Цитология, 2023, T. 65, № 1, стр. 39-53

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Реактивы и материалы. Использовали: культуральные среды IMDM, RPMI-1640, DMEМ, термически инактивированную эмбриональную сыворотку телят (FBS) и раствор антибиотиков-антимикотиков (пенициллин, стрептомицин, амфотерицин) (GIBCO, Life Technologies, США), GlutaMAX^TM (GIBCO, Invitrogen, Франция), раствор йодистый пропидий (BD Pharmingen Apoptosis Detection Kit; BD Biosciences, США), натрий-фосфатный буфер (PBS), 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид (МТТ), форбол-12-миристат 13-ацетат (PMA; Sigma-Aldrich, США), H₂DCFDA и StemPro™ Accutase (Thermo Fisher Scientific, США), красители цитоплазмы Cell Tracker Green и Cell Tracker Red (Life Technologies, США), ДМСО (Реахим, Москва, Россия), флаконы для культивирования с площадью поверхности 25 см² (TPP, Швейцария), 96-луночные планшеты и 6-луночные планшеты (Thermo Scientific, Япония), электронные планшеты E-планшеты RTCA (ASEA Biosciences, США), набор реагентов Griess Reagent System (Promega, США).

Оборудование. Использовали: центрифугу Minispin (Eppendorf, Германия), СО₂-инкубатор (Heraeus, Германия), инвертированный флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti2 (Nikon Corporation, Япония), систему iCELLigence Real Time Cell Analyzer (RTCA; ACEA Biosciences, США), проточный цитометр BD FACSCantoII (BD Biosciences, США), многоканальный спектрофотометр (Berthold Technologies, Германия).

Клеточные линии и их культивирование. Клеточная линия MCF7-EGFR была получена в лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН (Новосибирск, Россия) методом ретровирусной трансдукции как описано (Troitskaya et al., 2021).

Клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF7 (ACC 115, DSMZ, Германия) и эпителиальные клетки молочной железы MCF10A (ATCC CRL-10317; Манасас, США) выращивали в среде IMDM, клетки острой моноцитарной лейкемии THP-1 (из коллекции культур клеток позвоночных ИНЦ РАН, Санкт-Петербург, Россия) культивировали в среде RPMI-1640, клетки MCF7-EGFR выращивали в среде DMEM в присутствии 10% FBS, 2 мМ L-глутамина и 1%-ного раствора антибиотиков-антимикотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина сульфата, 0.25 мкг/мл амфотерицина) при температуре 37 ± 1°С в атмосфере CO₂ (5.0 ± 0.5%).

Для пассирования сфероиды MCF7-EGFR размером более 500 мкм диссоциировали до единичных клеток добавлением реактива StemPro™ Accutase как рекомендовано производителем, после чего клетки высаживали в 96-луночные или 24-луночные планшеты по 1 × 10⁴ или 4 × 10⁴ клеток на лунку соответственно и культивировали в стандартных условиях в течение 5–7 сут до образования открепленных сфероидов.

Холодная плазменная струя (ХПС). В работе для генерации плазменной струи использовали источник синусоидального напряжения с диапазоном частоты f ≈ 13–40 кГц и напряжением U = 3.5–5 кВ. Газоразрядная ячейка выполнена в виде коаксиального диэлектрического канала длиной 100 мм с внутренним диаметром 8 мм, на выходе из которого размещен диэлектрический капилляр с диаметром 2.3 мм, формирующий сопло. Внутри канала соосно размещен стержневой электрод длиной 50 мм и диаметром 2 мм. У сопла диэлектрического канала расположен кольцевой заземленный электрод, который вместе с внутренним потенциальным электродом формирует разрядную зону. Инертный газ поступает в диэлектрический канал плазменного источника со скоростью 3–9 л/мин и распространяется до облучаемой мишени. Дополнительный заземленный металлический электрод располагался на расстоянии 2.5 см от сопла устройства перпендикулярно направлению распространения струи.

При прямой обработке клеток, культивируемых в 100 мкл среды, после облучения добавляли 100 мкл свежей среды в лунки и продолжали культивирование в стандартных условиях. В экспериментах с добавлением облученной культуральной среды (СО-ХПС), ее объем составлял 1/2 финального объема среды в лунке.

Анализ пролиферации клеток в режиме реального времени на приборе iCELLigence. Определение жизнеспособности клеток в режиме реального времени в системе iCELLigence проводили как описано ранее (Нуштаева и др., 2022). Клеточный индекс рассчитывали для каждой лунки E-планшета с помощью программного обеспечение RTCA 1.2 (Roche Diagnosis, Франция), генерирующего кривые роста клеток. В каждом эксперименте использовали не менее 3-х экспериментальных образцов, эксперимент повторяли не менее 2-х раз.

Анализ жизнеспособности клеток сфероидов методом проточной цитометрии. Сфероиды MCF7-EGFR культивировали в лунках 96-луночного планшета в объеме 100 мкл культуральной среды, облучали ХПС, после чего добавляли 100 мкл свежей среды и продолжали культивирование. В случае обработки СО-ХПС, к сфероидам добавляли 100 мкл облученной среды и продолжали культивирование в стандартных условиях. По окончании культивирования сфероиды разрушали добавлением раствора StemPro™ Accutase, открепленные клетки окрашивали раствором йодидистого пропидия в соответствии с протоколом производителя и анализировали на проточном цитометре не менее 1 × 10⁵ событий в образце.

Анализ уровня внутриклеточных активных форм азота и кислорода. Молекула АФК-зависимого флуоресцентного зонда H₂DCFDA способна проникать через клеточную мембрану, где в неизменном состоянии не флуоресцирует при облучении светом с длиной волны λ = 485 нм. Под действием внутриклеточных эстераз происходит деацетилирование H₂DC-FDA до H₂DCF, который накапливается в клетке, а его дальнейшее окисление под действием внутриклеточных АФК и АФА способствует превращению его в 2',7'-дихлорофлуоресцеин (DCF^–), обладающий флуоресценцией (λ_em = 530 нм) при возбуждении светом с характеристической длиной волны λ_ex = 485 нм (Yazdani, 2015). Концентрация DCF^– в клетке пропорциональна концентрации АФК и АФА, которые, таким образом, могут быть определены методами флуоресцентного анализа.

К сфероидам MCF7-EGFR, культивируемым в стандартных условиях в лунках 96-луночного планшета, добавляли раствор красителя H₂DCFDA (10 мкМ), культивировали в стандартных условиях 30 мин, после чего облучали ХПС или добавляли СО-ХПС. Через 6 ч после облучения, изменения флуоресценции H₂DCFDA визуализировали в клетках сфероидов с помощью инвертированного микроскопа в канале FITC. Полуколичественную оценку изменения активных форм азота (АФА) и кислорода (АФК) в клетках проводили, используя проточный цитометр (λ = 535 нм) после разрушения сфероидов добавлением StemPro™ Accutase.

Определение концентрации ионов нитрита в культуральной среде. Для определения концентрации ионов нитрита $\left( {{\text{NO}}_{2}^{ - }} \right)$ в культуральной среде отбирали аликвоты среды по 25 мкл и определяли концентрацию ${\text{NO}}_{2}^{ - }$ методом Грисса с использованием коммерчески доступного набора реагентов Griess Reagent System. Оптическое поглощение измеряли на спектрофотометре при длине волны λ = 540 нм. Используя стандарты с известной концентрацией ${\text{NO}}_{2}^{ - },$ строили калибровочную кривую. По трем независимым повторам рассчитывали средние значения концентрации нитрит-ионов в образцах и стандартные отклонения.

МТТ-тест. Анализ жизнеспособности клеток методом МТТ-теста проводили, как уже описано (Bagamanshina et al., 2019) через 24 ч после облучения или добавления облученной среды. Среду в лунках 96-луночного планшета с культивируемыми клетками заменяли на среду RPMI-1640 без сыворотки, содержащую 0.25 мг/мл МТТ-реагента и выдерживали 4 ч при 37°С. Далее среду удаляли, а образовавшиеся кристаллы формазана растворяли добавлением 100 мкл ДМСО. Оптическую плотность раствора в лунках измеряли на многоканальном спектрофотометре при λ = 570 нм.

Анализ фагоцитоза сфероидов активированными клетками THP-1. К клеткам THP-1, растущим в среде RPMI-1640 в 6-луночном планшете (5 × 10⁵ кл./лунку), добавляли 50 нМ PMA для индукции дифференцировки в M1-макрофагальный фенотип и продолжали культивирование в течение 48 ч. По окончании культивирования клетки THP-1 окрашивали добавлением флуоресцентного реагента Cell Tracker Green (1 мкМ) при 37°С течение 30 мин, после чего культуральную среду удаляли, клетки дважды промывали добавлением 1 мл PBS. Аналогичным образом предварительно окрашивали сфероиды MCF7-EGFR раствором Cell Tracker Red (10 мкМ). К окрашенным культивируемым THP-1 добавляли образцы окрашенных сфероидов MCF7-EGFR в примерном соотношении клеток и сфероидов 30 : 1 и продолжали совместное культивирование в течение 2 ч в стандартных условиях. Сфероиды и клетки в лунках анализировали с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа. Для количественной оценки активности макрофагов проводили подсчет общего количества сфероидов размером более 40 нм (в месте с наибольшем диаметром) в поле зрения микроскопа площадью 0.4 мм² и рассчитывали долю сфероидов, атакованных макрофагами, как отношение числа сфероидов с зеленым сигналом к общему числу сфероидов. Данные представляли, как среднее значение и его стандартное отклонение для трех независимых полей зрения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение параметров ХПС, индуцирующих преимущественную гибель опухолевых клеток. Индукция гибели раковых клеток зависит от интенсивности взаимодействия ХПС с биологическим объектом, которая, в свою очередь, определяется частотой и амплитудой приложенного напряжения, расстоянием до объекта, скоростью и типом рабочего газа, а также влажностью воздуха (Schweigert et al., 2021). При неизменности указанных параметров интенсивность воздействия может изменяться в зависимости от продолжительности облучения или при введении дополнительных компонентов в систему.

Условия облучения ХПС, при котором гибели подвергаются преимущественно опухолевые клетки, оптимизировали по продолжительности воздействия на примере пары культур единого гистологического происхождения: аденокарциномы молочной железы человека MCF7 и клеток нетрансформированной молочной железы MCF10A (Qu et al., 2015). Жизнеспособность клеток анализировали в режиме реального времени с использованием прибора iCelligence и методом МТТ (рис. 1). Облучение проводили с использованием дополнительного заземленного электрода (так называемой заземленной подложки, или без нее). При сравнении кривых роста опухолевых и нормальных клеток после облучения ХПС можно видеть, что цитотоксический эффект существенно зависел от длительности облучения клеток MCF7 (рис. 1а): облучение в течение 2 мин снижало долю живых клеток (индекс пролиферации, см. рис. 1) на 75% относительно необработанного контроля; в то же время, облучение эпителиальных клеток молочной железы MCF10A в течение 1 и 2 мин приводило к незначительному торможению роста клеток относительно необлученного контроля (рис. 1б) – на 8 и 30% соответственно. Полученные результаты позволяют считать облучение в течение 1 мин специфичным для индукции гибели опухолевых клеток данного типа и при выбранных параметрах генерации ХПС.

Ранее нами было показано, что введение в систему заземленной металлической подложки (ЗМП), помещенной под культуральным планшетом с растущими клетками, усиливало гибель облученных опухолевых клеток (Schweigert et al., 2019). На моделях MCF7 и MCF10A использование ЗМП также усиливало цитотоксический эффект ХПС (рис. 1). При длительности облучения 2 мин с использованием ЗМП наблюдали полное подавление жизнеспособности как опухолевых, так и здоровых клеток, поэтому для достижения относительной специфичности ХПС в отношении опухолевых клеток, необходимо снижать продолжительность воздействия. Снижение времени облучения с ЗМП до 30 с позволила добиться преимущественной гибели опухолевых клеток (рис. 1в).

Таким образом, определено характерное время преимущественного цитотоксического действия ХПС в отношении клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF7 с использованием ЗМП и без нее.

Помимо прямого воздействия, когда облучению подвергают непосредственно растущие клетки, в ряде работ показано цитотоксическое действие на клетки культуральной среды, предварительно облученной ХПС, которую называют “активированной средой”, а мы обозначаем ее СО-ХПС (Tanaka et al., 2021). Высокоэнергетичные электроны в плазменной струе за счет неупругих столкновений с молекулами кислорода, азота и воды генерируют химически активные радикалы и включают цепочки химических реакций в смеси гелия с воздухом в газовой фазе и на поверхности жидкости с образованием основных молекулярных триггеров гибели клеток – АФК и АФА, которые сохраняются при переносе такой СО-ХПС к растущим клеткам (Boehm et al., 2016).

Определение цитотоксического воздействия СО-ХПС в отношении клеток MCF7 и MCF10A проводили с помощью МТТ через 24 ч после добавления облученной среды (ее объем составлял 1/2 финального объема среды в лунке) (рис. 2). Можно видеть, что снижение жизнеспособности при культивировании клеток в присутствие СО-ХПС было сравнимо с таковым значением для клеток, подвергнутых прямому облучению ХПС (рис. 1). Онкотрансформированные клетки MCF7 также оказались более чувствительны к цитотоксическому воздействию СО-ХПС, чем MCF10A. Таким образом, при одинаковых условиях воздействия, опухолевые клетки MCF7 были чувствительны не только к прямому к воздействию ХПС, но и к СО-ХПС.

Анализ изменения содержания АФА в культуральной среде при культивировании клеток в присутствии СО-ХПС. Использовали реактив Гриса, позволяющий оценить концентрацию ионов нитрита. Культуральную среду обрабатывали ХПС в течение 2 или 5 мин в лунках 96-луночного планшета и непосредственно после облучения добавляли ее (СО-ХПС) к культивируемым клеткам MCF7, после чего продолжали культивирование в стандартных условиях. Через 30 мин, 1 и 6 ч после добавления СО-ХПС отбирали аликвоты среды и определяли концентрацию ${\text{NO}}_{2}^{ - }.$ В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду от клеток, культивируемых в стандартных условиях. В качестве положительного контроля использовали образцы облученной среды, разбавленной аналогично добавляемой к клеткам и инкубированной в аналогичных условиях. Можно видеть (рис. 3), что ХПС-обработка среды приводит к увеличению концентраций ионов нитрита до 10 раз при 2-минутном облучении и до 30 раз при 5-минутном. Таким образом, наблюдаемое увеличение ионов нитрита в культуральной среде при увеличении длительности облучения наиболее вероятно вносит вклад в цитотоксическую активности СО-ХПС.

Влияние температуры хранения облученной среды (СО-ХПС) на ее цитотоксическую активность. Отметим, что короткоживущие активные кислородные и азотные радикалы распадаются, либо вступают в реакцию с молекулярными мишенями в клетке и образуют вторичные долгоживущие радикалы. Такие долгоживущие способны сохранятся в течение времени при оптимальных условиях хранения, что должно отражаться на цитотоксической активности СО-ХПС. Для анализа изменения свойств облученной культуральной среды при хранении, образцы СО-ХПС разделяли на аликвоты и помещали на хранение при температуре 4 и −20°С.

Для анализа цитотоксических свойств СО-ХПС культивирование клеток MCF7 проводили в присутствии СО-ХПС, хранившейся при указанных температурах от 1 до 168 ч. В образцах “контроль” использовали необлученную среду после хранения при тех же температурах в течение 48 ч. Точка 0 ч на рис. 4 отражает образец среды, добавленный к клеткам после облучения без хранения. Жизнеспособность клеток оценивали MTT-тестом через 24 ч после замены обычной культуральной среды на облученную. Можно видеть (рис. 4), что СО-ХПС, хранившаяся при 4°С сохраняет свою цитотоксическую активность в течение 48 ч, а хранившаяся при −20°С – только 24 ч. Таким образом, для среды, обработанной ХПС, предпочтительно хранение при 4°С.

Изменение морфологии сфероидов и жизнеспособности клеток в составе сфероидов при прямом облучении ХПС и в присутствии СО-ХПС. Полученные данные о чувствительности клеток MCF7 к прямому и опосредованному воздействию ХПС были важны для перехода исследования к модели многоклеточных сфероидов MCF7-EGFR, в которой также оценивали воздействие прямого и опосредованного влияния ХПС. В отличие от клеток, культивируемых в монослое, сфероиды приближены к многоклеточной структуре организма. В экспериментах с модельными сфероидами использовали плазменную струю в гелии, как более применимую для экспериментов на животных. Аргон и гелий имеют разные физические свойства, что сказывается на свойствах самой плазменной струи и на плазмохимии у поверхности биомишени. При сопоставимых напряжениях струи (4–5 кВ), токи ХПС в аргоне, в отличие от токов в гелии, достигают десятков мА, что некомфортно и опасно для живых организмов с точки зрения электробезопасности. Ранее мы определили, что увеличение напряжения струи в гелии с 4.5 до 4.9 кВ ведет к увеличению температуры струи с 35 до 40°С при частоте 13 кГц, а при частоте 22 кГц температура струи становится горячей (65°С) уже при 4.5 кВ (данные готовятся к публикации). Поскольку разрабатываемый подход имеет целью исследование метода для внедрения его в клиническую практику, температура струи является критическим параметром. Поэтому, в экспериментах со струей в гелии использовали напряжение 4.5 кВ и частоту 13 кГц.

На рис. 5 представлен характерный вид сфероидов до облучения и через 6 и 24 ч после облучения. Можно видеть, что через 24 ч после облучения происходит разрушение крупных сфероидов до сфероидов более мелких и до отдельных клеток, как при прямом облучении, так и при культивировании с СО-ХПС.

Изменение жизнеспособности клеток сфероидов в ответ на облучение ХПС оценивали по изменению доли клеток в состоянии позднего апоптоза (некроза). Для этого применяли метод проточной цитометрии с окрашиванием йодистым пропидием (PI). PI проникает в ядра гибнущих клеток с поврежденной плазматической мембраной, и такие клетки можно визуализировать флуоресцентными методами анализа. Сравнение доли PI-положительных клеток (%), подвергнутых прямому облучению и СО-ХПС при выбранных условиях показало, что культивирование сфероидов с СО-ХПС вызывало несколько больший цитотоксический эффект: 78% клеток были PI-положительными против 70% при прямой обработке ХПС (рис. 6). В контрольных необлученных образцах доля PI-положительных клеток была высокой и составляла до 50%. Такую высокую гибель клеток можно объяснить как особенностями подготовки образцов из сфероидов, так и особенностями роста самих сфероидов.

Известно, что для крупных сфероидов характерно наличие некротического “ядра”, обусловленного сниженной доступностью кислорода и питательных веществ для центральных клеток сфероида (Laschke, Menger, 2017; Verjans et al., 2018). Такая особенность сфероидов подчеркивает их сходство с природными солидными опухолями, в которых даже без воздействия химио- или лучевой терапии часто наблюдается некроз внутренней области опухоли. Во-вторых, обработка сфероидов раствором Accutase для диссоциации на отдельные клетки с последующим мягким пипетированием является достаточно травмирующей обработкой для клеток сфероидов. Тем не менее, поскольку подготовку проб для анализа проводили для контрольных и облученных клеток единообразно, разница в доле PI-положительных клеток в контрольных и облученных образцах может рассматриваться как появление клеток, погибающих от воздействия ХПС.

Содержание АФК в клетках сфероидов, подвергнутых прямому или опосредованному воздействию ХПС. Поскольку основными индукторами гибели клеток при воздействии холодной плазмы являются АФК и АФА (Vandamme et al., 2012), было важно оценить изменение содержания АФК в клетках сфероидов MCF7-EGFR, подвергнутых прямому или опосредованному воздействию ХПС. Для этого к облученным сфероидам или сфероидам, культивируемым с облученной средой, добавляли реагент H₂DCFDA и анализировали сфероиды методом флуоресцентной микроскопии.

Мы обнаружили, что как при прямом облучении ХПС, так и при воздействии СО-ХПС, в образцах сфероидов значительно усиливался зеленый сигнал, указывающий на присутствие АФК в клетках. В качестве положительного контроля использовали сфероиды, к которым добавляли 5%-ный раствор H₂O₂, который стимулирует конвертацию H₂DCFDA в DCF^–. Анализ показал, что при опосредованном способе воздействия ХПС доля клеток сфероидов с увеличенным содержанием АФК была незначительно больше, чем при прямом воздействии (рис. 7) при используемых условиях облучения.

Таким образом, сфероиды MCF7-EGFR чувствительны как к прямому облучению ХПС, так и к воздействию СО-ХПС, и эти воздействия сопровождаются увеличением уровня активных форм кислорода внутри клеток.

Захват фагоцитирующими клетками сфероидов, облученных ХПС. Для того, чтобы оценить возможность захвата облученных сфероидов клетками с фагоцитарной активностью, сфероиды предварительно окрашивали флуоресцентным красителем цитоплазмы, подвергали прямому облучению ХПС, после чего через 24 ч добавляли к культивируемым активированным моноцитам ТНР-1. Активированные моноциты характеризуются фагоцитарной активностью, а их окрашивание флуоресцентным красителем позволяет визуализировать захват флуоресцентного субстрата методом флуоресцентной микроскопии (рис. 8а). В контрольных образцах заметны крупные сфероиды без атаки фагоцитами (рис. 8б). Сопоставление наложения изображений в флуоресцентных каналах и в проходящем свете показало, что в стадии активного фагоцитоза происходит потеря красного сигнала от сфероидов в результате полного экранирования зелеными макрофагами, покрывающими сфероиды (рис. 8в, г). Подсчет на основании данных рис. 8 показывает, что облучение ХПС увеличивает долю сфероидов, которые активно захватываются макрофагами, с 59. 6 ± 12.0 до 86.2 ± 4.9% (рис. 8).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время исследование применения ХПС в отношении солидных опухолей человека проводят не только in vitro и на животных, но и в рамках ранних стадий клинических испытаний на пациентах. В базе данных клинических исследований (www.clinicaltrials.gov) официально зарегистрированы два исследования, в которых тестируют противоопухолевое действие ХПС в отношении солидных опухолей.

Первое из них (NCT04267575) было начато в 2019 г. и предполагает исследование безопасности применения ХПС для облучения операционного поля после удаления крупных солидных новообразований при IV-ой стадии рака молочной железы, предстательной железы, поджелудочной железы, немелкоклеточного рака легкого, рака яичников и других с окончанием исследований в 2023 г. Во втором исследовании (NCT03218436) холодная аргоновая плазма была использована для облучения цервикальной интраэпителиальной неоплазии, которая классифицируется как предраковое состояние (Basu et al., 2018). Облучение проводили в процессе кольпоскопического исследования без анестезии и оценивали ремиссию через 3 и 6 мес после облучения, но итоговые результаты исследования пока не представлены. Таким образом, в настоящее время нет доступных данных клинических исследований о противоопухолевой активности ХПС на людях. Поэтому исследование эффективных режимов облучения, механизмов действия, селективности облучения на клеточных моделях, приближенных к опухолям, не теряет своей актуальности.

Тем не менее, доклинические исследования ХПС позволили сформировать представления о том, какие опухоли могут быть чувствительны к облучению. Основными потенциальными мишенями струи холодной плазмы будут опухоли, для которых не предложено эффективной таргетной терапии, опухоли, залегающие неглубоко в тканях, изолированные, устойчивые к радиотерапии, рецидивирующие и метастазирующие. Эти опухоли должны быть удалены хирургически, а обработке ХПС должно подвергаться операционное поле, что позволяет преодолеть лимит распространения генерируемых активных частиц вглубь тканей (Dai et al., 2018). Позитивный ответ реализуется за счет селективности по отношению к опухолевым клеткам, стимулированию иммунной системы, элиминации стволовых опухолевых клеток. Селективное воздействие достижимо как при применении таргетных препаратов, так и при оптимизации условий воздействия – концентрации препарата, времени воздействия и т.д. Поэтому оптимизация условий формирования ХПС и условия облучения ею клеток-мишеней направлены на определение диапазона цитотоксического воздействия на опухолевые клетки без повреждения клеток здоровых. Для этого мы использовали пару клеточных культур – здоровых и опухолевых – одного гистологического происхождения: клетки аденокарциномы молочной железы MCF7 и MCF10A.

В качестве 3D-клеточной модели в работе использовали линию MCF7-EGFR, растущую преимущественно в виде сфероидов без использования матриксов и ростовых факторов. Культура клеток MCF7-EGFR была получена на основе клеток MCF7, в геном которых методом ретровирусной трансдукции была встроена последовательность, кодирующая полноразмерный белок EGFR (Troitskaya et al., 2021). Использование сфероидов MCF7-EGFR, растущих без гидрогелей и ростовых факторов позволило упростить систему оценки реакции клеток сфероидов на стимулы и не учитывать дополнительно эффекты от воздействия ХПС на гидрогели и факторы роста.

Обработку 2D- и 3D-клеточных моделей осуществляли двумя способами: прямым облучением, когда поток плазмы взаимодействовал со средой и растущими клетками, и непрямым, при котором к клеткам добавляли предварительно облученную среду (СО-ХПС). Следует отметить, что при воздействии на клетки и сфероиды СО-ХПС исключаются физические эффекты воздействия ХПС, такие как электрическое поле и УФО.

В настоящее время описано сравнительно немного исследований по воздействию холодной плазмой на 3D-клеточные модели (Wiegand et al., 2016; Wanigasekara et al., 2022). Поскольку 3D-модели более полно имитируют рост опухоли и ее архитектуру по сравнению с клеточными моделями 2D, не вызывает сомнения важность исследования эффектов ХПС в клеточных 3D-моделях. Мы наблюдали, что как при прямом облучении, так и при воздействии СО-ХПС на сфероиды происходит деструкция сфер до единичных клеток. Такое наше наблюдение хорошо согласуется с результатами других авторов о том, что одним из эффектов обработки клеток холодной плазмой является снижение их адгезионной, миграционной и инвазивной способностей (Semmler et al., 2020). Предполагают, что ХПС стимулирует негативную регуляцию интегринов – белков, располагающихся на поверхности клеток и формирующих межклеточные контакты (Shashurin et al., 2010). Наиболее вероятно, что наблюдаемая нами деструкция сфероидов также обусловлена уменьшением интегринов на поверхности облученных клеток и ослаблением межклеточных контактов в сфероиде.

АФК и АФА являются продуктами жизнедеятельности клетки, которые постоянно образуются в ходе метаболизма и участвуют в регуляции сигнальных каскадов. При этом известно, что в опухолевых клетках концентрации АФК и АФА повышены в результате более интенсивного метаболизма (Arfin et al., 2021). Как уже отмечалось ранее, основной вклад в цитотоксическое действие ХПС вносят АФК и АФА (Graves, 2012; Yousfi et al., 2014). Идентификация и количественное определение конкретных активных частиц в биологических образцах затруднительно из-за большого их разнообразия и локализации. Поэтому применяют косвенные методы, основанные на окислительно-восстановительных превращениях молекул-индикаторов окислительного стресса, таких как H₂DCFDA.

Используя H₂DCFDA, мы показали, что воздействие СО-ХПС на сфероиды MCF7-EGFR вело к большему накоплению АФК в обработанных клетках, чем при прямом воздействии. Показано (Yousfi et al., 2014), что однократное добавление среды, облученной ХПС к сфероидам, образованным клетками карциномы головы и шеи FaDu, не вело к торможению роста сфероидов, но стимулировало открепление отдельных клеток от многоклеточной 3D-структуры, что хорошо согласуется с полученными нами данными. Цитотоксического воздействия в отношении сфероидов FaDu удалось добиться при многократном добавлении среды, облученной ХПС (Yousfi et al., 2014). Авторы предполагают, что низкая чувствительность к активированной среде при однократном добавлении объясняется резистентностью клеток FaDu к H₂O₂. Поскольку мы показали изменение относительного количества АФК после воздействия ХПС на сфероиды MCF7-EGFR, можно говорить о том, что это изменение опосредует цитотоксический ответ сфероидов MCF7-EGFR на ХПС-активированную среду и прямое облучение.

Для продвижения применения среды или биосовместимых жидкостей, облученных ХПС, в клинической практике, необходимо иметь представление об оптимальных условия хранения ХПС-обработанных жидкостей, при которых сохраняется их цитотоксическая активность. Было показано, что ХПС-обработанная среда сохраняла цитотоксическую и генотоксическую активность в течение 7 сут при хранении при 4 или −80°C (Chauvin et al., 2018). В качестве клеточной модели авторы использовали сфероиды HCT116 карциномы кишечника и диэлектрический барьерный разряд для генерации плазмы. Наиболее интересно, что хранение облученной среды при −20°С снижало ее цитотоксическую и генотоксическую активность, что хорошо согласуется с данными, полученными в нашей работе. Авторы показали, что при хранении облученной среды при 37 и при ‒20°C происходит разложение H₂O₂ (Chauvin et al., 2018). Тем не менее авторы не дают ответа, почему при промежуточной температуре 4°C такого разложения не происходит.

В качестве нашего собственного предположения, мы можем выдвинуть гипотезу о том, что при хранении в жидкости наиболее вероятно протекают несколько параллельных процессов. Можно предположить, что и при 4, и при –20°C происходит разложение как H₂O₂, так и других активных частиц, образуемых при воздействии ХПС на культуральную среду. В то же время, параллельно этому, при 4°C происходят реакции взаимодействия первичных активных частиц с компонентами среды с накоплением вторичных перекисных соединений, чего не происходит при –20°C. Накопление вторичных активных частиц обеспечивает цитотоксическое воздействие на клетки при добавлении такой среды. В свою очередь, можно предположить, что при −80°C замедляются химические реакции и лучше сохраняются первичные активные частицы. Точное выявление определенных АФК и АФА в облученной культуральной среде при хранении при разных температурах является отдельной научной задачей. Тем не менее, наши результаты и результаты других исследователей (Judée et al., 2016) показывают низкую эффективность хранения облученной среды при –20°C. Суммируя, можно сказать, что СО-ХПС может применяться как эффективный индуктор гибели опухолевых клеток, если ее хранить при 4 или −80°C.

Неэффективное удаление гибнущих опухолевых клеток фагоцитирующими клетками ведет к развитию воспалительных реакций. Мы показали, что при облучении сфероидов происходит активное поглощение облученных клеток макрофагами. Макрофаги реагируют на комбинацию молекулярных сигналов, испускаемых погибающими клетками, после чего происходит фагоцитоз. Ранее мы уже показали, что облучение опухолевых клеток ведет к активации в них сигналов, распознавемых фагоцитирующими клетками как сигналы “найди меня” и “съешь меня” (Troitskaya et al., 2020). Можно предположить, что в случае облучения ХПС солидных опухолей in vivo, также возможна деструкция опухоли на отдельные опухолевые клетки, в которых активируются процессы гибели, и они будут эффективно удаляться клетками иммунной системы с фагоцитарной активностью. Такое развитие событий на клеточном уровне препятствует процессам воспаления, что улушает ответ на терапию.

Таким образом, возможно достижение относительной селективной цитотоксической активности ХПС в отношении опухолевых клеток, в том числе в составе сфероидов.