2 (Igf2, Igf2bp2, Igf2r). Ранее мы показали, что экспрессия гена Igf2 изменена в ЦНС у потомства самцов с ПТСР-подобным состоянием (Ordyan et al., 2020; Ордян и др., 2021а, 2021б). В их регуляции задействованы многочисленные микроРНК семейств let-7, а также miR-30 и miR-185. Мы обнаружили кооперативное повышение экспрессии микроРНК семейства let-7, которое может иметь широкий спектр последствий, так как эти молекулы вовлечены в регуляцию гомеостаза глюкозы и чувствительности к инсулину, а также в регуляцию метилирования гистонов через ген Mllt10. Известно, что повышенная экспрессия микроРНК из семейства let-7 у мышей снижает размер тела и его массу вследствие уменьшения массы жира и ухудшении толерантности к глюкозе (Frost et al., 2011). В свою очередь, мы выявили ранее торможение соматического развития в ранний неонатальный период у потомков отцов с моделированным ПТСР (Ordyan et al., 2021). Вопрос о том, может ли изменение экспрессии микроРНК семейства let-7 в сперматозоидах самцов оказать влияние на соматическое развитие потомков, остается открытым и нуждается в дальнейшем исследовании. Принципиальная возможность влияния микроРНК, введенных в зиготу, на фенотип потомков, была доказана (Rodgers et al., 2015).

Таким образом, мы показали, что ПТСР-подобное состояние самцов, которое моделировали в парадигме “стресс−рестресс”, влияет на спектр малых РНК (микроРНК и piwiРНК) в сперме. Выявленные отдельные совпадения с изменениями спектра коротких РНК у других авторов при использовании других моделей стрессовых воздействий и других видов животных и человека свидетельствует об универсальном характере изменения экспрессии некоторых микроРНК вследствие отцовского стресса. Дальнейшие исследования в этом направлении, в том числе с использованием спермы человека, могут способствовать выявлению специфических биомаркеров в сперме, которые будут свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе для здоровья потомства и смогут служить диагностическим критерием нежелательности зачатия при воздействии стрессов на отца.