Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 491, № 1, стр. 141-145

Разработка препаратов, позволяющих снизить активность рецептора тиреотропного гормона (ТТГ) и предотвратить развитие ТТГ-зависимых опухолей и гипертиреоидных состояний, включая болезнь Грейвса, представляет собой одну из актуальных проблем современной эндокринологии и онкологии. Основными причинами ТТГ-зависимых опухолей являются активирующие мутации в рецепторе ТТГ и сопряженных с ним G_s-белках и длительное повышение уровня ТТГ в крови, характерное для гипотиреоза [1], в то время как болезнь Грейвса вызывается гиперактивацией рецептора ТТГ специфичными к нему стимулирующими антителами [2]. Наибольшие перспективы при создании антагонистов и инверсионных агонистов рецептора ТТГ связывают с низкомолекулярными лигандами аллостерического сайта рецептора, локализованного внутри образованного семью гидрофобными спиралями трансмембранного канала [3–5]. Низкомолекулярные лиганды способны ингибировать не только стимулированную ТТГ или стимулирующими антителами активность рецептора, но и снижать его базальную активность, перманентно повышенную при некоторых типах ТТГ-зависимых опухолей.

В отличие от низкомолекулярных лигандов, ТТГ с высокой аффинностью связывается с ортостерическим сайтом, расположенным во внеклеточном домене рецептора ТТГ [6]. Связывание ТТГ с рецептором в тироцитах приводит к стимуляции фермента аденилатциклазы (АЦ) через посредство G_s-белков и повышению внутриклеточного уровня цАМФ, а также к активации фосфолипазы Сβ и кальций-зависимых путей через посредство G_q/11-белков. Результатом этого является стимуляция продукции тироксина и повышение экспрессии генов белков, вовлеченных в синтез тиреоидных гормонов [4, 6]. Среди таких белков тиреоглобулин, являющийся поставщиком тирозина для синтеза тиреоидных гормонов, Na⁺/I^–-котранспортер, доставляющий необходимый для синтеза тиреоидных гормонов йод в тироциты, и ферменты тиреопероксидаза, катализирующая йодирование тирозина в тиреоглобулине, и D2-дейодиназа, осуществляющая конверсию тироксина в 3,5,3'-трийодтиронин, эффекторный гормон тиреоидной оси.

Ранее на основе структуры тиено-[2,3-d]пиримидина нами и другими авторами были разработаны регуляторы рецептора лютеинизирующего гормона (ЛГ) [7–9], чей аллостерический сайт сходен с таковым рецептора ТТГ [10]. Группой Марвина Гершенгорна на основе тиено-[2,3-d]пиримидина был создан антагонист рецептора ТТГ с52, подавляющий ТТГ-индуцированную продукцию тиреоидных гормонов в тироцитах, но при этом влияющий на активность рецептора ЛГ [11]. Цель исследования состояла в разработке и изучении нового тиено-[2,3-d]пиримидинового производного 5-амино-N-(трет-бутил)-4-(4-йодфенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамида (TP48) c активностью функционального антагониста рецептора ТТГ, способного ингибировать базальную и стимулированную тиролиберином продукцию тиреоидных гормонов у самцов крыс.

TP48 получали добавлением к раствору 5-амино-4-(4-йодфенил)-(метилтио)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоновой кислоты (2 ммоль) в диметилформамиде (10 мл) раствора трет-бутиламина (4 ммоль) и диизопропилэтиламина (4 ммоль) в дихлорметане (10 мл) с последующей обработкой 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламмоний-тетрафторборатом (2.4 ммоль). После перекристаллизации TP48 очищали на силикагеле в системе дихлорметан–ацетон (20:1). Выход составил 75%, т. пл. 193–195°С. Спектр ЯМР ¹H, δ (400 MHz, СDCl₃): 7.91 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.94 (s, 2H), 5.25 (s, 1H), 2.66 (s, 3H), 1.47 (s, 9H). По данным масс-спектрометрии масса иона [M + K⁺] для TP48 составила 536.9868 (вычислено 536.9886; C₁₈H₁₉IN₄OS₂K). Спектры ¹H-ЯМР регистрировали с помощью спектрометра “Bruker Avance III 400” (Германия), масс-спектры высокого разрешения – с помощью спектрометра “Bruker micrOTOF” (Германия).

Для экспериментов использовали трехмесячных самцов крыс Wistar, все процедуры проводили в соответствии с правилами, разработанными Комитетом по биоэтике ИЭФБ РАН (15.02.2018 г.), и правилами и требованиями “European Communities Council Directive 1986” (86/609/EEC).

Выделение фракций плазматических мембран из семенников и щитовидной железы крыс и определение в них активности АЦ (АТФ-пирофосфатлиазы циклизующей, НФ 4.6.1.1) проводили, как описано ранее [9, 12]. Мембраны (50–100 мкг белка) инкубировали в течение 12 мин при 37°С в смеси, содержащей 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 5 мМ MgCl₂, 0.1 мМ цАМФ, 1 мМ АТФ, 37 КБк [α-³²P]АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2 мг/мл креатинфосфокиназы. Радиоактивность измеряли на счетчике “LKB 1209/1215 RackBeta” (Швеция). Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ/мин/мг белка. TP48 растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), в контрольные пробы добавляли растворитель. Преинкубацию мембран с TP48 проводили в течение 10 мин при +4°С для обеспечения его связывания с рецептором ТТГ.

Для изучения активности TP48 в условиях in vivo его растворяли в ДМСО и вводили крысам (в/б, 40 мг/кг). Контрольным крысам вводили ДМСО. Тиролиберин («Sigma», США) вводили интраназально в дозе 300 мкг/кг, как описано ранее [13]. Первый забор крови осуществляли в 10.00, в 10.30 крысам групп TP и TP-TRH в/б вводили TP48 (группам К и TRH – ДМСО), в 11.00 крысам групп TRH и TP-TRH и/н вводили тиролиберин (группам К и TP – физиологический раствор), в 12.30 и 14.00 проводили второй и третий заборы крови (в каждой группе n = 6). Образцы крови получали из хвостовой вены, используя местный наркоз (анестезия 2% раствором лидокаина, 2–4 мг/кг). Уровни свободного (fТ4) и общего (tТ4) тироксина и свободного (fТ3) и общего (tТ3) трийодтиронина в крови определяли с помощью наборов “Иммунотех” (Россия), уровень тестостерона – с помощью набора “Алкор-Био” (Россия).

Для проведения ПЦР в реальном времени из щитовидной железы крыс выделяли тотальную РНК, используя TRI-реагент (“Molecular Research Center, Inc.”, США). Обратную транскрипцию проводили, используя набор “RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit”. Амплификацию проводили в смеси, содержащей 10 нг ПЦР-продукта, по 0.4 мкМ прямого и обратного праймеров, qPCRmix-HS SYBR+LowROX (“Евроген”, Россия). Сигнал детектировали с помощью амплификатора “7500 Real-Time PCR System” (“Thermo Fisher Scientific Inc.”, США). В качестве референсных использовали гены 18S-рРНК (18S rRNA) и β-актина (Actb). Полученные данные рассчитывали с помощью метода delta-delta C_t.

Статистический анализ данных осуществляли, используя программу “Microsoft Office Excel 2007”, нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения двух выборок с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента, для сравнения трех групп – дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми считали различия при p < 0.05, данные представлены как M ± SD.

В экспериментах in vitro показано, что преинкубация с TP48 (10^–6 и 10^–4 М) фракций мембран, выделенных из щитовидной железы крыс, не влияла на базальную активность АЦ, но ингибировала стимулирующий эффект ТТГ (10^–8 М). В отсутствие TP48 прирост активности АЦ, вызываемый ТТГ, составил 57.7 ± 1.6 пмоль цАМФ/мин/мг белка, после преинкубации с 10^–6 и 10^–4 М TP48 снижался до 42.3 ± 1.2 и 14.1 ± 0.8 пмоль цАМФ/мин/мг белка соответственно (P < 0.05). Соединение TP48 не влияло на базальную и стимулированную хорионическим гонадотропином (10^–8 М), агонистом рецептора ЛГ, активность АЦ в тестикулярных мембранах крыс (данные не представлены). Таким образом, TP48 ингибирует АЦ эффект ТТГ в тироидальных мембранах, препятствуя гормональной активации рецептора ТТГ и функционируя, тем самым, как его антагонист, но не влияет на активность рецептора ЛГ в тестикулярных мембранах, что указывает на специфичность его действия.

Введение самцам крыс TP48 через 3.5 ч приводило к снижению уровней fT4 и fT3, что указывает на его способность подавлять базальную продукцию тиреоидных гормонов, стимулированную циркулирующим в крови животных эндогенным ТТГ (табл. 1). Наряду со снижением базального уровня тиреоидных гормонов, через 3.5 ч после обработки TP48 в ткани щитовидной железы снижалась экспрессия гена Nis, кодирующего Na⁺/I^–-котранспортер, и подавлялась экспрессия гена Tshr, кодирующего рецептор ТТГ (рис. 1).

Рис. 1.

Влияние соединения TP48 на экспрессию генов белков, вовлеченных в синтез тиреоидных гормонов, в щитовидной железе крыс в отсутствие и при их обработке тиролиберином. 1 – контроль (К), 2 – обработка TP48, в/б, 40 мг/кг (TP), 3 – обработка тиролиберином, и/н, 300 мкг/кг (TRH), 4 – последовательная обработка TP48 и тиролиберином (TP+TRH).

Гены Tg, TPO, Dio2, Nis и TshR кодируют тиреоглобулин, тиреопероксидазу, D2-дейодиназу, Na⁺/I^–-котранспортер и рецептор ТТГ. Уровень экспрессии мРНК генов нормировали по экспрессии мРНК генов 18S rRNA и Actb. Значения RQ рассчитывали по отношению к группе K. * – различия между контролем и группами TP, TRH и TP+TRH статистически значимы при P < 0.05; ^# – различия между группами TRH и TP+TRH статистически значимы при P < 0.05. M ± SEM. n = 6.

Обработка крыс тиролиберином, стимулирующим продукцию ТТГ тиреотрофами гипофиза, повышала уровни всех функционально важных форм тиреоидных гормонов, в наибольшей степени через 3 ч, и вызывала значительное повышение экспрессии генов Tg, TPO и Dio2, кодирующих тиреоглобулин, тиреопероксидазу и D2-дейодиназу, и снижение экспрессии гена Tshr в щитовидной железе. Отмечали также тенденцию к повышению экспрессии гена Nis, но различия с контролем не были статистически значимыми (табл. 1, рис. 1). Предварительная обработка крыс с помощью TP48 снижала стимулированные тиролиберином уровни тироксина и экспрессию генов Tg и Dio2 при сохранении низкого уровня экспрессии гена Tshr (табл. 1, рис. 1). Ослабление экспрессии ряда генов тиреоидогенеза при обработке крыс ТP48 указывает на то, что чувствительность тироцитов к стимулирующему влиянию ТТГ снижается, поскольку ТТГ является основным позитивным регулятором экспрессии этих генов [14]. Снижение ответа на ТТГ обусловлено как присущей TP48 активностью функционального антагониста рецептора ТТГ, так и вызываемым им снижением экспрессии гена Tshr. Уровень тестостерона при обработке TP48 не менялся, что указывает на отсутствие его влияния на рецепторы ЛГ в семенниках крыс (данные не представлены).

Таким образом, на основе структуры тиено-[2,3-d]пиримидина разработано новое соединение TP48 с активностью функционального антагониста рецептора ТТГ, которое in vitro снижало стимулированную ТТГ активность АЦ в тироидальных мембранах, при введении крысам снижало у них базальные и стимулированные тиролиберином уровни тиреоидных гормонов, а также подавляло экспрессию генов тироидогенеза в щитовидной железе.