Цитология, 2023, T. 65, № 1, стр. 3-10

РОЛЬ NOTCH В ПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) характеризуется прогрессирующим воспалительным процессом в бронхах с гиперплазией бокаловидных клеток и подслизистых желез, гиперсекрецией слизи, развитием эмфиземы легких, фиброзом и ограничением выдоха (Bagdonas et al., 2015; Wang et al., 2018; Agustí et al., 2020). Основной макромолекулярный компонент секрета бокаловидных клеток – гелеобразующий муцин 5АС, обеспечивающий мукоцилиарный клиренс и местную защиту дыхательных путей (Ostedgaard et al., 2017; Ma et al., 2018; Whitsett, 2018). Нарушение дифференцировки базальных клеток респираторного эпителия в бокаловидные, их метаплазия и избыточная функциональная активность приводят к обструкции дыхательных путей (Whitsett, 2018). Сигнальный путь Notch имеет ключевое значение в регуляции дифференцировки и секреторной функции бокаловидных клеток. Установлено, что добавление лиганда Notch к эксплантированным легким эмбрионов мышей сопровождается увеличением числа клеток, секретирующих муцин 5AC, а в присутствии ингибитора γ-секретазы – их уменьшением (Ostedgaard et al., 2017; Ma et al., 2018).

Методами иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализа серийных срезов образцов тканей легких курящих пациентов с ХОБЛ и тканей легких мышей Hoxa5^−/− (с мутацией гена Hoxa5), кодирующего дифференцировку эпителиальных клеток, продемонстрировано значительное увеличение экспрессии генов белков пути Notch – N1ICD и HEY2 в местах метаплазии бокаловидных клеток эпителия дыхательных путей (Boucherat et al., 2012). Введение ингибитора γ-секретазы ослабляет метаплазию бокаловидных клеток у мышей Hoxa5^−/− (Tsao et al., 2011). Напротив, снижение уровня экспрессии рецептора Notch-3, его лиганда DLL1 и мРНК-регулируемых белков HES5 и HEY1/2 эпителиальными клетками бронхов указывает на подавление передачи сигналов Notch у курящих пациентов с ХОБЛ (Kiyokawa, Morimoto, 2020).

Существенную роль в нормальном функционировании эпителия дистальных воздухоносных путей играет полифункциональная популяция булавовидных клеток. Они продуцируют компоненты сурфактанта, вырабатывают гликопротеины и ферменты, принимающие участие в инактивации поступающих с воздухом токсинов, служат источником для пополнения собственной популяции и популяции реснитчатых клеток (Целуйко и др., 2014). Установлено, что индуцированная экспрессия белка пути Notch N1ICD в эпителиальных клетках легких способствует метаплазии слизистой и уменьшению числа реснитчатых клеток. Напротив, подавление передачи сигналов Notch−Jagged1 или Notch−Jagged2 сопровождается трансдифференцировкой булавовидных клеток в реснитчатые клетки (Kared et al., 2006; Morimoto et al., 2010). Таким образом, Notch может стать потенциальной мишенью регуляции функциональной активности и дифференцировки секреторных и ресничатых клеток дыхательных путей при ХОБЛ.

Ведущую роль в патогенезе ХОБЛ играют воспаление, окислительный стресс и апоптоз клеток, индуцируемые в том числе сигаретным дымом. Установлено, что сигнальный путь, опосредованный Notch-1, защищает эпителиальные клетки от апоптоза (Luo et al., 2020). Так, в экспериментах на эмбрионах мышей с нокаутом гена рецептора Notch-1 регистрировали повышение опосредованного каспазой-3 апоптоза эндотелиальных клеток (Limbourg et al., 2005). Высокий уровень экспрессии Notch-1, напротив, защищал клетки от NF-κB-индуцированной апоптотической гибели (Qin et al., 2011).

В модели ХОБЛ in vitro, представленной микрососудистыми эндотелиальными клетками легких человека (Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells, HPMEC), обработанными 2.5%-ным экстрактом сигаретного дыма в течение 24 ч, продемонстрирована более низкая экспрессия рецептора Notch-1 и белков HES1 и HEY2. Корреляция высокого уровня экспрессии клетками HPMEC рецептора Notch-1 с устранением эффектов, индуцированных экстрактом сигаретного дыма, свидетельствует о значительной роли этого рецептора в регуляции апоптоза, воспаления и окислительного стресса (Luo et al., 2020).

Окислительный стресс способен инициировать механизм гибели клеток как по внешнему, так и по внутреннему пути (Sinha et al., 2013). В эксперименте на культуре первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека установлено, что подавление сигнального каскада Notch ингибитором γ-секретазы приводит к повышению образования активных форм кислорода (Cai et al., 2014). Восстановление активности γ-секретазы коррелирует с низким уровнем окислительного стресса (Small et al., 2014).

Большую роль в регенерации альвеолярной выстилки, синтезе и секреции сурфактанта играют пневмоциты 2-го типа. На долю этих клеток приходится не более 10% поверхности альвеол, они активно пролиферируют и трансформируются в пневмоциты 1-го типа, обеспечивающие диффузию газа между просветом альвеол и кровью в капиллярах (Ишутина, 2021). В эксперименте на трансгенных мышах продемонстрировано, что конститутивная экспрессия рецептора Notch-3 в эпителиальных клетках легких сопровождается нарушением образования пневмоцитов 1-го типа (Zong et al., 2016).

РОЛЬ NOTCH В ПАТОГЕНЕЗЕ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

Бронхиальная астма – хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, характеризующееся гиперреактивностью и ремоделированием бронхов (Huang et al., 2019b; Tindemans et al., 2020; Nie et al., 2021; Yu, Li, 2022). Центральную роль в развитии и прогрессировании астмы отводят IgE-зависимой активации тучных клеток, инфильтрации в слизистую оболочку дыхательных путей эозинофилов и активированных Т-лимфоцитов-хелперов типа 2 (Th2) (Huang et al., 2019a; Nie et al., 2021; Yu, Li, 2022). Результаты исследований указывают на определяющее значение сигнального пути Notch в направлении дифференцировки лимфоцитов Тh2 при бронхиальной астме (Huang et al., 2019b; Nie et al., 2021; Yu, Li, 2022). У больных бронхиальной астмой регистрируется более высокий уровень экспрессии рецепторов Notch на CD4⁺ Т-клетках памяти и Th2-лимфоцитах, чем у здоровых доноров (Huang et al., 2019a; Tindemans et al., 2020). Установлено, что Jagged – лиганд Notch – и регулируемый им транскрипционный белок GATA3 являются основными факторами Notch-опосредованного формирования популяции Th2-клеток (Tindemans et al., 2020; Yu, Li, 2022).

Участие сигнального пути Notch в патогенезе аллергического воспаления дыхательных путей доказано в экспериментах. Так, у мышей линий BALB/c и C57BL/6 в модели бронхиальной астмы, индуцированной овальбумином, регистрируется увеличение экспрессии в ткани легких рецепторов Notch (Huang et al., 2019b; Hua et al., 2019; Nie et al., 2021), а также мРНК фактора транскрипции HES1 и белка внутриклеточного домена NICD (Zeng et al., 2019). В жидкости бронхоальвеолярного лаважа экспериментальных животных отмечается увеличение доли Т-лимфоцитов-хелперов типа 17 (Th17) и снижение числа иммуносупрессорных Т-регуляторных клеток (Treg), в сыворотке крови регистрируется повышение концентрации интерлейкина (IL) 17 и снижение уровня IL-10, в ткани легких увеличивается экспрессия мРНК лигандов Notch – Jagged1 и Delta4 (He et al., 2021). Нарушение передачи сигналов Notch с помощью ингибитора γ-секретазы сопровождается уменьшением экспрессии мРНК Notch1, HES1, NICD и лиганда Jagged1, дисбаланса популяций лимфоцитов Th17/Treg, уровня IL-17 (Huang et al., 2019a; Zeng et al., 2019; He et al., 2021), продукции Th2-цитокинов (IL-4, IL-5, IL-13) и аллерген-специфических IgE, а также уменьшением эозинофильной инфильтрации, метаплазии бокаловидных клеток и гиперреактивности дыхательных путей (Huang et al., 2019a, 2019b; Kiyokawa, Morimoto, 2020; Tindemans et al., 2020).

Исследования роли дендритных клеток и популяции Тreg в патогенезе бронхиальной астмы указывают на протективное значение сигнального пути Notch (Lee et al., 2018; Lin et al., 2019; Morianos, Semitekolou, 2020). Так, введение мышам линий BALB/c и C57BL/6 с овальбумин-индуцированной астмой дендритных клеток, экспрессирующих Notch-лиганд DLL1 или Jagged1, приводило к снижению продукции IgE, гиперреактивности дыхательных путей и секреции цитокинов Th2-типа (IL-4, IL-5, IL-13). Количество Th1-лимфоцитов и продукция интерферона-γ, напротив, увеличивались (Lee et al., 2018; Lin et al., 2019).

Критическая роль Treg-клеток в контроле иммунного гомеостаза в дыхательных путях при астме обусловлена их способностью ослаблять воспалительный процесс, опосредованный Th2-лимфоцитами. Значение сигнального пути Notch в определении направления дифференцировки пула Тreg-лимфоцитов доказано в эксперименте, демонстрирующем увеличение числа CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg-клеток в легких и концентрации трансформирующего фактора роста β (TGFβ) в бронхоальвеолярном лаваже у мышей с астмой при введении дендритных клеток, экспрессирующих лиганд Jagged1 (Lin et al., 2019). Повышение экспрессии рецептора Notch-4 на Treg-клетках, регистрируемое при повторном воздействии аллергенов, сопровождается ослаблением их функциональной активности и способствует образованию популяций Th2- и Th17-лимфоцитов, поддерживающих аллергическое воспаление (Zhou et al., 2022).

РОЛЬ NOTCH В ПАТОГЕНЕЗЕ РАКА ЛЕГКИХ

Нарушения функционирования сигнального пути Notch активно обсуждаются в контексте одного из ключевых факторов онкогенеза основных гистологических типов рака легкого – немелкоклеточного и мелкоклеточного.

Сигнальный каскад Notch принимает участие в процессе эпителиально-мезенхимного перехода, который характеризуется утратой способности клеток к межклеточной адгезии, появлением миграционных свойств и, тем самым, способствует инициации опухоли, инвазии и метастазированию (Sparaneo et al., 2016; Sosa Iglesias et al., 2018). Однако роль молекулярных механизмов, опосредованных разными подтипами рецепторов Notch не однозначна.

Двойственная роль передачи сигналов Notch при мелкоклеточном раке легкого (МКРЛ) продемонстрирована в работе Лим с соавторами (Lim et al., 2017). Так, в модели на мышах и клетках МКРЛ человека установлена связь активации сигнального пути Notch с трансформацией нейроэндокринных клеток (источника всех нейроэндокринных новообразований легких) в клетки, лишенные секреторной функции и характеризующиеся медленным ростом. Вместе с тем, эти клетки резистентны к химиотерапии и обеспечивают трофическую поддержку опухолевых нейроэндокринных клеток. Блокада сигнального каскада Notch в комплексе с химиотерапией подавляет рост опухолевых клеток и задерживает развитие рецидива (Lim et al., 2017). Связь нарушений функционирования сигнального пути Notch с опухолевой трансформацией клеток доказана в эксперименте, демонстрирующем снижение способности клеток ксенотрансплантатов НМКРЛ к росту в присутствии ингибитора γ-секретазы (Sharif et al., 2020). В зарубежной литературе также представлены данные о том, что сигнальный путь Notch аберрантно активируется при НМКРЛ (Sharif et al., 2020) и, напротив, инактивируется при МКРЛ (Katoh, Katoh, 2020; Zhou et al., 2022).

В образцах тканей пациентов с НМКРЛ регистрируется более высокий уровень экспрессии мРНК Notch-1 (Sparaneo et al., 2016; Kiyokawa, Morimoto, 2020) и Notch-3 (Galluzzo, Bocchetta, 2011; Kiyokawa, Morimoto, 2020; Sharif et al., 2020) по сравнению с нормальной тканью легкого. Наиболее высокая частота экспрессии мРНК Notch-3 обнаружена в клетках плоскоклеточной карциномы и аденокарциномы (Galluzzo, Bocchetta, 2011; Zhou et al., 2022). Повышение экспрессии мРНК Notch-1 и Notch-3 связывают с высоким риском метастазирования в лимфатические узлы (Sparaneo et al., 2016; Kiyokawa, Morimoto, 2020) и неблагоприятным прогнозом заболевания (Chen et al., 2017; Sharif et al., 2020).

В настоящее время отсутствует единое мнение о значении в онкогенезе рецептора Notch-2 и опосредованного им сигнального каскада. Так, иммуногистохимический анализ образцов ткани опухоли пациентов с НМКРЛ показал снижение экспрессии Notch-2 по сравнению с нормальной тканью легкого (Sparaneo et al., 2016). В другом исследовании у пациентов с аденокарциномой, напротив, продемонстрировано увеличение экспрессии Notch-2 в сравнении с таковым у больных с плоскоклеточным раком. Также авторы указывают на ассоциацию высокого уровня экспрессии Notch-2 с более поздней стадией рака легкого и более высокой частотой рецидивов заболевания (Chen et al., 2017). Согласно результатам работы Мотоока с коллегами (Motooka et al., 2017), экспрессия рецептора Notch-2 в линии клеток НМКРЛ человека была аналогичной экспрессии Notch-1. При этом нокдаун гена рецептора Notch-2 в линии клеток НМКРЛ человека не сопровождался значимыми изменениями экспрессии молекул, определяющих дифференцировку, пролиферацию, миграцию и апоптоз клеток (Motooka et al., 2017).

Интересны результаты работ, оценивающих взаимосвязь нарушений сигнального пути Notch и функций белка Р53, регулирующего клеточный цикл, пролиферацию и апоптоз трансформированных клеток. Так, на биоптатах опухолевой ткани пациентов с НМКРЛ без мутаций гена белка Р53 установлено, что высокий уровень мРНК белка HES1 положительно коррелирует с экспрессией рецептора Notch-1 и плохим прогнозом заболевания (Kiyokawa, Morimoto, 2020). Сигнальный каскад, опосредованный рецептором Notch-1, способствует выходу клеток из апоптоза и росту клеток посредством негативной модуляции стабильности белка P53 (Sparaneo et al., 2016).

Отличительным признаком НМКРЛ является повышенная экспрессия и активация рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), связанная с плохим прогнозом и резистентностью к терапии (Baumgart et al., 2010; Pancevich-Wojtkiewicz, 2016). На линии клеток НМКРЛ показано, что одновременная активация Notch-1 и EGFR сопровождается повышением пролиферативной активности и злокачественной трансформацией клеток (Baumgart et al., 2010; Sparaneo et al., 2016). В образцах опухолевой ткани пациентов с НМКРЛ увеличение экспрессии рецепторов Notch-1, Notch-3 положительно коррелирует с повышенной экспрессией рецептора EGFR (Baumgart et al., 2010; Galluzzo, Bocchetta, 2011; Sosa Iglesias et al., 2018; Sharif et al., 2020). Нокдаун гена рецептора Notch-1 приводит к значительному снижению экспрессии клетками EGFR (Baumgart et al., 2010).

Другие исследования (George et al., 2015) указывают на супрессорную роль генов семейства Notch в развитии МКРЛ и их регуляторное значение в дифференцировке нейроэндокринных клеток. Так, в большинстве исследуемых образцов опухолевой ткани высокий уровень экспрессии генов белков-маркеров-нейроэндокринных клеток CHGA (хромогранина A) и GRP (гастрин-рилизинг пептид) регистрировался на фоне высокой экспрессии гена ингибитора передачи сигналов Notch (гена лиганда DLK1) и гена фактора транскрипции Ascl1, индуцирующего начальные стадии опухолевой трансформации и необходимого для выживания опухолевых клеток (George et al., 2015).

Одной из потенциальных мишеней таргетной терапии опухолей является лизин-специфическая гистондеметилаза 1 (LSD1), обеспечивающая пролиферацию и метастазирование путем ингибирования опухолевого супрессора р53 (Chen et al., 2012). В эксперименте на мышах и клеточных линиях показано, что подавление активности LSD1, высоко экспрессирующейся при МКРЛ, сопровождается реактивацией передачи сигналов через Notch-1-рецептор и последующим угнетением фактора транскрипции Ascl1 (Augert et al., 2019). На супрессорную роль сигнального пути Notch в онкогенезе при МКРЛ также указывает высокая экспрессия на поверхности опухолевых клеток ингибирующего лиганда DLL3, регулируемая Ascl1 (Leonetti et al., 2019; Owen et al., 2019).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты представленных исследований подтверждают решающую роль передачи сигналов Notch в эмбриональном развитии легких, дифференцировке бокаловидных клеток и гиперпродукции слизи при ХОБЛ, гиперреактивности и ремоделировании дыхательных путей у больных бронхиальной астмой, инициации и прогрессировании опухолевой трансформации клеток. Плейотропный характер Notch-опосредованных изменений указывает на необходимость дальнейшего изучения молекулярных механизмов, модулирующих сигнальный каскад. Комплексный анализ особенностей Notch-опосредованной индукции или подавления механизмов развития рассмотренных патологий позволит установить потенциальные таргетные мишени, усовершенствовать диагностические методы, а также терапевтические стратегии профилактики и лечения заболеваний органов дыхания.