Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 49-54

Ферменты класса оксидоредуктаз (КФ1) представляют значительный интерес для решения широкого спектра биотехнологических задач и применяются в пищевой промышленности, медицинской диагностике и экологическом мониторинге [1]. В частности, ферменты этого класса привлекают внимание исследователей как высокоселективные биомаркёры для создания эффективных средств биомедицинской аналитики. Например, изучаются возможности конструирования новых индикаторных и диагностических тест-систем с помощью иммобилизации глюкозооксидазы и пероксидаз на различных типах носителей, включая наночастицы разной физико-химической природы [2–4].

Надо сказать, что учёные многих стран проводят поиск новых источников сырья для получения ферментов с оксидазной функцией. В настоящее время заметный интерес исследователи проявляют к использованию в аналитических приложениях оксидаз высших грибов [5–7]. Это стимулирует исследования, направленные на обнаружение новых видов грибов в качестве перспективных источников получения оксидазных ферментов, изучение возможностей увеличения продукции этих ферментов в грибной биомассе, выявление оксидаз с новыми свойствами. Совершенствуются методы выделения оксидазных ферментов из грибной биомассы, разрабатываются способы их иммобилизации на различных носителях для повышения устойчивости к воздействию негативных факторов и сохранения каталитической активности при многократном использовании [8–10].

Недавно мы предложили оригинальный способ обработки мицелия высших грибов β-глюкозидазой и хитиназой, позволивший без разрушения грибной биомассы выделить из двух видов базидиомицетов экстраклеточные пероксидазы и глюкозоксидазу [11, 12]. В свою очередь, иммобилизация этих ферментов на модельный носитель (наноалмазы взрывного синтеза) позволила создать бифункциональную индикаторную систему многократного действия, которая может быть использована для целей медицинской и экологической аналитики [13].

Настоящая работа посвящена выделению экстраклеточных оксидаз из мицелия базидиомицета Neonothopanus nambi с помощью обработки биомассы β-глюкозидазой и изучению их некоторых свойств.

В экспериментах использовали мицелий светящегося высшего гриба N. nambi IBSO 3293 из Коллекции микроорганизмов (CCIBSO 836) ИБФ СО РАН, ФИЦ “КНЦ СО РАН” (Красноярск). Биомассу мицелия получали при культивировании гриба в картофельно-сахарозной среде в погруженных условиях по разработанной нами ранее технологии [12], выращивание проводили в течение 7–9 суток. Полученные пеллеты мицелия извлекали из питательной среды и многократно промывали деионизованной (ДИ) водой (Milli-Q system, “Millipore”, США) для удаления остатков питательной среды и метаболитов. Для получения пула экстраклеточных ферментов (в том числе оксидаз) пеллеты мицелия обрабатывали β-глюкозидазой (КФ 3.2.1.21) из сладкого миндаля (“Serva”, Германия), исходный раствор которой готовили в 10 мM фосфатном буфере (рН 6.0). Отмытые пеллеты помещали в свежую порцию ДИ воды, добавляли раствор β-глюкозидазы до конечной концентрации фермента 0.5 МЕ/мл и инкубировали при 25°C в течение 24 ч при медленном перемешивании со скоростью 80 об/мин на шейкере OS-10 (“BIOSAN”, Латвия). По завершении инкубации жидкую часть (водный экстракт) отделяли от биомассы пеллет фильтрацией через бумажный фильтр. Для концентрирования выделенных экстраклеточных ферментов и удаления низкомолекулярных балластных соединений экстракт диализовали ультрафильтрацией через мембрану с пределом исключения 30 кДа (“EMD Millipore Amicon, Darmstadt”, Германия). В ходе ультрафильтрации в диализуемом образце трижды заменяли ДИ воду для более полного удаления низкомолекулярных примесей. Полученную после диализа надмембранную фракцию (концентрат ферментов) отбирали и использовали для исследований.

Разделение экстраклеточных ферментов, выделенных из мицелия N. nambi, проводили гель-фильтрационной хроматографией ферментного концентрата на колонке (1.6 × 33 см) с Sephadex G-200 (“Pharmacia”, Швеция), уравновешенной раствором 50 мМ NaCl. На колонку наносили 2 мл концентрата, в который был добавлен хлорид натрия до концентрации 50 мM. Хроматографию проводили при скорости протока 0.2 мл/мин, используя в качестве элюента водный раствор 50 мМ NaCl и собирая пробы объёмом по 2 мл. Для сравнительной оценки нативной молекулярной массы белков, полученных при хроматографии ферментного концентрата, при указанных выше условиях (размер колонки, объём наносимого образца, элюент и скорость протока) проводили хроматографию маркерных белков – БСА (“Sigma”, США) и цитохрома C (“Fluka”, Германия).

Концентрацию белка в ферментном концентрате и пробах после его хроматографии определяли микробиуретовым методом, используя БСА в качестве стандарта. Оценку проводили спектральным методом по величине оптической плотности образцов при 330 нм (спектрофотометр UV-1800, “Shimadzu”, Япония).

Наличие оксидазной активности в концентрате ферментов и полученных хроматографических фракциях оценивали с помощью реакции соокисления фенола с 4-аминоантипирином (4-ААП) и реакции окисления вератрилового спирта. Для этого использовали 4-ААП (1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразолон) квалификации ч.д.а. (“Реахим”, Россия), фенол (“Fluka”, Германия) и вератриловый спирт (“Sigma”, США), растворы которых готовили in situ в ДИ воде. При тестировании оксидазной активности с помощью первой реакции реакционная смесь объёмом 600 мкл содержала 5.96 мМ фенола; 0.49 мМ 4-ААП и 100 мкл изучаемого образца. Во втором случае реакционная смесь (600 мкл) содержала 10 мМ вератрилового спирта и 50 мкл изучаемого образца. В обоих случаях после добавления всех ингредиентов реакции образцы перемешивали в течение 3 с на Vortex-Genie 2 g-560E (“Scientific Industries, Inc.,” США) и инкубировали в течение 30 мин при температуре 22°C.

Уровень оксидазной активности в образцах оценивали по выходу продуктов указанных выше реакций, регистрируемых спектральным методом (спектрофотометр UV-1800) по величине оптической плотности при длинах волн 506 и 310 нм соответственно. Активность ферментов выражали в единицах оптической плотности на 1 мг белка.

Концентрацию фенола и вератрилового спирта в реакционных смесях, а также их температуру и рН изменяли при изучении зависимостей образования продуктов реакций.

Для выделения пула экстраклеточных ферментов базидиомицета N. nambi (в том числе ферментов с оксидазной функцией) нами была проведена инкубация биомассы мицелия в присутствии β-глюкозидазы. В предыдущих работах мы показали, что такая обработка мицелия высших грибов сопровождается выходом их экстраклеточных пероксидаз и глюкозооксидазы в среду инкубации [12, 13]. Такой методический приём может представлять самостоятельную биотехнологическую ценность, поскольку позволяет в относительно мягких условиях (без тотального разрушения биомассы) получать из базидиомицетов экстракты, обогащенные экстраклеточными грибными ферментами и содержащие малое количество балластных примесей.

На начальном этапе исследований в данной работе мы установили, что водные экстракты, полученные после инкубации пеллет мицелия N. nambi с β-глюкозидазой, содержат экстраклеточные ферменты гриба, обладающие оксидазной активностью и катализирующие окисление вератрилового спирта и соокисление фенола с 4-аминоантипирином. Об этом свидетельствовало образование продуктов при проведении указанных реакций.

Гель-фильтрационная хроматография концентрата экстрагированных из гриба N. nambi экстраклеточных ферментов на колонке с Sephadex G-200 позволила выявить две белковые фракции, которые обладали оксидазной активностью (рис. 1). Как видно из представленных данных, белковая фракция с нативной молекулярной массой белка 80–85 кДа содержит фермент, который катализирует окисление вератрилового спирта и, вероятно, является алкоголь-оксидазой. Данную оксидазу мы условно назвали Ф1. В белковой фракции с нативной молекулярной массой белка около 60 кДа (рис. 1) мы обнаружили фермент, катализирующий реакцию соокисления фенола с 4-аминоантипирином. При этом следует подчеркнуть, что данный фермент катализирует указанную реакцию без добавки экзогенного пероксида водорода и это отличает его от известных пероксидаз. Этой оксидазе мы дали условное название Ф2.

Рис. 1.

Гель-фильтрационная хроматография белковых препаратов на колонке Sephadex G-200: 1 – концентрат экстраклеточных ферментов из гриба N. nambi, 2 – маркерные белки (БСА – 66.5 кДа и цитохром С – 12.3 кДа). Ф1 и Ф2 – распределение в хроматографических пробах активности оксидаз, катализирующих окисление вератрилового спирта и соокисление фенола с 4-аминоантипирином соответственно.

В экспериментах мы установили, что выделенные из базидиомицета N. nambi экстраклеточные оксидазы Ф1 и Ф2 могут функционировать в широких интервалах температур, однако значительно различаются температурными оптимумами каталитической эффективности (рис. 2). Из представленных данных видно, что оксидаза Ф1 проявляет максимум активности в диапазоне температур 22–35°C. При этом видно, что оксидаза Ф2 наиболее эффективно функционирует при температурах 55–70°C. Вероятно, смещение максимума функциональной активности оксидазы Ф2 в область высоких температур может быть преимуществом данного фермента при его использовании в аналитических приложениях. Однако это предположение требует отдельного исследования.

Рис. 2.

Образование продуктов реакций, катализируемых выделенными из базидиомицета N. nambi экстраклеточными оксидазами Ф1 и Ф2, в зависимости от температуры реакционной среды. Представленные данные нормированы на максимальные значения выхода соответствующих продуктов в рядах измерений. Оценка образования продуктов проведена после инкубации соответствующих реакционных смесей в течение 15 мин при разных температурах (термостат TB-85 Thermo Batch, “Shimadzu”, Япония).

Для изучения эффективности функционирования выделенных оксидаз в зависимости от рН реакционной среды нами была использована серия 50 мМ Na-ацетатных буферов, имеющих значения рН в диапазоне от 3 до 8. Как показали эксперименты (рис. 3), оксидаза Ф2 проявляет наибольшую активность в очень узком диапазоне слабокислых значений рН среды с максимумом каталитической эффективности при pH 5. В то же время из представленных данных видно (рис. 3), что оксидаза Ф1 может эффективно функционировать в более широком диапазоне значений рН среды (от нейтрального до слабокислых), проявляя наибольшую активность при рН 6.

Рис. 3.

Образование продуктов реакций, катализируемых выделенными из базидиомицета N. nambi экстраклеточными оксидазами Ф1 и Ф2, в зависимости от рН среды. Представленные данные нормированы на максимальные значения выхода соответствующих продуктов в рядах измерений.

По данным проведенных нами исследований зависимостей выхода продуктов реакций, катализируемых выделенными оксидазами Ф1 и Ф2, величины    кажущихся К_m для вератрилового спирта и фенола составили 0.52 и 0.27 мМ соответственно.

При изучении спектральных характеристик образцов экстраклеточных оксидаз, выделенных из гриба N. nambi, мы установили, что оксидаза Ф2 является ФАД-содержащим ферментом, в то время как оксидаза Ф1 не содержит в своей структуре каких-либо хромофорных компонентов. Из результатов спектрального анализа видно (рис. 4), что спектр поглощения водного образца оксидазы Ф1 соответствует типичному белковому спектру с единственным максимумом оптической плотности при 279 нм. В то же время в спектре поглощения водного образца оксидазы Ф2, помимо белкового пика (279 нм), регистрируются дополнительные пики оптической плотности при 390 и 457 нм (рис. 4). Это свидетельствует в пользу того, что в молекуле фермента Ф2 имеется ФАД. Хорошо известно, например, [8], что наличие таких пиков наблюдается в спектрах поглощения ФАД-содержащих ферментов. Результаты дополнительных экспериментов свидетельствуют в пользу того, что ФАД не связан с белковой частью молекулы фермента ковалентно. Мы показали, что после термообработки образца оксидазы Ф2 при 100°C в течение 5 мин и последующего его диализа через мембрану с пределом исключения 10 кДа ФАД обнаруживается спектрофотометрически в подмембранной фракции (спектр поглощения не приводится).

Рис. 4.

Спектры поглощения водных образцов экстраклеточных оксидаз Ф1 и Ф2, выделенных из базидиомицета N. nambi. На врезке приведены фрагменты спектров в диапазоне 300–550 нм.

Полученные в исследованиях оксидазы Ф2 данные (катализ соокисления фенола с 4-аминоантипирином без добавления экзогенного пероксида водорода, наличие ФАД в молекуле фермента), позволяют высказать требующую дальнейшего изучения гипотезу, что данный фермент может быть оксидазой со смешанной функцией. По-видимому, оксидаза Ф2 при наличии фенола в водной среде сначала генерирует пероксид водорода, который затем используется в реакции соокисления фенола с 4-аминоантипирином. Мы полагаем, что высказанная версия представляется правомочной, поскольку известны ФАД-содержащие ферменты, обеспечивающие образование Н₂О₂ за счёт окисления циклических ОН-содержащих соединений (например, ароматических спиртов) и О₂ водной среды [14, 15]. Следует также сказать, что изучение структурно-функциональных особенностей обнаруженной оксидазы Ф2 представляет не только фундаментальный интерес, но и имеет практическое значение. В частности, в сравнении с известными пероксидазами применение Ф2 будет упрощать методику тестирования фенола (без использования пероксида водорода).

Таким образом, из мицелия базидиомицета N. nambi с помощью оригинального способа обработки биомассы β-глюкозидазой впервые выделен пул экстраклеточных ферментов гриба. Гель-фильтрационной хроматографией на Sephadex G-200 из экстрактов выделены две белковые фракции, в которых обнаружены ферменты с оксидазной активностью, условно названные Ф1 и Ф2. Показано, что фермент Ф1 имеет нативную молекулярную массу 80–85 кДа и не содержит в своей структуре хромофорных компонентов. Данный фермент катализирует окисление вератрилового спирта и, вероятно, является алкоголь-оксидазой. Установлено, что фермент Ф2 имеет нативную молекулярную массу около 60 кДа и является ФАД-содержащим белком. Высказана гипотеза, что данный фермент является оксидазой со смешанной функцией, поскольку в отличие от известных пероксидаз катализирует реакцию соокисления фенола с 4-аминоантипирином без добавки экзогенного пероксида водорода. Совокупность результатов проведенных исследований открывает перспективы для получения выявленных экстраклеточных оксидаз гриба N. nambi в гомогенном виде и изучения их структурно-функциональных особенностей и применимости в биотехнологических и аналитических приложениях.