Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 491, № 1, стр. 199-203

Холиновые эфиры длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот представляют собой семейство эндогенных липидов. До недавнего времени in vivo были обнаружены только производные полностью насыщенных кислот с длиной остатка до 16 атомов углерода, включительно (пальмитоилхолин) [1]. Возможность биосинтеза данных соединений обеспечивается низкой избирательностью холин ацетилтрансферазы в отношении остатка жирной кислоты в составе ацил-КоА [2]. Известная биологическая активность ацилхолинов проявляется преимущественно посредством мускариновых и никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, причем по сравнению с ацетилхолином длинноцепочечные ацилхолины активируют мускариновые рецепторы слабее, а никотиновые – сильнее [1].

В ходе метаболомных исследований последних лет в человеческих плазме крови и стенках сосудов были обнаружены новые представители ацилхолинов – производные докозагексаеновой, арахидоновой, олеиновой, линолевой и линоленовой жирной кислот [3, 4]. Данных о биологической активности этих веществ нет, однако показано, что их уровень положительно коррелировал с развитием патологий сердечно-сосудистой системы и риском развития отека легких [4].

Известно, что избыточный уровень генерации различных активных форм кислорода, в том числе индуцируемый H₂O₂, сопровождает и является одним из патологических факторов сердечно-сосудистой патологии [5]. При этом активация мускариновых ацетилхолиновых рецепторов является одним из механизмов защиты клеток от окислительного стресса, вызванного H₂O₂ [6]. Мы предположили, что ненасыщенные ацилхолины могут служить эндогенными средствами защиты клеток от активных форм кислорода. Цель работы – проверить наличие антиоксидантной активности длинноцепочечных ненасыщенных холинамидов арахидоновой (AA-CHOL), олеиновой (Ol-CHOL), докозагексаеновой (DHA-CHOL) и линолевой (Ln-CHOL) кислот, а также их аналогов, содержащих две четвертичные триметиламонийные группы: арахидоноилдихолина (AA-diCHOL, N¹-(2-(((5Z,8Z,11Z,14Z)-икоза-5,8,11,14-тетраеноил)окси)этил)-N¹,N¹,N²,N²,N²-пентаметилэтан-1,2-диаминиум иодид) и О-арахидоноил бистриметиламино-изо-пропанола (ABTAP, 2-(((5Z,8Z,11Z,14Z)-икоза-5,8,11,14-тетраеноил)окси)-N¹,N¹,N¹,N³,N³,N³-гексаметилпропан-1,3-диаминиум иодид) (Схема), и способность этих веществ защищать клетки от окислительного стресса, индуцированного H₂O₂.

В качестве модели была выбрана распространенная в таких исследованиях линия человеческой нейробластомы SH-SY5Y [7].

Исследуемые ацилхолины и их аналоги синтезировали по ранее разработанным нами методикам [8]. Продукты очищали колоночной хроматографией на силикагеле. Чистоту финального продукта оценивали с помощью микроколоночной обращенно-фазовой ВЭЖХ, структуру подтверждали с помощью ¹H-ЯМР и масс-спектрометрии ESI. Все соединения, использованные в экспериментах, имели чистоту не менее 97%.

Схема. Структуры исследованных соединений.

Клетки человеческой нейробластомы SH-SY5Y (ATCC CRL-2266) культивировали в комбинированной питательной среде DMEM с добавлением 1% заменимых аминокислот, 4 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2.5 мкг/мл амфотерицина B при 37°С и 5% CO₂. Контаминацию питательной среды и сыворотки микотоксинами (зеараленоном, дезоксиниваленолом, афлатоксином В1, охратоксином А, Т2-токсином) контролировали с помощью экспериментальных автоматического анализатора и тест-систем для хемилюминесцентной детекции перечисленных примесей, разработанных совместно МГУ им. М.В. Ломоносова и ООО “ХЕМА” с участием средств Минобрнауки России. Далее клетки пересевали с помощью раствора Версена и раствора трипсина с ЭДТА. Плотность клеток накануне экспериментов была 15 000 на лунку 96-луночного планшета. Инкубацию с тестируемыми соединениями проводили в течение суток. Вещества растворяли в равном объеме свежей среды и добавляли в среду культивирования. Стоковые растворы веществ готовили в диметилсульфоксиде, финальная концентрация растворителя не превышала 0.5%. Для оценки жизнеспособности клеток использовали MTT-тест. Каждый эксперимент повторяли три раза.

Антирадикальную активность соединений определяли по их способности связывать модельный АБТС^•+-радикал в соответствии с методом [9] с незначительными модификациями. Статистический анализ проводили с помощью программы GraphPad Prizm 6.0. Для статистической оценки различий использовали дисперсионный анализ и критерий Фишера, различия считали достоверными при p ≤ 0.05. Десятичный логарифм разделения октанол-вода рассчитывали с помощью пакета Perkin-Elmer ChemBioDraw 13.0.

На первом этапе работы мы определили цитотоксичность исследуемых соединений, что позволило оптимизировать диапазон тестируемых концентраций (рис. 1). Свободный холин (CHOL), Ln-CHOL и AA-diCHOL были практически нетоксичны вплоть до концентрации 100 мкМ. DHA-CHOL и AA-CHOL проявляли слабую токсичность, вызывая гибель порядка 10% клеток при концентрации 100 μM. Наиболее выраженной токсичностью обладали Ol-CHOL и ABTAP, для которых EC₅₀ составили 78 ± 4 и 60 ± 5 мкМ соответственно.

Рис. 1.

Цитотоксическое действие холиновых эфиров на культуру клеток SH-SY5Y. Здесь и на рис. 2 M ± SD, n = 5 экспериментов.

В дальнейших опытах для соединений с EC₅₀ ≤ ≤ 100 μМ использовали концентрации, не превышающие полученное значение EC₅₀.

В опытах по защите клеток от токсического действия H₂O₂ активными оказались только холиновые производные олеиновой, линолевой и докозагексаеновой кислот, а также свободный холин (рис. 2). Максимальный прирост жизнеспособности клеток составил 20%. По параметру минимальной концентрации, необходимой для максимального эффекта, вещества можно выстроить в следующий ряд: Ol-CHOL ≈ Ln-CHOL < < DHA-CHOL ≪ CHOL.

Рис. 2.

Защита холиновыми эфирами клеток SH-SY5Y от токсического действия H₂O₂ (1000 мкМ) при одновременном добавлении. *p < 0.05 при сравнении с контролем с H₂O₂ без веществ.

Далее, мы проверили антирадикальную активность соединений. Как видно из таблицы 1, все эфиры холинов проявляли высокую АБТС^•+- связывающую активность. При этом активность AA-diCHOL несколько превышала активность стандартного антиоксиданта Тролокса (TEAC = 1.2), активность ABTAP была на уровне Тролокса (TEAC = 1.03), а AA-CHOL и Ol-CHOL немного уступали Тролоксу: TEAC = 0.85 и 0.83 соответственно.

Свободная арахидоновая кислота, холин, а также предшественник арахидоноилхолина арахидоноил-диметиламиноэтанол не проявляли активности в тесте АБТС или были малоактивны. Также мы показали, что в этом тесте иодид натрия был малоактивен, т.е. иодид-ион вносит незначительный вклад в реакцию ацилхолинов с ABTS-радикалом. Таким образом, для проявления радикал-связывающей активности необходимо наличие четвертичного азота в холиновом остатке молекулы арахидоноилцилхолина.

Прямых данных об антиоксидантной активности холина в литературе нет, однако, при добавлении свободного холина в пищу зафиксировано снижение уровня активных форм кислорода у мышей в модели аллергических заболеваний [10]. В литературе также имеются сведения о том, что диметилглицин (“предшественник” холина без третичного азота) способен проявлять антиоксидантную активность, хотя и при очень значительных концентрациях порядка 20–80 мг/мл [11]. Можно сделать вывод, что включение в молекулу длинного остатка жирной кислоты усиливает антиоксидантную активность холина.

Защитное действие исследованных соединений в модели H₂O₂-индуцированной токсичности не коррелировало с их радикал-связывающей способностью. Этот противоречивый на первый взгляд результат может быть объяснён тем, что при умеренных концентрациях H₂O₂ ее цитотоксичность реализуется не за счет формирования активных форм кислорода, а через снижение концентрации NAD(P)H, что ведет к открытию неселективного катионного канала на плазмалемме и дополнительно может запускать Na⁺/Ca²⁺ обменник, что в сумме вызывает токсическую перегрузку клетки кальцием [12, 13]. В литературе имеются данные о том, что активация мускариновых ацетилхолиновых рецепторов может приводить к выбросу кальция из клетки [14]; можно предположить, что именно это лежит в основе защитного действия ацилхолинов.

Таким образом, в работе впервые была обнаружена способность длинноцепочечных ненасыщенных ацилхолинов эффективно связывать свободные радикалы и повышать жизнеспособность клеток в условиях токсического действия H₂O₂. Эти свойства хорошо согласуются с нашей начальной гипотезой о том, что такие молекулы могут синтезироваться в клетке в ответ на окислительный стресс как компоненты защиты. Однако, для окончательного ее подтверждения нужны дополнительные исследования в условиях in vivo.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России, уникальный идентификатор проекта RFMEFI60417X0198.