Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 491, № 1, стр. 151-154

Невысокая стабильность белковых макромолекул ферментов ограничивает область их практического применения. В связи с этим поиск возможных путей повышения стабильности ферментов является важной задачей. При этом принимаются во внимание два различных аспекта проблемы: термодинамическая (или конформационная) стабильность и кинетическая (или долговременная) стабильность. Одним из способов повышения стабильности ферментов является добавление стабилизаторов [1]. Универсальным методом, применяемым для повышения как термодинамической, так и кинетической стабильности является иммобилизация. При этом для стабилизации разных ферментов необходимо подбирать свое уникальное микроокружение. В последние годы стали популярны исследования стабилизации белковых макромолекул в условиях “молекулярного краудинга”, то есть в условиях исключенного объема окружающей свободной воды [2–4]. Стабилизация белковых молекул при иммобилизации в полимерные гели и помещении в среды с повышенной вязкостью достигается именно благодаря вышеупомянутому эффекту [5]. К настоящему времени достаточно хорошо изучены физико-химические и структурные свойства гелей и вязких растворов природных биополимеров: желатина и крахмала [6, 7]. Кроме того, существуют подтверждения благоприятного воздействия микроокружения, создаваемого данными биополимерами, на молекулы ферментов [8–10].

В работе на примере ферментов бутирилхолинэстэразы (BChE), НАД(Ф)H:ФМН-оксидоредуктазы (Red) и биферментной системы светящихся бактерий НАД(Ф)H:ФМН-оксидоредуктаза и люцифераза (Red + Luc) изучены особенности функционирования ферментов при помещении в вязкие растворы и гели природных биополимеров крахмала и желатина. Показано, что крахмал и желатин при некоторых условиях способны оказывать стабилизирующий эффект на функционирование ферментов при хранении и воздействии различных физических и химических факторов среды. Полученные результаты важны для разработки высокостабильных ферментных препаратов для применения в биологических анализах, в частности, биотестирования природных, сточных вод и водных растворов.

В работе использовали следующие реактивы: ФМН (“Serva”, Германия), НАДН (“Gerbu”, Германия), тетрадеканаль (“Merck”, Германия), S-бутирилтиохолин йодид и 5-5'-дитиобис (2-нитробензойную кислоту) (“Sigma”, Германия); лиофилизированные препараты НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы (КФ 1.5.1.29) из Vibrio fischeri, биферментной системы НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы и люциферазы (КФ 1.14.14.3) из рекомбинантного штамма E. coli (производства лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции Института биофизики СО РАН, Красноярск), бутирилхолинэстэразы из лошадиной сыворотки (“Sigma”, Германия).

Активность Red определяли спектрофотометрическим методом по скорости расходования НАДH [11]. Активность биферментной системы Red + Luc определяли по величине максимальной интенсивности свечения I_макс, выраженной в относительных единицах [10]. Активность BChE определяли, как скорость гидролиза субстрата S-бутирилтиохолина йодида в растворе, содержащем 5-5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту) [12].

Были получены кинетические зависимости остаточной активности ферментов (А/А₀) при инкубации ферментов от 0 до 30 мин в 0.05 М калий-фосфатном буферном растворе без добавок, а также в буферных растворах крахмала и желатина различной температуры (рис. 1). Видно, что раствор крахмала оказывает больший стабилизирующий эффект на BChE по сравнению с желатиновым раствором. Так, например, в крахмальном окружении при температуре 64°С остаточная активность BChE сохраняется в течение 30 мин, а в желатиновом окружении в течение 10 мин (рис. 1а). В то же время остаточная активность Red и Red + Luc при выдерживании ферментов в вязких растворах крахмала и желатина различной температуры не отличается от таковой в буферном растворе (рис. 1б, 1в).

Рис. 1.

Зависимости остаточной активности ферментов от времени выдерживания в буферном растворе без добавок и с добавлением крахмала и желатина: а) BChE (концентрации желатина и крахмала составляют 1.4% и 3% соответственно), б) Red (концентрации желатина и крахмала составляют 1 и 2% соответственно), в) Red + Luc. (концентрации желатина и крахмала составляют 0.5 и 2% соответственно). *p < 0.05 по сравнению с остаточной активностью в буфере.

На основании полученных экспериментальных данных были построены кинетические кривые термоинактивации ферментов в буферном растворе и вязких растворах крахмала и желатина. Все полученные зависимости в координатах уравнения первого порядка имеют вид кривых с “изломом”, что характерно для диссоциативного механизма термоинактивации олигомерных ферментов [13]. Начальные отрезки кинетических кривых соответствуют процессу диссоциации фермента на субъединицы (“быстрая инактивация”), а вторые линейные участки – процессу денатурации отдельных субъединиц (“медленная инактивация”). На рис. 2 в качестве примера приведены кинетические кривые термоинактивации BChE в растворах желатина и крахмала при различных температурах. Для Red и биферментной системы Red + Luc получены сходные зависимости.

Рис. 2.

Кинетические зависимости термоинактивации BChE в 1.4%-м растворе желатина (а) и 3%-м растворе крахмала (б) при различных температурах.

Из кинетических зависимостей термоинактивации ферментов были рассчитаны эффективные константы скорости термоинактивации k₁ и k₂ для “быстрой” и “медленной” стадий инактивации ферментов, соответственно, представляющие собой тангенс угла наклона кривых термоинактивации. В таблице 1 для примера приведены значения k₁ и k₂, полученные при анализе кривых термоинактивации BChE. Видно, что стабилизирующий эффект крахмала выражается замедлением как первой, так и второй стадий инактивации фермента. Для Red и Red + Luc не выявлено достоверных различий между значениями k₁ и k₂ для ферментов, функционирующих в буфере и растворах крахмала или желатина.

Таким образом, среди изученных ферментных систем повышение термодинамической стабильности при воздействии высоких температур (>60°C) наблюдали только для BChE в растворе крахмала.

Сравнение полученных результатов с литературными данными указывает на то, что термодинамическая и кинетическая стабильность ферментов может быть расширена введением дополнительной процедуры высушивания ферментов при их иммобилизации в гели крахмала и желатина. Так, в работе [14] показано, что высушивание биферментной системы Red + Luc, иммобилизованной в гели крахмала и желатина, существенно повышает ее устойчивость к химическим и физическим факторам среды: наблюдается расширение рН-оптимума в кислую и щелочную области, сохраняется высокая активность ферментов при увеличении концентраций солей, повышается термостабильность. Показана высокая стабильность ферментных препаратов, представляющих собой высушенные крахмальные или желатиновые диски, в процессе хранения: активность препаратов BChE, представляющих собой высушенные крахмальные диски, сохранялась более 300 суток [12], а активность препаратов Red + Luc в виде желатиновых дисков – не менее двух лет [10].

Таким образом, с целью достижения термодинамической и кинетической стабильности ферментов более предпочтительным является использование в качестве стабилизирующей добавки крахмала. Исходя из совокупности представленных результатов и литературных данных можно сделать вывод, что ключевым фактором стабилизации ферментов путем включения в полимерные гели крахмала и желатина является исключение воды при высушивании иммобилизованных ферментных препаратов. Полученные результаты являются основой для получения высокоактивных и стабильных ферментных препаратов для биологических анализов.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ, Правительства Красноярского края, Красноярского краевого фонда науки в рамках научных проектов № 18–44–243010 “Стабилизация биферментной системы светящихся бактерий NADH:FMN-оксидоредуктаза + люцифераза путем помещения в гели и вязкие растворы биополимеров с целью усовершенствования реагента, используемого для оценки уровня загрязнения окружающей среды” и № 18–44–242003 “Конструирование ферментативного реагента для биолюминесцентного анализа: механизмы увеличения чувствительности и точности”.