Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 492, № 1, стр. 255-259

Акриламид является высокотоксичным соединением для животных и человека и обладает по отношению к ним мутагенным, тератогенным и канцерогенным эффектом. В окружающую среду акриламид попадает в основном со стоками предприятий по синтезу акриловых полимеров, кроме того, имеются многочисленные данные об образовании акриламида в пище и напитках при высокотемпературном взаимодействии аспарагина с соединениями, имеющими α-гидроксикарбонильные группы (восстанавливающими сахарами), известном как реакция Майяра [1, 2].

Взаимодействие этого токсичного вещества c микроорганизмами привлекает внимание исследователей в связи с изучением его биодеградации в окружающей среде и воздействия на микрофлору кишечника. Известно, что микробная амидаза (КФ 3.5.1.4) может участвовать в деградации акриламида, и выделены бактерии, способные использовать акриламид как единственный источник углерода и энергии. Среди бактерий, утилизирующих акриламид, изолированы представители родов Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Enterobacter, Moraxella, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Stenotrophomonas и др. [3–8]. Есть сведения о том, что клеточная стенка лактобацилл может связывать акриламид, снижая тем самым его всасывание в пищеварительном тракте [9]. Однако остается не до конца выясненной степень токсичности этого вещества по отношению к прокариотам.

В связи с этим, целью нашей работы явилось изучение влияния акриламида на энергетическое состояние и выживаемость бактерий родов Rhodococcus, Alcaligenes и Escherichia coli.

Объектами исследования являлись штаммы Rhodococcus erythropolis 4-1, R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-21, R. ruber gt1, Alcaligenes faecalis 2, обладающие ферментами гидролиза нитрилов, а также Escherichia coli K12 и E. coli K12 TG1 (pXen7).

Все эксперименты проводили не менее чем в 3-х кратной повторности. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, p < 0.05.

Нитрилгидратазную и амидазную активность клеток определяли при культивировании штаммов на жидкой минимальной солевой среде следующего состава (г/л): KH₂PO₄ – 1.0, K₂HPO₄ ⋅ ⋅ 3H₂O – 3.75, NaCl – 0.5, MgSO₄ ⋅ 7H₂O – 0.5, CoCl₂ ⋅ 6H₂O – 0.01, FeSO₄ ⋅ 7H₂O – 0.005, pH 7.2 ± ± 0.2. Источником азота для штамма R. ruber gt1 служил хлористый аммоний в концентрации 10 мМ, для R. erythropolis 4-1, R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-21 – ацетонитрил в концентрации 0.05%; источником углерода для всех перечисленных штаммов – 0.1% глюкоза. Для штамма A. faecalis 2 единственным источником углерода и азота был 0.1 М ацетамид. Нитрилгидратазную и амидазную активность клеток определяли в процессе реакции трансформации 0.6 М акрилонитрила и 0.1 М акриламида, соответственно, в 0.01 М калий-фосфатном буфере (рН 7.2 ± 0.2) при 22°С в течение 10–60 мин. Концентрацию акриламида, акриловой кислоты и акрилонитрила определяли методом ВЭЖХ (LC-10, “Shimadzu”, Япония) на колонке (250 × 4.6 мм) Synergi 4u Hydro–RP 80A. В качестве подвижной фазы использовали 25 мМ NaH₂PO₄, со скоростью потока 0.75 мл/мин при 25°C. Удельную активность определяли как количество клеток, мг (г), трансформирующих 1 мкмоль (1 ммоль) субстрата в продукт за 1 мин (1 ч) и выражали в мкмоль/мг/мин (ммоль/г/ч).

Штаммы R. erythropolis 4-1, R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-21 и A. faecalis 2 проявляли выраженную амидазную активность, а наиболее активной нитрилгидратазой обладал штамм R. ruber gt1 (150–200 мкмоль/мг/мин), тогда как амидаза этого штамма была неактивна. Амидазная активность R. erythropolis 6-21, R. erythropolis 4-1 и A. faecalis 2 составляла 4, 9, и 14 ммоль/г/ч, соответственно, а увеличение концентрации акриламида до 500 мМ не приводило к ингибированию активности фермента.

Энергетический статус оценивали по содержанию АТФ в клетках бактериальных штаммов R. erythropolis 4-1, R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-21, R. ruber gt1 и A. faecalis 2 после воздействия растворов акриламида в концентрациях 20, 50, 100 и 1000 мМ в течение 20 мин. Клетки бактерий культивировали на минимальной солевой среде вышеприведенного состава до стационарной фазы роста, центрифугировали 20 мин при 10500 g, отмывали однократно 0.01 М калий-фосфатным буфером, рН 7.2 ± 0.2, центрифугировали повторно и ресуспендировали в свежем 0.01 М калий-фосфатном буфере до концентрации клеток 0.3–0.4 мг/мл, раститровывали по 100 мкл в лунки круглодонного полимерного планшета (Медполимер, Россия) и вносили раствор акриламида до указанных концентраций. Контролем служили клетки без воздействия акриламида.

После 20-минутной экспозиции культуральный планшет центрифугировали 10 мин при 2464 g, удаляли надосадочную жидкость и разрушали клетки 90%-ным диметилсульфоксидом в течение 15 мин на льду, замораживали образец и хранили при –18°С. Для определения концентрации АТФ использовали стандартный набор реактивов ATP Bioluminescent Assay Kit (Sigma, США), образцы разводили в 10 раз и измеряли интенсивность свечения на планшетном ридере Infinite M1000 pro (Tecan, Швейцария). Концентрацию АТФ определяли по калибровочному графику.

Нами не было установлено достоверного отличия от контроля содержания АТФ в клетках R. ruber gt1 и R. erythropolis 4-1 после воздействия акриламида (рис. 1а, б), тогда как у R. erythropolis 6-21 и A. faecalis 2 (рис. 1в, г) снижение концентрации внутриклеточного АТФ было достоверным (p < 0.05). При этом не была обнаружена зависимость изменения содержания АТФ от концентрации акриламида.

Рис. 1.

Влияние акриламида на содержание АТФ в клетках R. ruber gt1 (а), R. erythropolis 4-1 (б), R. erythropolis 6-21 (в), A. faecalis 2 (г)

Различное воздействие акриламида на энергетический статус изученных бактерий можно объяснить совокупностью свойств этих микроорганизмов, среди которых уровень активности нитрилгидролизующих ферментов и строение клеточной стенки. Так, наиболее активной нитрилгидратазой обладал штамм R. ruber gt1, при этом амидаза этого штамма была неактивна, в связи с чем штамм был устойчив к накоплению акриламида в среде как продукта трансформации акрилонитрила. Уровень амидазной активности R. erythropolis 4-1 и A. faecalis 2 был сопоставим, но виды отличались по грам-принадлежности. Грамположительные родококки более устойчивы к негативным воздействиям окружающей среды и обладают высоким биодеградативным потенциалом по отношению к широкому ряду токсичных соединений [10]. Однако активность амидазы R. erythropolis 6-21 была невысока, а нитрилгидратазная активность близка к нулю, в связи с чем штамм был чувствителен даже к низким концентрациям акриламида.

Влияние акриламида на свечение генноинженерного штамма E. coli K12 TG1 (pXen7) изучали при добавлении акриламида до конечной концентрации 10–1500 мМ к суспензии клеток. Люминесценцию регистрировали на универсальном микропланшетном ридере Infinite M1000 pro (Tecan, Швейцария) сразу после добавления акриламида и через 10, 20, 30, 40, 50 и 120 мин экспозиции.

Известно, что свечение люминесцентных бактерий зависит от физиологического состояния клетки, а именно, от уровня НАДФН. Токсичные вещества, ингибируя электронтранспортную цепь, приводят к подавлению свечения этих микроорганизмов. Следовательно, токсичность образцов, содержащих ксенобиотики, тяжелые металлы и другие экотоксиканты, может быть оценена по степени тушения люминесценции [11]. В наших экспериментах гашение на 50% (ЕС50) свечения штамма E. coli K12 TG1 (pXen7) наблюдалось при концентрациях 500, 350, 250, 210, 190, 150 и 100 мМ акриламида за 0, 10, 20, 30, 40, 50 и 120 мин соответственно (рис. 2). ЕС50 акриламида для этого штамма за 2 ч составляла 7108 мг/л, в то время как по отношению к дафниям и другим водным беспозвоночным ЕС50 акриламида составляет 98 мг/л при воздействии в течение 48 ч (паспорт безопасности акриламида, www.merckmillipore.com). Таким образом, токсический эффект акриламида проявляется, главным образом, по отношению к эукариотам, а не к прокариотам. Различие в его воздействии на бактериальные клетки и эукариотов может объясняться разными мишенями повреждающего действия этого токсического вещества. Так, у эукариотов этой мишенью в первую очередь является ДНК, что связано с трансформацией акриламида в более мутагенный глицидамид [12]. Есть сведения, что у животных и акриламид, и его метаболит глицидамид могут конъюгировать с глутатионом, благодаря активности глутатион-S-трансфераз, а затем трансформироваться в конъюгаты меркаптуровых кислот и выделяться с мочой. Конъюгация с глутатионом может приводить к снижению его доступности в клетке, что в свою очередь приводит к аккумуляции избыточного количества активных форм кислорода и окислительному стрессу [2]. Механизмы воздействия акриламида на прокариотов не исследованы.

Рис. 2.

Гашение свечения E. coli K12 TG1 (pXen7) на 50% (EC50) в зависимости от времени экспозиции с акриламидом.

Способность к росту бактерий родов Rhodococcus, Alcaligenes и Escherichia на полноценной питательной среде LB (Диаэм, Россия) при добавлении акриламида до конечных концентраций 10, 20, 50, 100, 250, 500 и 1000 мМ оценивали высевом на агаризованную питательную среду LB из серийных разведений и подсчетом количества колониеобразующих единиц. Cреду LB (5 мл) с акриламидом инокулировали 100 мкл суспензии соответствующего штамма, содержащей 10⁸ клеток в мл и культивировали при 30°С в течение 7 суток. Контролем служила среда LB без акриламида.

У большинства изученных штаммов нами было выявлено отсутствие роста с акриламидом в концентрации от 500 мМ и выше, за исключением R. erythropolis 11-2, количество КОЕ/мл которого при этой концентрации акриламида составляло (1.0 ± 0.2) ⋅ 10⁴. Акриламид в концентрации 10–20 мМ приводил к незначительному снижению количества КОЕ по сравнению с контролем, а при концентрации 250 мМ сохранялось от 0.016 до 0.116% жизнеспособных бактериальных клеток (табл. 1).

Таким образом, рост изученных штаммов подавляют только очень высокие концентрации акриламида, что согласуется с результатами изучения воздействия этого вещества на энергетическое состояние бактериальных клеток. Полученные нами данные подтверждают, что оценка токсичности вещества, в данном случае акриламида, по отношению к эукариотам не всегда может быть сделана на основании токсичности по отношению к прокариотам.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят с.н.с. ИЭГМ УрО РАН, к.б.н. Масленникову И.Л. за предоставленный для работы штамм E. coli K12 TG1 (pXen7).

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена в рамках государственного задания по теме “Молекулярные механизмы адаптации микроорганизмов к факторам среды”, регистрационный номер НИОКТР АААА-А19-119112290009-1.