Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 492, № 1, стр. 310-316

К одной из главных причин разнообразия растений относят дупликацию, диверсификацию и неофункционализацию регуляторных генов, большинство которых выполняет более чем одну функцию в развитии организма [1–3]. Плейотропность считается адаптивным ограничением, которое препятствует эволюционным изменениям уже выработанного оптимального фенотипа [3]. С другой стороны, специфичная для признака функция может развиваться даже в высокоплейотропных генах, то есть плейотропия может ускорять таксономическую дивергенцию видов [3].

В возникновении цветка и разнообразии его форм решающую роль отдают высокоплейотропным MADS-box генам транскрипционных факторов (ТФ), целое семейство которых образовалось в процессе эволюции в следующем порядке: APETALA3 (AP3)/PISTILLATA (PI) → AGAMOUS (AG)/SHATTERPROOF (SHP)/SEEDSTICK (STK) → AG-Like 6 (AGL6)/AGL13 → SEPALLATA(SEP) → AP1/FRUITFULL (FUL) [2, 4]. После формирования определенных репродуктивных структур (цветки, шишки) возникла ветвь MADS-семейства, положившая начало семенным растениям – AGL6/13, самый последний общий предок которого существовал от 400 до 296 млн лет назад [2, 4]. Позже, дупликация и диверсификация генов AGL6/13 привела к возникновению отсутствующих в геноме Голосеменных генов SEP, с чем сопряжено появление отдела Покрытосеменных, включая последовательное возникновение сухого и затем сочного плода, сопровождающееся прогрессивными морфофизиологическими изменениями [1, 4].

Функции современных генов AGL6/13 связаны с репродуктивным развитием растений. К примеру, ген AGL13 модельного растения Arabidopsis thaliana участвует в контроле инициации цветения и идентичности мужских и женских гаметофитов [5]. Произошедшие от AGL6/13-предшественника гены SEP участвуют в спецификации клеток всех органов цветка, представляя Е-активность в общепринятой генетической модели развития цветка ABCDE [4–6]. Группа SEP высших растений включает четыре вида гомологов (SEP1, SEP2, SEP3 и SEP4), среди которых наиболее важным считается SEP3, играющий ключевую роль в формировании мультимерных комплексов MADS-ТФ [6].

Эволюционные изменения сочного плода хорошо отражены у растений секции Lycopersicon, объединяющей 13 видов томата – от древних зеленоплодных до эволюционно молодых красноплодных. Несмотря на высокую геномную синтению этих видов, их плоды имеют значительное расхождение в морфофизиологии и биохимии [7].

Целью настоящей работы стала оценка возможных корреляций между структурно-функциональной вариабельностью SEP-гомологов и эволюционной историей видов томата. Для этого были идентифицированы и сравнительно охарактеризованы новые гомологи гена SEP3 – TOMATO MADS 5 (TM5), у красноплодных и зеленоплодных видов томата.

Образцы культивируемого (Solanum lycopersicum) и дикорастущих (Solanum pimpinellifolium, Solanum chmielewskii, Solanum peruvianum, Solanumchilense, Solanum corneliomulleri, Solanum neorickii, Solanum arcanum и Solanum habrochaites) видов томата выращивали в условиях теплицы. Геномную ДНК выделяли из свежесобранных листьев анализируемых видов. На основе известной последовательности гена TM5 (синонимы – TDR5, LeSEP3, LeMADS5; NCBI-GeneID: 543885) S.  lycopersicum были разработаны праймеры MADS5F/MADS5R (табл. 2) для ПЦР-амплификации полноразмерных генов, гомологичных TM5, на геномной ДНК анализируемых дикорастущих видов. Фрагменты ожидаемой длины клонировали (pGEM-T Easy, Promega, США) и секвенировали (ABI 310 Сapillary DNA Analyzer, Applied Biosystems, США). Сравнительные выравнивания и филогенетический анализ проводили с использованием программ MEGA 6.0 и 7.0 (www.megasoftware.net). Консервативные домены и мотивы в белках определяли с помощью NCBI-CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd) и МЕМЕ 5.1.0 (http://meme-suite.org/tools/meme). На основе полученных последовательностей подбирали пары праймеров для секвенирования и экспрессионного анализа гомологов TM5 методом количественной ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) (табл. 2). Для анализа экспрессии другого SEP-гена RIPENING INHIBITOR (RIN; NCBI-GeneID: 543708) S. lycopersicum использовали праймеры MADS-RINrtF/MADS-RINrtR ([8]; табл. 2).

Из тканей листьев, корней, цветков (на стадии антезиса) и плодов (2 стадии развития – незрелые и зрелые) образцов шести видов томата (S. lycopersicum, S. peruvianum, S. chmielewskii, S. neorickii, S. arcanum и S. habrochaites) выделяли препараты суммарной РНК (RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, ФРГ). Незрелые и зрелые плоды соответствовали стадиям развития Mature Green (твердый плод, достигший финальных размеров, но имеющий зеленую окраску) и Red Ripe (мягкий плод, достигший биологической спелости и имеющий красную окраску в случае S. lycopersicum и остающийся зеленым у всех других анализируемых видов). На их основе синтезировали пробы кДНК (GoScript, Promega, США) для определения профилей экспрессии гомологов генов TM5 и RIN. РВ-ПЦР проводили в двух биологических и трех технических повторах (“Реакционная смесь для проведения РВ-ПЦР в присутствии SYBR Green I и ROX”, ЗАО “Синтол”, РФ) в следующих условиях: 95°C – 5 мин; 40 циклов (95°C – 15 с, 60°C – 50 с). Для нормализации экспрессии генов использовали референсные гены Expressed [8] и ACTIN2 [9]. Статистическую обработку результатов проводили в GraphPadPrism v. 7.02 (https://www.graphpad.com).

В результате проведенной работы были клонированы и секвенированы полноразмерные гены, гомологичные TM5, у дикорастущих видов томата S. chilense, S. corneliomulleri, S. pimpinellifolium и S. peruvianum. Кроме того, in silico (база данных WGS NCBI) были идентифицированы последовательности гомологов TM5 в геномах еще трех дикорастущих видов томата S. arcanum, S. habrochaites и Solanum pennellii (табл. 1). Идентифицированные гомологи гена TM5 видов томата различались по длине (от 5667 п.н. у S. habrochaites до 6167 п.н. у S. peruvianum) и характеризовались вариабельностью 10.91% (688 SNPs). Тем не менее, все они содержали по 8 экзонов и кодировали белки одинакового размера (241 а.о.). Было показано, что, как и все известные MADS-ТФ MIKC-типа, идентифицированные гомологи TM5 содержат консервативные домены MADS и K, соединяющую их I-область и вариабельный С-конец. В сравнении с TM5 S. lycopersicum гомологи TM5 дикорастущих видов имеют шесть замещений а.о. – K9M, E68G, R172G, Q178R, T196A и V225A, первые пять из которых были найдены у зеленоплодных видов, а последнее – у красноплодных S. lycopersicum и S. pimpinellifolium. Согласно PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php), три замещения (K9M, E68G и R172G) являются радикальными, все они характерны для зеленоплодных видов и расположены в домене MADS и в конце К-домена и могут влиять на пространственную структуру и способность белков димеризоваться и взаимодействовать с регуляторными последовательностями ДНК.

Для определения филогении SEP-гомологов томата были использованы последовательности SEP-белков модельного вида A. thaliana (клада Superrosids), видов Superasterids (Пасленовые и Астровые), а также SEP-предшественников из AP3- и AGL6-подсемейств в качестве внешней группы. На дендрограмме (рис. 1) SEP-подсемейство делится на два основных кластера с общим предшественником: (1) наиболее древний SEP1/2/3, где SEP3-кластер включает анализируемые гомологи TM5; (2) SEP4/JOINTLESS-2 (J2), состоящего из двух субкластеров J2 и SEP4, где последний дивергировал на субкластеры SLCMB1 и RIN.

Рис. 1.

Филогенетическая классификация и структурный анализ 51 последовательности белков, включая гомологи MADS-ТФ подсемейств SEP и AGL6 видов томата. Дендрограмма (слева) построена методом максимального правдоподобия (модель JTT;G+G;программа MEGA 6.0). Существенные значения бутстрэп указаны в основании ветвей. А (Ancestor) – общий предшественник подклад SEP. Профили консервативных мотивов в последовательностях анализируемых белков (справа от дендрограммы) определены с помощью МЕМЕ 5.1.0. Последовательность мотива m18, уникальная для TM5-белков видов томата и других Пасленовых, приведена справа от МЕМЕ-профилей. Рядом с каждым названием белка приведен номер доступа в NCBI и вид растения: Slyc – Solanum lycopersicum L.; Sper – Solanum peruvianum L.; Scor – Solanum corneliomulleri J.F.Macbr.; Spen – Solanum pennellii Correll; Schi – Solanum chilense (Dunal) Reiche; Spim – Solanum pimpinellifolium (L.) Mill.; Stub – Solanum tuberosum L.; Phyb – Petunia x hybrida hort. ex E.Vilm.; Cmor – Chrysanthemum x morifolium Ramat.; Ghyb – Gerbera hybrid cultivar; Hann – Helianthus annuus L.; Athu – Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.

MEME-анализ аминокислотных последовательностей SEP-гомологов определил консервативные мотивы, которые характерны для: (1) всех анализируемых MADS-белков MIKC-типа SEP- и AGL6-кластеров – соответствуют консервативным доменам MADS (m7, m1, m3) и K (m2, m4) и междоменной области I (m9), внешний белок АР3 содержит только m7, m1 и m2; (2) ТМ5- и SEP1/2-белков видов томата и других Пасленовых и RIN-белков видов томата (m8); (3) RIN-белков Пасленовых и AGL6 томата (m15); (4) всех SEP-белков (m5, m6); (5) SEP3-белков сложноцветных (m16; присутствует также у АР3); (6) ТМ5/SEP3-белков видов томата и других Пасленовых (m18); (7) SEP1/2-белков видов томата и других Superasterids (m17); (8) клады AGL6 (m14); (9) AstSEP3-белков и SEP1/2 A. thaliana (m19; локализован в разных частях данных двух групп белков) (рис. 1). Внутри клад встречаются некоторые различия МЕМЕ-профиля, однако все они являются либо следствием структурных расхождений изоформ одного и того же белка (например, две изоформы белка RIN), либо результатом неполной/неправильной сборки последовательности (например, отсутствует MADS-домен у белка SEP3 Petunia x hybrida) (рис. 1). МЕМЕ-профили C-конца анализируемых белков (у AGL6-группы – m14, у остальных – m5) демонстрировали высокую степень консерватизма. Сравнение вручную помогло найти в С-области дополнительные консервативные мотивы: ‘TM5/SEP3’ – NYMA(L)GWLP; ‘RIN/SLCMB1/ SEP4’ – GV(I/F)V(L/F)PGWML(V); ‘TM5/ SEP3’/‘SlAGL6/AGL6’ – EPT(I)LQIGY(Q)/ E(D)PV(F)LQIGY(F/H). Таким образом, были выявлены отличия первичной структуры TM5(SEP3)-гомологов от других представителей SEP-подсемейства и от предшественников (группа AGL6). Эти отличия сосредоточены в самой вариабельной для MIKC-белков С-области (мотив m18 в самом начале С-домена (175-182 а.о.) и два ‘TM5/SEP3’-мотива на С-конце С-домена). Они могут определять специфичность функции TM5, включая его участие в мультимерных транскрипционных комплексах.

Для изучения возможной функциональной диверсификации SEP3- и SEP4-гомологов томата были определены профили экспрессии гена TM5 в сравнении с наиболее эволюционно молодым геном RIN у красноплодного S. lycopersicum и зеленоплодных S. chmielewskii, S. peruvianum, S. neorickii, S. arcanum и S. habrochaites. Анализ, проведенный на тканях S. lycopersicum показал отсутствие транскриптов TM5 и RIN в корнях и листьях. В связи с этим для анализа экспрессии генов у дикорастущих видов были использованы ткани только цветков и плодов (две стадии развития). Было показано, что у всех исследуемых образцов оба гена экспрессируются и в цветках, и в плодах с наивысшим уровнем транскрипции у S. habrochaites и минимальным – у S. lycopersicum (рис. 2б, в). При этом в сравнении с RIN уровень экспрессии TM5 в цветках выше, а в плодах ниже (рис. 2в). Сопоставление с данными по красноплодному виду показало, что в цветке зеленоплодных видов уровень экспрессии TM5 существенно (более чем в 2 раза) ниже, а в незрелых плодах – выше. В зрелом плоде уровень экспрессии TM5 снижался по отношению к незрелому (рис. 2а). Исключение составили зрелые плоды S. habrochaites и S. neorickii, что можно объяснить трудностью определения стадии зрелости у зеленоплодных видов: не по окраске, а по размеру и степени мягкости.

Рис. 2.

Профиль относительной экспрессии гомологов генов TM5 и RIN, а также значения TM5 vs. RIN в тканях корня (R), листа (L), цветка (Fl), незрелого плода (F1) и зрелого плода (F2) S. lycopersicum (S. lyc), S. chmielewskii (S. chm), S. peruvianum (S. per), S. neorickii (S. neo), S. arcanum (S. arc) и S. habrochaites (S. hab). Звездочками обозначены статистически значимые различия в уровне экспрессии генов между красноплодным S. lycopersicum и зеленоплодными видами (р < 0.0001). Дополнительные цифры над звездочками означают меньшую достоверность значимости различий: 1 (р < 0.05); 2 (р < 0.01); 3 (р < 0.001). Значения ‘TM5 vs. RIN’определяли как разницу между средними значениями относительной экспрессии TM5 и RIN.

Секция Lycopersicon рода Solanum является моделью для изучения регуляторных генов репродуктивного развития, так как виды, которые она объединяет (S. lycopersicum и 12 его дикорастущих сородичей), различаются по морфофизиологии и биохимии зрелых плодов. Более древние виды формируют зеленые плоды, которые накапливают сахарозу и хлорофиллы, тогда как более молодые виды имеют желтые/оранжевые/красные плоды, которые накапливают глюкозу, фруктозу и каротиноиды [6].

В данной работе у видов секции были идентифицированы гомологи гена TM5 (табл. 1), которые, согласно полученной дендрограмме (рис. 1), произошли в результате дупликации и диверсификации общего с генами RIN/SLCMB1 предшественника. Учитывая общность происхождения, плейотропные функции TM5 (гомолог SEP3) и RIN/SLCMB1 (гомологи SEP4) должны быть похожи. Известно, что гомологи ТФ SEP3 являются ключевыми участниками спецификации цветковых органов трех внутренних кругов, а также терминации развития цветка [10]. Действительно, отсутствие транскрипции TM5 приводит к увеличению размеров цветковой меристемы томата с нарушением идентичности и количества лепестков, тычинок и плодолистиков [11, 12]. Этому соответствует и наблюдаемая нами обратная корреляция между уровнем экспрессии TM5 и размером цветка исследуемых видов: экспрессия гена в цветках зеленоплодных видов ниже, чем у S. lycopersicum (рис. 2а), цветок которого меньше в сравнении с цветками дикорастущих видов томата [13]. Фактор транскрипции SEP4 участвует в определении идентичности цветковой меристемы и всех органов цветка [6]. А его гомологи RIN и SLCMB1 осуществляют контроль биосинтеза этилена и каротиноидов в процессе созревания и смены окраски плода S. lycopersicum [14]. Все три ТФ–TM5, RIN и SLCMB1, способны взаимодействовать с одним и тем же базовым набором белковых партнеров, однако TM5, в отличие от RIN/SLCMB1, не взаимодействует с MADS-ТФ клад AP1/FUL и SEP [10].

Это снижает вероятность участия TM5 в процессе созревания плода. Тем не менее, в плоде (и зреющем, и спелом) зарегистрирована значительная экспрессия гена TM5 (рис. 2а), и это можно объяснить тем, что TM5 является одной из мишеней ТФ RIN [15]. Данный факт допускает возможность совместного, взаимодополняющего участия всех трех генов в регуляции разных аспектов развития плода – от инициации плодолистиков/завязи до стадии биологической спелости плода. Более того, отметим, что уровень экспрессии TM5 и RIN в незрелых плодах у зеленоплодных видов выше по сравнению с красноплодным S. lycopersicum (рис. 2). Это позволяет предположить, что вариабельность структуры и экспрессии гомологов генов TM5, RIN и SLCMB1 в совокупности может быть связана с прогрессирующими эволюционными изменениями характеристик сочного плода у видов томата.

Таким образом, в данной работе были идентифицированы гомологи гена TM5 видов томата – древних зеленоплодных и эволюционно более молодых красноплодных, и охарактеризована их диверсификация с другими генами подсемейства SEP. Полученные данные свидетельствуют о консервативности структуры и функций TM5 по отношению к известным гомологам SEP3. В дополнение к этому предполагается участие TM5 в регуляции развития и созревания плода совместно с RIN и SLCMB1, а также наличие ко-эволюции гена TM5 с размерами цветка и генов TM5, RIN и SLCMB1 с морфофизиологическими и биохимическими признаками плода видов томата.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 19-76-00006)и, частично, Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Дьяченко Е.А., Щенникова А.В., Кочие-ва Е.З.), с использованием экспериментальной установки искусственного климата (Институт биоинженерии ФИЦ Биотехнологии РАН).