1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 491, № 1, 2020

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 491, № 1, стр. 122-124

ТРАНСКРИПЦИЯ ГЕНОВ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА БИПОТЕНТНЫЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ПРИ РАЗЛИЧНОМ УРОВНЕ О2

Член-корреспондент РАН Л. Б. Буравкова 1, *, М. И. Ездакова 1, И. В. Андрианова 1, Е. А. Голикова 1, Е. Р. Андреева 1

1 Институт биомедицинских проблем Российской академии наук
123007 Москва, Россия

* E-mail: buravkova@imbp.ru

Поступила в редакцию 24.12.2019
После доработки 06.02.2020
Принята к публикации 06.02.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

В митотически неактивных мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках (МСК) из жировой ткани человека проанализирована динамика изменения экспрессии генов, связанных с остео- и адипокоммитированием при культивировании в условиях 20% (стандартный лабораторный) и 5% (близкий к тканевому) уровнях О2. На 14 сутки культивирования при 5% О2 в МСК спонтанно увеличивалась транскрипция генов, связанных с остео- (RUNX2, SP7, BGLAP, SPP1) и адиподифференцировкой (CEBPA, PPGA, ADIPOQ) (p < 0.05). Таким образом, культивирование при тканевом уровне О2 обеспечивает формирование бипотентного транскрипционного профиля МСК, что может способствовать улучшению их гемопоэз-поддерживающих свойств.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, коммитирование, экспрессия генов

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются одним из наиболее востребованных продуктов для регенеративной медицины в связи с их высокой пролиферативной и паракринной активностью, а также мультилинейным диффренцировочным потенциалом [1]. Способность поддерживать функционирование различных типов клеток является одним из наиболее привлекательных свойств МСК, востребованным в различных экспериментальных протоколах, в частности, для ex vivo экспансии гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСПК) [2]. Эффективность реализации стромальной функции МСК зависит от целого ряда внешних и внутренних факторов, сочетание которых может позволить дополнительно улучшить потенциал МСК при подготовке к строма-зависимой экспансии [3]. Низкий уровень О2 – “физиологическая” гипоксия (0.5–5%), является одним из важных параметров, регулирующих функциональную активность клеток в костном мозге, в том числе и МСК. Известно, что культивирование при значениях О2, близких к тканевым, приводит к изменению функциональной активности МСК. В частности, показано увеличение пролиферативной активности и снижение остео- и адипо-индуцированной дифференцировки [4–7]. Ранее мы показали, что сокультивирование ГСПК из пуповинной крови и МСК из жировой ткани при “физиологической” гипоксии (5% О2) позволяет увеличить долю CD34+ клеток в популяции ГСПК и обеспечить преимущественное развитие определенных гемопоэтических ростков [8]. Поскольку в гемопоэтической нише МСК не пролиферируют, для ex vivo экспансии ГСПК предпочтительно использование митотически неактивных клеток после гамма-облучения или обработки митомицином С. При сочетании факторов, характерных для тканевой ниши ГСПК – стромального слоя из непролиферирующих МСК и тканевого содержания О2, мы продемонстрировали обогащение популяции ГСПК некоммитированными предшественниками, которые могут обеспечивать длительное поддержание кроветворения in vivo (LTC-IC) [9].

Особый интерес представляют сигналы, регулирующие остео- и адиподифференцировку МСК, поскольку гемопоэтическое микроокружение формируют стромальные клетки разной степени коммитирования [10]. Немногочисленные работы по изучению вклада различных типов стромальных клеток – производных МСК костного мозга в поддержание гемопоэза, показали, что более высокую гемопоэз-поддерживающую активность демонстрируют ранние стромальные предшественники, обладающие бипотентным остео/адипо-диффренцировочным потенциалом. Это обеспечивается существенным изменением профиля транскрипции за счет снижения активности генов, опосредующих связь клетка–матрикс, и увеличением активности генов хемокинов семейства СХС [11, 12].

Целью настоящей работы была оценка динамики изменения бипотентного транскриптомного профиля митотически неактивных МСК, культивируемых при различном уровне О2.

МСК из жировой ткани человека выделяли и культивировали при 5% О2 (мультигазовый инкубатор Sanyo, Япония), как описано [9]. Использовали МСК 2–4 пассажей. Иммунофенотип (CD73+, CD90+, CD105+, CD45–, CD34–) подтверждали при помощи специфических антител (IO Test, Beckman Coulter) методом проточной цитофлуориметрии на приборе Accuri C6 (BD, США). Для получения митотически неактивных клеток МСК инкубировали 18 ч с 1.5 мкг/мл митомицина С (Sigma-Aldrich, США). Затем пересевали в чашки Петри D35 мм (Corning, США) с плотностью 70–80% от конфлуэнта, и далее культивировали при 20 и 5% О2 в течение 2 недель.

Для оценки динамики профиля транскрипции МСК определяли экспрессию генов с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени на 7 и 14 сутки культивирования. Тотальную РНК выделяли с использованием лизирующего реагента QIAzol (Qiagen, США). Обратную транскрипцию осуществляли с помощью набора QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, США). Полученную кДНК использовали для определения уровня экспрессии генов. Для нормализации уровня транскрипции в качестве хаускиппинг-гена использовали HPRT1. Количественную ПЦР-РВ проводили на приборе Mx3000P (Stratagene, США) с использованием SYBR Green 1 ПЦР-микс (Синтол, Россия).

Достоверность различий между группами оценивали с помощью критерия Манна–Уитни. Различия считали достоверными при p < 0.05.

Динамику транскрипционной активности оценивали по изменению экспрессии генов, характерных для ранних (транскрипционные факторы остерикс (SP7) и RUNX2) и поздних (остеокальцин – BGLAP, остеопонтин – SPP1) стадий остеокоммитирования МСК, согласно [13]. Адипогенный потенциал оценивали по экспрессии генов, кодирующих продукты, характерные для раннего (транскрипционные факторы C/EBPα (CEBPA) и PPARγ (PPRG) и позднего (адипонектин ADIPOQ адипокоммитирования [13].

В табл. 1 представлены результаты анализа транскрипционной активности генов, связанных с остеогенным коммитированием МСК. Экспрессия транскрипционных факторов в МСК между 7 и 14 сутками культивирования при 20% О2 изменялась разнонаправленно: транскрипция RUNX2 – достоверно увеличивалась, а SP7 – снижалась. При 5% О2, напротив, экспрессия RUNX2  не изменялась, тогда как SP7 – существенно увеличивалась. RUNX2 и остерикс являются ключевыми транскрипционными факторами остеогенной дифференцировки. RUNX2 регулирует инициацию и развитие всех этапов остеокоммитирования. Остерикс контролирует экспрессию генов остеогенных белков по RUNX2-независимому пути. Предполагается, что транскрипционная активность этих двух факторов может быть разделена во времени, и остерикс контролирует более поздние фазы остеодифференцировки, связанные с продукцией матрикса, в который входят такие белки как коллаген I-го типа, остеопонтин, остеонектин, остеокальцин, костный сиалопротеин, фибронектин и др. [13]. Гены BGLAP и SPP1, кодирующие целевые остеогенные белки этих регуляторных молекул, демонстрировали существенное возрастание экспрессии только при “физиологической” гипоксии. По-видимому, при 5% О2 RUNX2-независимая регуляция остеокоммитирования через SP7 может вносить более значимый вклад в остеодифференцировку МСК.

Таблица 1.

Экспрессия генов остео- и адиподифференцировки в МСК при различном уровне О2

Стадии дифференцировки Остео-/ Адипомаркеры 20% O2 5% O2
7 сутки 14 сутки 7 сутки 14 сутки
Остеогенные клетки-предшественники SP7 5.4 ± 0.2 1.3 ± 0.9* 1.7 ± 0.2** 7.2 ± 0.9*,**
Преостеобласты RUNX2 101.8 ± 0.3 227.1 ± 48.05* 164.9 ± 81.3** 122.8 ± 67.7
Зрелые остеобласты BGLAP 12.3 ± 8.9 1.4 ± 0.7* 5.1 ± 1.2** 20.7 ± 1.8*,**
SPP1 3.4 ± 0.8 2.4 ± 1.3 5.9 ± 0.6 54.8 ± 20.4*,**
Адипогенные клетки-предшественники PPARG 2.6 ± 1.2 1.1 ± 0.1* 6.0 ± 2.7** 11.8 ± 3.2 *,**
Преадипоциты CEBPA 2.6 ± 1.3 0.4 ± 0.2* 5.1 ± 0.1** 14.4 ± 2.3*,**
Зрелые адипоциты ADIPOQ 0.2 ± 0.0 0.2 ± 0.1 1.3 ± 0.3 2.9 ± 0.8*,**

Примечания. Данные нормализованы на значения экспрессии гена домашнего хозяйства HPRT1 представлены как М ± SD. * – Достоверное отличие от значения на 7 сутки эксперимента, при p < 0.05; ** – достоверное отличие от значения при 20% О2, при p < 0.05

Адиподиффренцировка МСК находится под контролем ключевых регуляторов PPARγ и C/EBPα, β, δ. C/EBPβ и C/EBPδ являются мишенями адипогенных гормонов и, в свою очередь, контролируют PPARγ и C/EBPα. Активность PPARγ и C/EBPα координируется в процессе адипогенеза по механизму положительной обратной связи, обеспечивая увеличение экспрессии генов, продукты которых вовлечены в адипогенез, таких как адипонектин (ADIPOQ) – гормон, продуцируемый клетками жировой ткани [13]. При анализе транскрипции генов адиподифференцировки только в условиях “физиологической” гипоксии после 14 суток культивирования выявлено увеличение экспрессии транскрипционных факторов CEBPA и PPRG, а также “позднего” гена адиподифференцировки – ADIPOQ. При 20% О2 транскрипция этих генов не изменялась или снижалась (табл. 1).

Таким образом, при культивировании в условиях “физиологической” гипоксии митотически неактивные МСК демонстрируют транскриптомный профиль, характерный для бипотентных ранних стромальных предшественников. Предполагается, что именно такие клетки будут более эффективно поддерживать ex vivo экспансию ГСПК.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-29-04026 и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН № 18 “Фундаментальные исследования для биомедицинских технологий”.

Список литературы

  1. Caplan A. // Stem cells international. 2015. V. 2015. P. 6.

  2. De Lima M., Mcniece I., Robinson S.N., et al. // N. Engl. J. Med. 2012. V. 367(24). P. 2305–2315.

  3. Сотнезова Е.В., Андреева Е.Р., Григорьев А.И., Буравкова Л.Б. // Acta Naturae. 2016. Т. 8. № 3 (30). С. 6–18.

  4. Fehrer C., Brunauer R., Laschober G., et al. // Aging cell. 2007. V. 6(6). P. 745–757.

  5. Yang X., Cai X., Wang J., et al. // Cell Proliferation. 2012. V. 45. P. 158–166.

  6. Buravkova L.B., Rylova Y.V., Andreeva E.R., et al. // Biochim Biophys Acta. 2013. V. 1830(10). P. 4418–4425.

  7. Buravkova L.B., Andreeva E.R., Gogvadze V., et al. // Mitochondrion. 2014. V. 19. P. 105–112.

  8. Andreeva E.R., Andrianova I.V., Sotnezova E.V. et al. // PLoS One. 2015. V. 10(4). e0124939.

  9. Andreeva E., Andrianova I., Sotnezova E., et al. // J. Biosci. Bioeng. 2019. V. 127(5). P. 647–654.

  10. Wu J., Zhang W., Ran Q., et al. // Stem cells international. 2018. V. 2018. P. 13.

  11. Omatsu Y., Sugiyama T., et al. // Immunity. 2010. V. 33(3). P. 387–399.

  12. Sugino N., Miura Y., Yao H., et al. // Biochemical and biophysical research communications. 2016. V. 469(4). P. 823–829.

  13. Choi J.W., Shin S., Lee C.Y., et al. // Cellular Physiology and Biochemistry. 2017. V. 44(1). P. 53–65.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал